第三章：愈傷組織培養(yǎng)課件

第三章：愈傷組織培養(yǎng)

(callusculture)第三章：愈傷組織培養(yǎng)

(callusculture)主要內(nèi)容:基本概念植物材料（外植體）的制備愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)方式主要內(nèi)容:基本概念一、基本概念脫分化(redifferentiation)：

具有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，細(xì)胞改變原來的分化狀態(tài)，失去原有的結(jié)構(gòu)與功能，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ募?xì)胞的過程。植物離體培養(yǎng)中的脫分化過程植物離體培養(yǎng)利用特定的條件，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，使原已分化并具有一定功能的細(xì)胞脫離原軌道，失去其原有狀態(tài)和功能，而恢復(fù)到未分化的愈傷組織狀態(tài)。一、基本概念脫分化(redifferentiation)：植物組織細(xì)胞的脫分化能力植物組織細(xì)胞的脫分化能力菠蘿的脫分化愈傷組織葉基在脫分化葉基菠蘿的脫分化愈葉基在脫分化葉愈傷組織(Callus)：植物各種器官的外植體在離體的條件下，細(xì)胞經(jīng)脫分化等一系列過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變形成一種能夠迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán)

一般低，植物各器官、組織都有被誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性。

第三章：愈傷組織培養(yǎng)課件再分化(redifferentiation)將處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織移植到合適的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),愈傷組織就會重新進(jìn)行分化,并形成具有根、莖、葉的完整植株。這個過程就叫做植物細(xì)胞的再分化。

再分化(redifferentiation)愈傷組織培養(yǎng)(callusculture):是指將母體植株上的各個部分切下，形成外植體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。一般情況下，植物組織均能誘發(fā)形成愈傷組織，由外植體形成愈傷組織，標(biāo)志著植物離體培養(yǎng)的開始。愈傷組織培養(yǎng)(callusculture):自然條件下的植物愈傷組織自然條件下的植物愈傷組織二植物材料（外植體）的制備1.一般植物組織都能誘發(fā)愈傷組織。誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。雙子葉植物為最多，單子葉植物(1990’s)，此外，裸子植物、蕨類和蘚類植物也有誘發(fā)成功的例子。:二植物材料（外植體）的制備:所有的多細(xì)胞植物都有誘發(fā)愈傷組織成功的潛在可能性。雙子葉植物能夠迅速地長出愈傷組織。單子葉1990’S重大進(jìn)展。植物的各種組織，如維管束形成層、貯藏器官的薄壁組織、根的中柱鞘、胚乳、子葉、葉片的葉肉、維管束組織等，在合適的條件下，都能形成愈傷組織。所有的多細(xì)胞植物都有誘發(fā)愈傷組織成功的潛在可能性。2.材料必須完全無菌微生物一旦與培養(yǎng)基接觸，就迅速繁殖，抑制愈傷組織的生長。用抗菌素來抑制微生物的生長，在短時間有效，而且抗菌素只能對一定譜系中的細(xì)菌才產(chǎn)生作用，該譜系以外的微生物仍然可以大量繁殖?？咕剡€可能抑制植物組織的生長。2.材料必須完全無菌得到無菌材料，植物組織必須先進(jìn)行消毒。有好幾種化學(xué)試劑都能起到表面消毒的作用，試劑的選擇及處理時間的長短要根據(jù)材料對試劑的敏感性來決定。得到無菌材料，植物組織必須先進(jìn)行消毒。一般都采用在消毒后能很容易去除的藥劑。因?yàn)橄緞χ参锛?xì)胞也有殺傷作用，若不去除就會妨礙愈傷組織的發(fā)生。例如用無菌水反復(fù)沖洗后可以把大部分藥劑都洗掉，或者能自動分解變成低毒性物質(zhì)。一般都采用在消毒后能很容易去除的藥劑。本氯酸鈉能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。低濃度的氯化汞是一種令人滿意的消毒劑，只是難以去除，故在消毒后必須用大量清水沖洗材料。在材料放入消毒劑之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄濕，從而使消毒劑易于滲入并殺死微生物。本氯酸鈉能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。3.外植體的大小和形態(tài)消毒后的植物材料，即可進(jìn)行培養(yǎng)。從外表均一的外植體長出的愈傷組織，在開始階段是相當(dāng)一致的，而從莖、根等器官切段上長出的則是一個混雜的愈傷組織。有些外植體外表上看來是由同一類細(xì)胞組成，例如煙草的髓、胡蘿卜的次生韌皮部、菊芋的塊莖等，這些細(xì)胞中DNA的含量有很大差別。這種差別可能是由于細(xì)胞核中染色體數(shù)目的差別，即倍性不同所造成的。3.外植體的大小和形態(tài)得到形態(tài)一致的愈傷組織的培養(yǎng)策略從切段中取出某一種組織進(jìn)行培養(yǎng)。改變培養(yǎng)基的組成，只促進(jìn)某一類細(xì)胞分裂而抑制其他細(xì)胞分裂的辦法來建立這一類細(xì)胞的愈傷組織。往往培養(yǎng)基略加改變就能改變愈傷組織的整個性質(zhì)。得到形態(tài)一致的愈傷組織的培養(yǎng)策略接種的外植體的大小和形狀并不需要嚴(yán)格限制不能太小，小于肉眼能見的限度時，細(xì)胞分裂可能難以發(fā)生。故一般要求切塊的大小要適當(dāng)。外植體的細(xì)胞數(shù)目多，獲得愈傷組織的機(jī)會也多。接種的外植體的大小和形狀并不需要嚴(yán)格限制如果目的僅在于得到愈傷組織，那末將莖的切段、葉、根、花、果實(shí)或種子，或其中的某種組織切成一片片或一塊塊放到培養(yǎng)基上就可以了。如果目的僅在于得到愈傷組織，那末將莖的切段、葉、根、花、果實(shí)如果要定量地研究愈傷組織的發(fā)生，那末外植體的大小必須一致，形狀和組成也要基本相同。進(jìn)行這類研究常選用組織塊較大的材料，例如胡蘿卜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖、菊芋、荷蘭防風(fēng)草等。這樣才能得到足夠數(shù)量的、無菌的、一致的、適合于培養(yǎng)的外植體。如果要定量地研究愈傷組織的發(fā)生，那末外植體的大小必須一致，形三、愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一）愈傷組織誘導(dǎo)的操作程序

獲取外植體材料→消毒處理→修整除去壞死組織→切成5mm的圓柱形或方形小塊→直放或倒放到培養(yǎng)基上→每9cm培養(yǎng)基接種5－6塊外植體→培養(yǎng)。

選用較大組織做材料時，可用打孔器從塊莖和塊根中鉆取一批圓柱型組織，切成相同厚度的小圓片進(jìn)行培養(yǎng)。

三、愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一）愈傷組織誘導(dǎo)的操作程序圓柱形大量地、準(zhǔn)確地得到外形相同的外植體。圓柱體的表面積大，利于組織塊和外界氣體和營養(yǎng)物的交換。外植體的損傷表面分泌物，具有促進(jìn)愈傷組織形成的能力，因此表面積越大，產(chǎn)生分泌物數(shù)量也越多，愈傷組織的得率也越高。外植體的體積應(yīng)盡可能小，從而得到較大數(shù)量的外植體。外植體最小的限度由其親本組織細(xì)胞的平均大小來決定。細(xì)胞數(shù)目。采用圓形的原因：圓柱形大量地、準(zhǔn)確地得到外形相同的外植體。采用圓形的原因：例如菊芋的細(xì)胞比胡蘿卜根次生韌皮部的細(xì)胞大三倍，一個3.8毫克的胡蘿卜外植體大約包含25，000個細(xì)胞，這樣一個外植體是能夠成活的。而同樣重量的菊芋外植體，由于細(xì)胞大而數(shù)目少，在分離過程中造成損傷往往難以成活。必須重量達(dá)到8毫克才包含約20，000個細(xì)胞，使之易于成活。例如菊芋的細(xì)胞比胡蘿卜根次生韌皮部的細(xì)胞大三倍，一個3.8毫二）、愈傷組織的誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。1、常用激素與濃度激素類型激素濃度生長素類（2，4-D,IAA,NAA)0.01~10mg/L細(xì)胞分裂素類（玉米素，6-BA)0.1~10mg/L二）、愈傷組織的誘導(dǎo)激素類型激素濃度生長素類三）、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：1）、激素：多數(shù)情況下，單獨(dú)使用2，4-D可以成功誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生案例1：MS培養(yǎng)基含有不同濃度2，4-D時斑茅幼葉形成愈傷組織的誘導(dǎo)率（%）

不同濃度的2，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)率是不同的。一般情況下，2，4-D的濃度過低（低于10-9mg/L）時，愈傷組織生長緩慢；濃度過高（高于10mg/L）時，就會抑制愈傷組織的生長。三）、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：1）、激素：案例2.不同培養(yǎng)基及激素濃度對誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的影響

無論在MS還是在H或B5培養(yǎng)基中，不附加激素2,4-D均不能誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的形成，扁桃花藥在H+1.0mg/L2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高為47%;在MS+1.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率為67.0%;在B5+0.5～1.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D為0.5mg/L時，出愈率高達(dá)100%.。說明在扁桃花藥誘導(dǎo)過程中，最適基本培養(yǎng)基是B5，最佳2,4-D濃度為0.5mg/L。案例2.不同培養(yǎng)基及激素濃度對誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的影響研究表明：生長素與細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是二者搭配使用時更能強(qiáng)烈刺激愈傷組織的形成。在愈傷組織的誘導(dǎo)時，植物材料不同所用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同，使用的濃度也不同。研究表明：生長素與細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的2）.培養(yǎng)基不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響

2）.培養(yǎng)基不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。這樣簡單的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添加各種各樣的附加物（完全培養(yǎng)基），如維生素、氨基酸、糖醇，生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、螯合劑如EDTA、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子汁等。培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必須強(qiáng)調(diào)：適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基也不一定適合于固體培養(yǎng)。注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如早期，

采用無機(jī)鹽濃度低的培養(yǎng)基，化學(xué)工業(yè)不夠發(fā)達(dá)，化學(xué)試劑中雜質(zhì)含量較高。用高濃度無機(jī)鹽帶入更大量的雜質(zhì)，往往會抑制愈傷組織的生長。近代，MS培養(yǎng)基或類似MS培養(yǎng)基的高濃度的培養(yǎng)基。高濃度無機(jī)鹽既有利于保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，愈傷組織生長快，又因離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過程中，若某種成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。早期，采用無機(jī)鹽濃度低的培養(yǎng)基，化學(xué)工業(yè)不夠發(fā)達(dá)，化學(xué)試培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中才用硝態(tài)和銨態(tài)的混合物。K的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸提高的趨勢。有趣的是，各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能使相同的組織快速生長。例如Hildebrandt培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基顯著不同，但二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響

不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響二)愈傷組織的形成愈傷組織從增殖的組織細(xì)胞中產(chǎn)生，激素改變細(xì)胞的新陳代謝狀態(tài)，從生長靜止期到代謝旺盛。二)愈傷組織的形成愈傷組織從增殖的組織細(xì)胞中產(chǎn)二)愈傷組織的形成三個時期愈傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的平均大小都有明顯的差別。從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：愈傷組織分化誘導(dǎo)期分裂期分化期二)愈傷組織的形成三個時期愈傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的誘導(dǎo)期（Induction,起動期、或起始期）:

起動期：

細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時期，愈傷組織形成起點(diǎn)。

外植體細(xì)胞在完整植株中隨著細(xì)胞的分化過程而逐漸停止分裂，開始執(zhí)行它們各自不同的功能。外植體細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，稱為靜止細(xì)胞。

在外源植物激素的作用下，處于靜止?fàn)顟B(tài)的植物細(xì)胞經(jīng)過復(fù)雜的脫分化過程恢復(fù)分裂能力轉(zhuǎn)化為分生細(xì)胞。此過程有人稱之為：細(xì)胞的誘導(dǎo)活化過程。

有人認(rèn)為損傷是誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的重要因素。受傷細(xì)胞釋放出的物質(zhì)與外源激素共同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分裂，是誘導(dǎo)植物愈傷組織形成的主要原因。Brown（1972）認(rèn)為靜止細(xì)胞是具有分裂能力的，只是被存在的一類抑制物質(zhì)所阻止，而使其分裂能力不能表現(xiàn)，如果除去抑制物質(zhì)，就可恢復(fù)分裂能力。若加入抵消抑制物質(zhì)影響的外源物質(zhì)（激素），細(xì)胞就立即進(jìn)行DNA復(fù)制，全部細(xì)胞進(jìn)入S期，并發(fā)生同步分裂。誘導(dǎo)期（Induction,起動期、或起始期）:

特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)胞的大小仍然和外植體時一樣，沒有多大改變。

處于起始期外植體特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)誘導(dǎo)期的長短由一系列內(nèi)部（植物的種類、生理狀況）和外部（光照、外源激素）因素決定。

例如：菊芋的誘導(dǎo)期有時還不需要1天，胡蘿卜則要好幾天，而菊芋塊莖貯藏時間的改變，誘導(dǎo)期也發(fā)生改變。從11月到次年4月取菊芋塊莖進(jìn)行培養(yǎng)，則誘導(dǎo)期從22小時逐漸延長到40小時。誘導(dǎo)期的長短由一系列內(nèi)部（植物的種類、生理狀況）和外部（光照故可以從內(nèi)外因兩方面著手，改變誘導(dǎo)期長短主要外因方面是添加一些生長物質(zhì)Steward等(1964)用2,4-D及其類似的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理處于靜止?fàn)顟B(tài)的組織，看到RNA的含量很快明顯地增加。并且2、4-D積累在分裂細(xì)胞的核仁中。Yeoman和Mitchell(1970)指出了核仁是生長物質(zhì)的作用部位。故可以從內(nèi)外因兩方面著手，改變誘導(dǎo)期長短分裂期Celldivision)：Activecelldivision,cellsreverttoameristematic(分生組織的)dedifferentiatedstate.分裂期Celldivision)：Activecell外植體(explant)中已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，外植體外層細(xì)胞出現(xiàn)了分裂，由于外層細(xì)胞的迅速分裂使得這些細(xì)胞的體積縮小，逐漸回復(fù)到分生組織狀態(tài)，該時期細(xì)胞通過脫分化的起動期而進(jìn)入分裂，并開始形成愈傷組織。外植體(explant)中已分化的活細(xì)胞在分裂期特征：生理生化上分裂期的一個明顯特征是外層細(xì)胞進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變?。患?xì)胞核和核仁增到最大，RNA含量達(dá)到最高等。此時期的愈傷組織：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。分裂期特征：生理生化上分裂期的一個明顯分裂期愈傷組織分裂期愈傷組織1mg/l2,4-D10mg/l2,4-D1mg/l2,4-D10mg/l2,4-D1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。2.每個細(xì)胞平均鮮重下降。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。4．細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.細(xì)胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變。6.隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn):1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn):植物分裂期脫分化規(guī)律：

胡蘿卜等脫分化較禾谷類容易莖葉較花器脫分化幼嫩莖組織比老組織較容易植物分裂期脫分化規(guī)律：分化期（Differentiation）：Appearanceofcellular

differentiationandtheexpressionof

secondarymetabolicpathways.分化期（Differentiation）：Appearanc分化期：細(xì)胞分裂從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)部的組織細(xì)胞，愈傷組織表層細(xì)胞分裂減緩或停止，內(nèi)部深層細(xì)胞分裂并形成像維管束或類似于分生組織組成的鳥巢狀結(jié)構(gòu)的次生組織。此時期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小趨于穩(wěn)定。分化期：細(xì)胞分裂從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)部的組織分化期愈傷組織的特點(diǎn)：生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；而老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。分化期愈傷組織的特點(diǎn)：生長旺盛的愈傷組織一般呈A細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：B形成瘤狀或片狀的分生組織結(jié)節(jié)?；蚓S管組織結(jié)節(jié)。C細(xì)胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。D出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。E生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。分化期細(xì)胞特點(diǎn)：A細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：分化期細(xì)胞特點(diǎn)：提醒：根據(jù)形態(tài)變化列出三個時期，實(shí)際上它們的界限并不分嚴(yán)格，特別是分裂期和分化期。一塊培養(yǎng)組織的細(xì)胞既有分裂的又有分化的。提醒：根據(jù)形態(tài)變化列出三個時期，實(shí)際上它們的愈傷組織類型Callustypes

Callusmaybeheavilylignified（木質(zhì)化）andhardintexture,

whereasothersbreakeasilyintosmallfragments

(friable).DifferenttypesofGloriosa(火炎花)callus:

FriableHard/lignifiedcallus

Rhizogeniccallus

Callusexudingstickypoly-saccharides

愈傷組織類型CallustypesCallusmay愈傷組織的類型：不同植物來源的愈傷組織，在質(zhì)地、形態(tài)和物理性狀方面均有明顯的差異。有的愈傷組織呈淡黃色或白色，有的愈傷組織呈綠色或紅色。

一般來說，來源于相同組織的愈傷組織含有的色素大致相同，但經(jīng)過反復(fù)繼代培養(yǎng)后會失去色素。愈傷組織的類型：不同植物來源的愈傷組織，在質(zhì)根尖愈傷組織

（無色透明）莖尖愈傷組織（淡綠色）植物愈傷組織類型舉例：根尖愈傷組織（無色透明）莖尖愈傷組織（淡綠色）植物愈傷組當(dāng)歸莖段愈傷組織（綠色）

香茶菜愈傷組織

鎖陽愈傷組織（紅色）當(dāng)歸莖段愈傷組織（綠色）香茶菜愈傷組織鎖陽愈傷組織（紅愈傷組織類型及特征

1.結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽

2.結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立

3胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。

愈傷組織類型及特征

愈傷組織的基本解剖學(xué)：基本解剖學(xué)特征明顯差異。菜豆，凡是脆的都有大量的分生組織中心或瘤狀結(jié)構(gòu)，它們被大而未分化的細(xì)胞所分開；而不脆的類型很少分化，而且大部分是高度液泡化細(xì)胞。單冠毛菊，脆的愈傷組織由松散排列的細(xì)胞組成，堅(jiān)實(shí)的愈傷組織是由堆得很緊的細(xì)胞所組成。愈傷組織的基本解剖學(xué)：愈傷組織的化學(xué)成分：蠶豆，不脆的愈傷組織有大量的組成細(xì)胞壁的多糖，以單位干重計(jì)，細(xì)胞壁的部分也多；但與果膠物質(zhì)及半纖維素相比，纖維素的百分率是低的。無疑，大量的纖維素增加了細(xì)胞的硬度，而果膠含量的增加，保證了細(xì)胞緊緊地粘在一起而不易斷碎。愈傷組織的化學(xué)成分：Callusmayhaveayellow,white,greenorred(anthocyanin花青苷)appearance.Callusmayhaveayellow,影響植物愈傷組織形成的因素：1、同一植株不同器官形成愈傷組織的能力不同。例如：君子蘭用MS+2mg/L6-BA+2mg/LNAA+1mg/L2,4-D固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，莖尖、莖切塊和葉片形成愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為85%、13%和72%；若用MS+5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1mg/L2,4-D固體培養(yǎng)基培養(yǎng),三種外植體形成愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為82%、9%和70%。這說明培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)組成的比例不同，直接影響著愈傷組織的形成。楊寧[1]等人的研究表明，植物扁桃（‘Naporeil’品種）的莖段、花藥在適宜的培養(yǎng)基上能比較容易的誘導(dǎo)出愈傷組織，而葉肉組織則不能或難以誘導(dǎo)形成愈傷組織。影響植物愈傷組織形成的因素：1、同一植株不同器官形影響植物愈傷組織形成的因素：2、選擇適宜基本培養(yǎng)基不僅影響愈傷組織的誘導(dǎo)，而且影響傷組織的生長。

于樹宏和李玲（1999）用淺綠色野葛葉片愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，用MS+1mg/LNAA，愈傷組織呈淺綠色，新鮮健壯；在培養(yǎng)基中同時加入3mg/L6-BA和1mg/LNAA,愈傷組織生長迅速，若培養(yǎng)時間較長，形成的愈傷組織呈白、硬顆粒狀，部分會發(fā)生褐變死亡；但若將愈傷組織置于含相同濃度6-BA和NAA的B5培養(yǎng)基上生長，愈傷組織可以始終保持新鮮健壯的外觀，而且不斷生長。楊寧[2]等人用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)繼進(jìn)行當(dāng)歸愈傷組織增殖培養(yǎng)的研究表明，單獨(dú)使用一種生長素時，愈傷組織增殖很不明顯；若只使用一種細(xì)胞分裂素時，愈傷組織均不見增殖，并且生長狀況也不佳；但將二者合理搭配使用時，愈傷組織不僅增殖較明顯，而且生長狀況較佳。可見，兼用生長素和6-BA增效作用較明顯影響植物愈傷組織形成的因素：2、選擇適宜基本培養(yǎng)基不僅影響愈基本培養(yǎng)基對當(dāng)歸愈傷組織繼代的影響*

注：“+”表示基本可以生長;“++”表示生長較好,繼代較好；“+++”表示繼代最好.*表中數(shù)據(jù)取材于楊寧等人的《當(dāng)歸愈傷組織的增殖與分化培養(yǎng)》

基本培養(yǎng)基對當(dāng)歸愈傷組織繼代的影響*注：“+”表示基本不同激素組合對當(dāng)歸愈傷組織增殖的影響*注：“+”表示基本可以生長;“++”表示生長較好,繼代較好；“+++”表示繼代最好.*表中數(shù)據(jù)取材于楊寧等人的《當(dāng)歸愈傷組織的增殖與分化培養(yǎng)》

不同激素組合對當(dāng)歸愈傷組織增殖的影響*注：“+”表示基本三、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生

愈傷組織培養(yǎng)物在某些條件下，可以再分化產(chǎn)生不定芽或根的分生組織甚至是胚狀體，繼之，由這些有結(jié)構(gòu)的組織而發(fā)育成苗或完整小植株。愈傷組織通過再分化形成再生植株的方式主要有三種：1)、先產(chǎn)生芽，后在莖的基部長根；2)先長根，再長芽；3)愈傷組織的不同部位分別形成根和芽。三、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物在某些概念：極性—植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象，指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。細(xì)胞無性系—植物離體培養(yǎng)中，任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株，即稱細(xì)胞無性系。概念：

一）、器官的形成

一般愈傷組織開始分化時，由大小不等的細(xì)胞開始逐漸形成大小均勻的細(xì)胞，保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。

在分化時，愈傷組織的表層和內(nèi)部都可形成分生中心。芽多發(fā)生在愈傷組織的表層，屬外起源。

根發(fā)生在組織的深處，與整體植株發(fā)生類似，是內(nèi)起源。

愈傷組織的外部形態(tài)也隨分化而改變，一般由疏松轉(zhuǎn)向緊密。

一）、器官的形成

一般愈傷組織開始分化植物愈傷組織離體培養(yǎng)中，脫分化形成無極性或無明顯形態(tài)的愈傷組織塊。當(dāng)條件適合時，愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生芽或根的分生組織，甚至體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育成苗或完整植株。

愈傷組織的形態(tài)發(fā)生有以下兩種情況：1、不定芽和根的發(fā)生（器官發(fā)生）是愈傷組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。植物愈傷組織離體培養(yǎng)中，脫分化形成無極性或無明顯形態(tài)的1）愈傷組織通過不定芽和根形成器官的階段①外植體脫分化-愈傷組織是細(xì)胞分裂的結(jié)果。②愈傷組織-瘤狀結(jié)構(gòu)是細(xì)胞分化、分化組織出現(xiàn)和有限細(xì)胞分裂的結(jié)果。③

、瘤狀結(jié)構(gòu)-器官原基是分生細(xì)胞團(tuán)分化的結(jié)果。1）愈傷組織通過不定芽和根形成器官的階段葉片愈傷組織的形成葉片愈傷組織的形成二）愈傷組織的器官發(fā)生順序1、無芽的根或無根的芽愈傷組織僅有芽或根器官的分別形成，不能形成完整植株。2、先芽后根愈傷組織先形成芽，芽生長后，其基部發(fā)出根，進(jìn)而形成小植株，是大多數(shù)植物的器官發(fā)生方式。如蘋果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麥、水稻二）愈傷組織的器官發(fā)生順序3、先根后芽先形成根，再從根的基部分化出芽形成小植株，雙子葉植物中普遍。如顛茄、枸杞、苜蓿4、分別形成芽和根愈傷組織鄰近不同部位分別形成芽和根，兩者結(jié)合起來形成一株小植株，類似根芽的天然嫁接，但必須根與芽的維管束相同，才能得到成活植株。如胡蘿卜、石刁柏3、先根后芽三、體細(xì)胞胚的發(fā)生

愈傷組織體細(xì)胞胚植株三、體細(xì)胞胚的發(fā)生

魔芋體細(xì)胞胚魔芋體細(xì)胞胚胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)胚狀體作為植物組培形態(tài)發(fā)生常見的重要方式，與不定芽方式比較，具有自身的優(yōu)點(diǎn)：1、胚狀體的數(shù)量比不定芽多2、胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和貯藏3、胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。

胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)器官分化的植物激素控制理論大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。即：生長素與細(xì)胞分裂素的比例小時則產(chǎn)生苗，比例大時則生根，而兩種激素的比例適中時，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。器官分化的植物激素控制理論大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：植物物種和品種基因型影響愈傷組織的分化程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基因型大豆品種的下胚軸作外植體進(jìn)行組培時，培養(yǎng)基對愈傷組織的影響不明顯；細(xì)胞分裂素（KT）和NAA的配比濃度對其愈傷組織的分化影響顯著；不同基因型大豆植株再生作用差異明顯；外植體取材時間和取材部位對再生植株的形成也具有較大的影響，再生能力最強(qiáng)的取材部位時從子葉節(jié)到下胚軸6mm區(qū)段,當(dāng)下胚軸長到2~3cm時取材最佳（見表3-6）植物物種和品種基因型影響愈傷組織的分化程林梅等（200不同基因型、激素濃度對大豆植株再生的影響*資料來源:基因型和激素濃度對大豆植株再生的影響.程林梅等，《植物學(xué)通報》2001.18(3):367-370.不同基因型、激素濃度對大豆植株再生的影響*資料來源:基因型和第三章：愈傷組織培養(yǎng)課件木本植物愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控

第一步：利用分化培養(yǎng)基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈傷組織形成不定芽，增加繁殖系數(shù)。(N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲)

第二步：當(dāng)不定芽長大出現(xiàn)葉片后，再將伸長的苗從基部切下轉(zhuǎn)入含生長素類（如IAA、NAA）的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)根的生成。木本植物愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控第一步：利用分蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控1、先用MS培養(yǎng)附加不同濃度的6BA，促進(jìn)不定芽的生成。不同濃度6-BA對庫拉索蘆薈增殖的影響蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控1、先用MS培養(yǎng)附加不同濃度蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控2、然后將抽枝的小植株轉(zhuǎn)移到MS附加不同濃度NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)根的發(fā)生與生長。不同濃度NAA對庫拉索蘆薈生根的影響蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控2、然后將抽枝的小植株轉(zhuǎn)移到M影響愈傷組織分化的其他因素1）、生長素對維管組織分化過程有顯著影響.法國植物學(xué)家Camus（1949）最早將小營養(yǎng)芽嫁接在一種菊苣屬植物根的愈傷組織（由薄壁細(xì)胞構(gòu)成）表面，營養(yǎng)芽經(jīng)培養(yǎng)一段時間后分化出維管組織。Wetmore等許多人的研究也證實(shí)芽之所以能誘導(dǎo)愈傷組織分化是因?yàn)樗谏L時合成了某些植物激素。一般說來生長素濃度和木質(zhì)部發(fā)生之間存在著一種反比關(guān)系，低濃度的生長素能刺激木質(zhì)部的發(fā)生。生長素對維管組織分化所起的作用在很大程度上取決于糖的存在。在洋丁香愈傷組織培養(yǎng)時，如果灌注到愈傷組織頂面缺口里的瓊脂含有0.05mg/L的IAA和1%的蔗糖，愈傷組織只能形成很少的木質(zhì)部分子。若保持生長素濃度不變，而將蔗糖水平增加到2%，則有利于木質(zhì)部的分化，但韌皮部很少。當(dāng)蔗糖增至2.5%~3.5%時，木質(zhì)部與韌皮部都可以分化形成，而當(dāng)蔗糖增至4%時，只有韌皮部的分化。影響愈傷組織分化的其他因素1）、生長素對維管組織分化過程有顯影響愈傷組織分化的其他因素2）細(xì)胞分裂素能刺激大豆子葉愈傷組織木質(zhì)部的分化。3）IAA與激動素之間能協(xié)同影響煙草愈傷組織木質(zhì)部的分化形成。生長素與赤霉素對植物愈傷組織的分化形成也存在著協(xié)同作用。乙烯也參與木質(zhì)部的形成，有人研究發(fā)現(xiàn)缺乏乙烯的番茄突變體植株木質(zhì)部內(nèi)沒有導(dǎo)管，但正常植株是具有導(dǎo)管的。4）硝酸銀能抑制大豆愈傷組織木質(zhì)部的分化，加入蛋氨酸可以克服硝酸銀的抑制作用。影響愈傷組織分化的其他因素2）細(xì)胞分裂素能刺激大豆子葉二、愈傷的培養(yǎng)方式：培養(yǎng)分為固體和液體培養(yǎng)兩大類。液體培養(yǎng)又分靜止和振蕩培養(yǎng)的二類。二、愈傷的培養(yǎng)方式：1、靜止液體培養(yǎng)

是由Heller和Gautheret(1940)在礦質(zhì)營養(yǎng)工作的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。方法簡便。優(yōu)點(diǎn)：是培養(yǎng)基中不出現(xiàn)營養(yǎng)物濃度差異的現(xiàn)象，可以用來進(jìn)行許多營養(yǎng)方面的研究工作。1、靜止液體培養(yǎng)操做方法：試管中先放入液體培養(yǎng)基，然后放入濾紙，濾紙制成橋狀的支持物，使它正巧貼在液面上，最后把組織放在濾紙上。濾紙象燈芯一樣不斷給組織提供水分和營養(yǎng)。這種靜止培養(yǎng)目前已經(jīng)很少有人應(yīng)用了。操做方法：2、振蕩液體培養(yǎng)外植體在液體培養(yǎng)基中不斷轉(zhuǎn)動，消除靜止培養(yǎng)的缺點(diǎn)。振蕩培養(yǎng)又分二類。(1)連續(xù)浸沒的。(2)定期浸沒的。(1)連續(xù)浸沒攪動培養(yǎng)液或振動培養(yǎng)液使組織懸浮于培養(yǎng)基中。一般容器中培養(yǎng)液的體積要少些，以確保最大的氣相表面，造成較好的通氣條件。一般培養(yǎng)液的體積約占容器體積的20％。2、振蕩液體培養(yǎng)小量培養(yǎng)采用磁力攪拌器比較方便，一般選用250轉(zhuǎn)／分的轉(zhuǎn)速。在一個150毫升的三角瓶中放16毫升培養(yǎng)基，在這里組織可生長約10天。大量培養(yǎng)采用搖床，往復(fù)式搖床和旋轉(zhuǎn)式搖床都可用，但以用后者為多。振動速度一般是50-100轉(zhuǎn)／分。小量培養(yǎng)采用磁力攪拌器比較方便，一般選用250轉(zhuǎn)／分的轉(zhuǎn)速。(2)定期浸沒的組織塊時而在液體中時而在氣體里，這樣既可保證培養(yǎng)基的充分混和，又保證了組織塊呼吸所需的氣體交換。這種培養(yǎng)法需要有一個轉(zhuǎn)床。用這種方法，Steward等(1964)第一次成功地將胡蘿卜單細(xì)胞再生成完整植株，證明了植物細(xì)胞的全能性。(2)定期浸沒的3、繼代培養(yǎng)（傳代）：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于養(yǎng)分的枯竭，水分的散失，組織代謝產(chǎn)物的積累，影響愈傷組織生長，因此必須將組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。一般在25-28℃下進(jìn)行固體培養(yǎng)時，每隔4-5周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。3、繼代培養(yǎng)（傳代）：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于組織塊較小時，繼代培養(yǎng)時可將整塊組織轉(zhuǎn)移。組織塊較大時，可先將組織分成幾小塊再接種。繼代培養(yǎng)必須及時進(jìn)行，長期不傳代常常由于代謝產(chǎn)物的累積，對組織起毒害作用，某些植物愈傷組織的褐化現(xiàn)象即往往由此引起的。褐化的愈傷組織反復(fù)地進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織恢復(fù)活力而迅速生長組織塊較小時，繼代培養(yǎng)時可將整塊組織轉(zhuǎn)移。組織塊較大時，可先愈傷組織繼代次數(shù)增加，形態(tài)發(fā)生能力逐漸喪失理論上可以無限制繼代，但形態(tài)發(fā)生是指細(xì)胞再生植株的過程愈傷組織繼代次數(shù)增加，形態(tài)發(fā)生能力逐漸喪失理論上可以無限制繼易產(chǎn)生：染色體出現(xiàn)多倍體和非整倍體遺傳上表現(xiàn)不穩(wěn)定：易產(chǎn)生：染色體出現(xiàn)多倍體和非整倍體遺傳上表現(xiàn)不穩(wěn)定：四、培養(yǎng)條件光照：愈傷組織的誘導(dǎo)需弱光或不需光，分化需光。繼代培養(yǎng)一般需光。此時光對器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)。溫度：一般采用24～28℃的恒溫條件進(jìn)行。濕度：較大，以免引起培養(yǎng)基干縮。四、培養(yǎng)條件組織分化器官分化細(xì)胞分化植株形成組織分化器官分化細(xì)胞分化植株形成第三章：愈傷組織培養(yǎng)

(callusculture)第三章：愈傷組織培養(yǎng)

(callusculture)主要內(nèi)容:基本概念植物材料（外植體）的制備愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)方式主要內(nèi)容:基本概念一、基本概念脫分化(redifferentiation)：

具有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，細(xì)胞改變原來的分化狀態(tài)，失去原有的結(jié)構(gòu)與功能，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ募?xì)胞的過程。植物離體培養(yǎng)中的脫分化過程植物離體培養(yǎng)利用特定的條件，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，使原已分化并具有一定功能的細(xì)胞脫離原軌道，失去其原有狀態(tài)和功能，而恢復(fù)到未分化的愈傷組織狀態(tài)。一、基本概念脫分化(redifferentiation)：植物組織細(xì)胞的脫分化能力植物組織細(xì)胞的脫分化能力菠蘿的脫分化愈傷組織葉基在脫分化葉基菠蘿的脫分化愈葉基在脫分化葉愈傷組織(Callus)：植物各種器官的外植體在離體的條件下，細(xì)胞經(jīng)脫分化等一系列過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變形成一種能夠迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán)

一般低，植物各器官、組織都有被誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性。

第三章：愈傷組織培養(yǎng)課件再分化(redifferentiation)將處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織移植到合適的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),愈傷組織就會重新進(jìn)行分化,并形成具有根、莖、葉的完整植株。這個過程就叫做植物細(xì)胞的再分化。

再分化(redifferentiation)愈傷組織培養(yǎng)(callusculture):是指將母體植株上的各個部分切下，形成外植體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。一般情況下，植物組織均能誘發(fā)形成愈傷組織，由外植體形成愈傷組織，標(biāo)志著植物離體培養(yǎng)的開始。愈傷組織培養(yǎng)(callusculture):自然條件下的植物愈傷組織自然條件下的植物愈傷組織二植物材料（外植體）的制備1.一般植物組織都能誘發(fā)愈傷組織。誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。雙子葉植物為最多，單子葉植物(1990’s)，此外，裸子植物、蕨類和蘚類植物也有誘發(fā)成功的例子。:二植物材料（外植體）的制備:所有的多細(xì)胞植物都有誘發(fā)愈傷組織成功的潛在可能性。雙子葉植物能夠迅速地長出愈傷組織。單子葉1990’S重大進(jìn)展。植物的各種組織，如維管束形成層、貯藏器官的薄壁組織、根的中柱鞘、胚乳、子葉、葉片的葉肉、維管束組織等，在合適的條件下，都能形成愈傷組織。所有的多細(xì)胞植物都有誘發(fā)愈傷組織成功的潛在可能性。2.材料必須完全無菌微生物一旦與培養(yǎng)基接觸，就迅速繁殖，抑制愈傷組織的生長。用抗菌素來抑制微生物的生長，在短時間有效，而且抗菌素只能對一定譜系中的細(xì)菌才產(chǎn)生作用，該譜系以外的微生物仍然可以大量繁殖。抗菌素還可能抑制植物組織的生長。2.材料必須完全無菌得到無菌材料，植物組織必須先進(jìn)行消毒。有好幾種化學(xué)試劑都能起到表面消毒的作用，試劑的選擇及處理時間的長短要根據(jù)材料對試劑的敏感性來決定。得到無菌材料，植物組織必須先進(jìn)行消毒。一般都采用在消毒后能很容易去除的藥劑。因?yàn)橄緞χ参锛?xì)胞也有殺傷作用，若不去除就會妨礙愈傷組織的發(fā)生。例如用無菌水反復(fù)沖洗后可以把大部分藥劑都洗掉，或者能自動分解變成低毒性物質(zhì)。一般都采用在消毒后能很容易去除的藥劑。本氯酸鈉能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。低濃度的氯化汞是一種令人滿意的消毒劑，只是難以去除，故在消毒后必須用大量清水沖洗材料。在材料放入消毒劑之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄濕，從而使消毒劑易于滲入并殺死微生物。本氯酸鈉能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。3.外植體的大小和形態(tài)消毒后的植物材料，即可進(jìn)行培養(yǎng)。從外表均一的外植體長出的愈傷組織，在開始階段是相當(dāng)一致的，而從莖、根等器官切段上長出的則是一個混雜的愈傷組織。有些外植體外表上看來是由同一類細(xì)胞組成，例如煙草的髓、胡蘿卜的次生韌皮部、菊芋的塊莖等，這些細(xì)胞中DNA的含量有很大差別。這種差別可能是由于細(xì)胞核中染色體數(shù)目的差別，即倍性不同所造成的。3.外植體的大小和形態(tài)得到形態(tài)一致的愈傷組織的培養(yǎng)策略從切段中取出某一種組織進(jìn)行培養(yǎng)。改變培養(yǎng)基的組成，只促進(jìn)某一類細(xì)胞分裂而抑制其他細(xì)胞分裂的辦法來建立這一類細(xì)胞的愈傷組織。往往培養(yǎng)基略加改變就能改變愈傷組織的整個性質(zhì)。得到形態(tài)一致的愈傷組織的培養(yǎng)策略接種的外植體的大小和形狀并不需要嚴(yán)格限制不能太小，小于肉眼能見的限度時，細(xì)胞分裂可能難以發(fā)生。故一般要求切塊的大小要適當(dāng)。外植體的細(xì)胞數(shù)目多，獲得愈傷組織的機(jī)會也多。接種的外植體的大小和形狀并不需要嚴(yán)格限制如果目的僅在于得到愈傷組織，那末將莖的切段、葉、根、花、果實(shí)或種子，或其中的某種組織切成一片片或一塊塊放到培養(yǎng)基上就可以了。如果目的僅在于得到愈傷組織，那末將莖的切段、葉、根、花、果實(shí)如果要定量地研究愈傷組織的發(fā)生，那末外植體的大小必須一致，形狀和組成也要基本相同。進(jìn)行這類研究常選用組織塊較大的材料，例如胡蘿卜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖、菊芋、荷蘭防風(fēng)草等。這樣才能得到足夠數(shù)量的、無菌的、一致的、適合于培養(yǎng)的外植體。如果要定量地研究愈傷組織的發(fā)生，那末外植體的大小必須一致，形三、愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一）愈傷組織誘導(dǎo)的操作程序

獲取外植體材料→消毒處理→修整除去壞死組織→切成5mm的圓柱形或方形小塊→直放或倒放到培養(yǎng)基上→每9cm培養(yǎng)基接種5－6塊外植體→培養(yǎng)。

選用較大組織做材料時，可用打孔器從塊莖和塊根中鉆取一批圓柱型組織，切成相同厚度的小圓片進(jìn)行培養(yǎng)。

三、愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一）愈傷組織誘導(dǎo)的操作程序圓柱形大量地、準(zhǔn)確地得到外形相同的外植體。圓柱體的表面積大，利于組織塊和外界氣體和營養(yǎng)物的交換。外植體的損傷表面分泌物，具有促進(jìn)愈傷組織形成的能力，因此表面積越大，產(chǎn)生分泌物數(shù)量也越多，愈傷組織的得率也越高。外植體的體積應(yīng)盡可能小，從而得到較大數(shù)量的外植體。外植體最小的限度由其親本組織細(xì)胞的平均大小來決定。細(xì)胞數(shù)目。采用圓形的原因：圓柱形大量地、準(zhǔn)確地得到外形相同的外植體。采用圓形的原因：例如菊芋的細(xì)胞比胡蘿卜根次生韌皮部的細(xì)胞大三倍，一個3.8毫克的胡蘿卜外植體大約包含25，000個細(xì)胞，這樣一個外植體是能夠成活的。而同樣重量的菊芋外植體，由于細(xì)胞大而數(shù)目少，在分離過程中造成損傷往往難以成活。必須重量達(dá)到8毫克才包含約20，000個細(xì)胞，使之易于成活。例如菊芋的細(xì)胞比胡蘿卜根次生韌皮部的細(xì)胞大三倍，一個3.8毫二）、愈傷組織的誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。1、常用激素與濃度激素類型激素濃度生長素類（2，4-D,IAA,NAA)0.01~10mg/L細(xì)胞分裂素類（玉米素，6-BA)0.1~10mg/L二）、愈傷組織的誘導(dǎo)激素類型激素濃度生長素類三）、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：1）、激素：多數(shù)情況下，單獨(dú)使用2，4-D可以成功誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生案例1：MS培養(yǎng)基含有不同濃度2，4-D時斑茅幼葉形成愈傷組織的誘導(dǎo)率（%）

不同濃度的2，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)率是不同的。一般情況下，2，4-D的濃度過低（低于10-9mg/L）時，愈傷組織生長緩慢；濃度過高（高于10mg/L）時，就會抑制愈傷組織的生長。三）、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：1）、激素：案例2.不同培養(yǎng)基及激素濃度對誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的影響

無論在MS還是在H或B5培養(yǎng)基中，不附加激素2,4-D均不能誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的形成，扁桃花藥在H+1.0mg/L2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高為47%;在MS+1.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率為67.0%;在B5+0.5～1.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D為0.5mg/L時，出愈率高達(dá)100%.。說明在扁桃花藥誘導(dǎo)過程中，最適基本培養(yǎng)基是B5，最佳2,4-D濃度為0.5mg/L。案例2.不同培養(yǎng)基及激素濃度對誘導(dǎo)扁桃花藥愈傷組織的影響研究表明：生長素與細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是二者搭配使用時更能強(qiáng)烈刺激愈傷組織的形成。在愈傷組織的誘導(dǎo)時，植物材料不同所用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同，使用的濃度也不同。研究表明：生長素與細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的2）.培養(yǎng)基不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響

2）.培養(yǎng)基不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。這樣簡單的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添加各種各樣的附加物（完全培養(yǎng)基），如維生素、氨基酸、糖醇，生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、螯合劑如EDTA、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子汁等。培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必須強(qiáng)調(diào)：適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基也不一定適合于固體培養(yǎng)。注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如早期，

采用無機(jī)鹽濃度低的培養(yǎng)基，化學(xué)工業(yè)不夠發(fā)達(dá)，化學(xué)試劑中雜質(zhì)含量較高。用高濃度無機(jī)鹽帶入更大量的雜質(zhì)，往往會抑制愈傷組織的生長。近代，MS培養(yǎng)基或類似MS培養(yǎng)基的高濃度的培養(yǎng)基。高濃度無機(jī)鹽既有利于保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，愈傷組織生長快，又因離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過程中，若某種成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。早期，采用無機(jī)鹽濃度低的培養(yǎng)基，化學(xué)工業(yè)不夠發(fā)達(dá)，化學(xué)試培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中才用硝態(tài)和銨態(tài)的混合物。K的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸提高的趨勢。有趣的是，各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能使相同的組織快速生長。例如Hildebrandt培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基顯著不同，但二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響

不同的培養(yǎng)基成分對植物不同器官的愈傷組織誘導(dǎo)存在著影響二)愈傷組織的形成愈傷組織從增殖的組織細(xì)胞中產(chǎn)生，激素改變細(xì)胞的新陳代謝狀態(tài)，從生長靜止期到代謝旺盛。二)愈傷組織的形成愈傷組織從增殖的組織細(xì)胞中產(chǎn)二)愈傷組織的形成三個時期愈傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的平均大小都有明顯的差別。從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：愈傷組織分化誘導(dǎo)期分裂期分化期二)愈傷組織的形成三個時期愈傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的誘導(dǎo)期（Induction,起動期、或起始期）:

起動期：

細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時期，愈傷組織形成起點(diǎn)。

外植體細(xì)胞在完整植株中隨著細(xì)胞的分化過程而逐漸停止分裂，開始執(zhí)行它們各自不同的功能。外植體細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，稱為靜止細(xì)胞。

在外源植物激素的作用下，處于靜止?fàn)顟B(tài)的植物細(xì)胞經(jīng)過復(fù)雜的脫分化過程恢復(fù)分裂能力轉(zhuǎn)化為分生細(xì)胞。此過程有人稱之為：細(xì)胞的誘導(dǎo)活化過程。

有人認(rèn)為損傷是誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的重要因素。受傷細(xì)胞釋放出的物質(zhì)與外源激素共同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分裂，是誘導(dǎo)植物愈傷組織形成的主要原因。Brown（1972）認(rèn)為靜止細(xì)胞是具有分裂能力的，只是被存在的一類抑制物質(zhì)所阻止，而使其分裂能力不能表現(xiàn)，如果除去抑制物質(zhì)，就可恢復(fù)分裂能力。若加入抵消抑制物質(zhì)影響的外源物質(zhì)（激素），細(xì)胞就立即進(jìn)行DNA復(fù)制，全部細(xì)胞進(jìn)入S期，并發(fā)生同步分裂。誘導(dǎo)期（Induction,起動期、或起始期）:

特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)胞的大小仍然和外植體時一樣，沒有多大改變。

處于起始期外植體特點(diǎn)：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)誘導(dǎo)期的長短由一系列內(nèi)部（植物的種類、生理狀況）和外部（光照、外源激素）因素決定。

例如：菊芋的誘導(dǎo)期有時還不需要1天，胡蘿卜則要好幾天，而菊芋塊莖貯藏時間的改變，誘導(dǎo)期也發(fā)生改變。從11月到次年4月取菊芋塊莖進(jìn)行培養(yǎng)，則誘導(dǎo)期從22小時逐漸延長到40小時。誘導(dǎo)期的長短由一系列內(nèi)部（植物的種類、生理狀況）和外部（光照故可以從內(nèi)外因兩方面著手，改變誘導(dǎo)期長短主要外因方面是添加一些生長物質(zhì)Steward等(1964)用2,4-D及其類似的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理處于靜止?fàn)顟B(tài)的組織，看到RNA的含量很快明顯地增加。并且2、4-D積累在分裂細(xì)胞的核仁中。Yeoman和Mitchell(1970)指出了核仁是生長物質(zhì)的作用部位。故可以從內(nèi)外因兩方面著手，改變誘導(dǎo)期長短分裂期Celldivision)：Activecelldivision,cellsreverttoameristematic(分生組織的)dedifferentiatedstate.分裂期Celldivision)：Activecell外植體(explant)中已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，外植體外層細(xì)胞出現(xiàn)了分裂，由于外層細(xì)胞的迅速分裂使得這些細(xì)胞的體積縮小，逐漸回復(fù)到分生組織狀態(tài)，該時期細(xì)胞通過脫分化的起動期而進(jìn)入分裂，并開始形成愈傷組織。外植體(explant)中已分化的活細(xì)胞在分裂期特征：生理生化上分裂期的一個明顯特征是外層細(xì)胞進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變??；細(xì)胞核和核仁增到最大，RNA含量達(dá)到最高等。此時期的愈傷組織：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。分裂期特征：生理生化上分裂期的一個明顯分裂期愈傷組織分裂期愈傷組織1mg/l2,4-D10mg/l2,4-D1mg/l2,4-D10mg/l2,4-D1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。2.每個細(xì)胞平均鮮重下降。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。4．細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.細(xì)胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變。6.隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn):1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn):植物分裂期脫分化規(guī)律：

胡蘿卜等脫分化較禾谷類容易莖葉較花器脫分化幼嫩莖組織比老組織較容易植物分裂期脫分化規(guī)律：分化期（Differentiation）：Appearanceofcellular

differentiationandtheexpressionof

secondarymetabolicpathways.分化期（Differentiation）：Appearanc分化期：細(xì)胞分裂從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)部的組織細(xì)胞，愈傷組織表層細(xì)胞分裂減緩或停止，內(nèi)部深層細(xì)胞分裂并形成像維管束或類似于分生組織組成的鳥巢狀結(jié)構(gòu)的次生組織。此時期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小趨于穩(wěn)定。分化期：細(xì)胞分裂從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)部的組織分化期愈傷組織的特點(diǎn)：生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；而老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。分化期愈傷組織的特點(diǎn)：生長旺盛的愈傷組織一般呈A細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：B形成瘤狀或片狀的分生組織結(jié)節(jié)。或維管組織結(jié)節(jié)。C細(xì)胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。D出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。E生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。分化期細(xì)胞特點(diǎn)：A細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：分化期細(xì)胞特點(diǎn)：提醒：根據(jù)形態(tài)變化列出三個時期，實(shí)際上它們的界限并不分嚴(yán)格，特別是分裂期和分化期。一塊培養(yǎng)組織的細(xì)胞既有分裂的又有分化的。提醒：根據(jù)形態(tài)變化列出三個時期，實(shí)際上它們的愈傷組織類型Callustypes

Callusmaybeheavilylignified（木質(zhì)化）andhardintexture,

whereasothersbreakeasilyintosmallfragments

(friable).DifferenttypesofGloriosa(火炎花)callus:

FriableHard/lignifiedcallus

Rhizogeniccallus

Callusexudingstickypoly-saccharides

愈傷組織類型CallustypesCallusmay愈傷組織的類型：不同植物來源的愈傷組織，在質(zhì)地、形態(tài)和物理性狀方面均有明顯的差異。有的愈傷組織呈淡黃色或白色，有的愈傷組織呈綠色或紅色。

一般來說，來源于相同組織的愈傷組織含有的色素大致相同，但經(jīng)過反復(fù)繼代培養(yǎng)后會失去色素。愈傷組織的類型：不同植物來源的愈傷組織，在質(zhì)根尖愈傷組織

（無色透明）莖尖愈傷組織（淡綠色）植物愈傷組織類型舉例：根尖愈傷組織（無色透明）莖尖愈傷組織（淡綠色）植物愈傷組當(dāng)歸莖段愈傷組織（綠色）

香茶菜愈傷組織

鎖陽愈傷組織（紅色）當(dāng)歸莖段愈傷組織（綠色）香茶菜愈傷組織鎖陽愈傷組織（紅愈傷組織類型及特征

1.結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽

2.結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立

3胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。

愈傷組織類型及特征

愈傷組織的基本解剖學(xué)：基本解剖學(xué)特征明顯差異。菜豆，凡是脆的都有大量的分生組織中心或瘤狀結(jié)構(gòu)，它們被大而未分化的細(xì)胞所分開；而不脆的類型很少分化，而且大部分是高度液泡化細(xì)胞。單冠毛菊，脆的愈傷組織由松散排列的細(xì)胞組成，堅(jiān)實(shí)的愈傷組織是由堆得很緊的細(xì)胞所組成。愈傷組織的基本解剖學(xué)：愈傷組織的化學(xué)成分：蠶豆，不脆的愈傷組織有大量的組成細(xì)胞壁的多糖，以單位干重計(jì)，細(xì)胞壁的部分也多；但與果膠物質(zhì)及半纖維素相比，纖維素的百分率是低的。無疑，大量的纖維素增加了細(xì)胞的硬度，而果膠含量的增加，保證了細(xì)胞緊緊地粘在一起而不易斷碎。愈傷組織的化學(xué)成分：Callusmayhaveayellow,white,greenorred(anthocyanin花青苷)appearance.Callusmayhaveayellow,影響植物愈傷組織形成的因素：1、同一植株不同器官形成愈傷組織的能力不同。例如：君子蘭用MS+2mg/L6-BA+2mg/LNAA+1mg/L2,4-D固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，莖尖、莖切塊和葉片形成愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為85%、13%和72%；若用MS+5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1mg/L2,4-D固體培養(yǎng)基培養(yǎng),三種外植體形成愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為82%、9%和70%。這說明培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)組成的比例不同，直接影響著愈傷組織的形成。楊寧[1]等人的研究表明，植物扁桃（‘Naporeil’品種）的莖段、花藥在適宜的培養(yǎng)基上能比較容易的誘導(dǎo)出愈傷組織，而葉肉組織則不能或難以誘導(dǎo)形成愈傷組織。影響植物愈傷組織形成的因素：1、同一植株不同器官形影響植物愈傷組織形成的因素：2、選擇適宜基本培養(yǎng)基不僅影響愈傷組織的誘導(dǎo)，而且影響傷組織的生長。

于樹宏和李玲（1999）用淺綠色野葛葉片愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，用MS+1mg/LNAA，愈傷組織呈淺綠色，新鮮健壯；在培養(yǎng)基中同時加入3mg/L6-BA和1mg/LNAA,愈傷組織生長迅速，若培養(yǎng)時間較長，形成的愈傷組織呈白、硬顆粒狀，部分會發(fā)生褐變死亡；但若將愈傷組織置于含相同濃度6-BA和NAA的B5培養(yǎng)基上生長，愈傷組織可以始終保持新鮮健壯的外觀，而且不斷生長。楊寧[2]等人用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)繼進(jìn)行當(dāng)歸愈傷組織增殖培養(yǎng)的研究表明，單獨(dú)使用一種生長素時，愈傷組織增殖很不明顯；若只使用一種細(xì)胞分裂素時，愈傷組織均不見增殖，并且生長狀況也不佳；但將二者合理搭配使用時，愈傷組織不僅增殖較明顯，而且生長狀況較佳?？梢?，兼用生長素和6-BA增效作用較明顯影響植物愈傷組織形成的因素：2、選擇適宜基本培養(yǎng)基不僅影響愈基本培養(yǎng)基對當(dāng)歸愈傷組織繼代的影響*

注：“+”表示基本可以生長;“++”表示生長較好,繼代較好；“+++”表示繼代最好.*表中數(shù)據(jù)取材于楊寧等人的《當(dāng)歸愈傷組織的增殖與分化培養(yǎng)》

基本培養(yǎng)基對當(dāng)歸愈傷組織繼代的影響*注：“+”表示基本不同激素組合對當(dāng)歸愈傷組織增殖的影響*注：“+”表示基本可以生長;“++”表示生長較好,繼代較好；“+++”表示繼代最好.*表中數(shù)據(jù)取材于楊寧等人的《當(dāng)歸愈傷組織的增殖與分化培養(yǎng)》

不同激素組合對當(dāng)歸愈傷組織增殖的影響*注：“+”表示基本三、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生

愈傷組織培養(yǎng)物在某些條件下，可以再分化產(chǎn)生不定芽或根的分生組織甚至是胚狀體，繼之，由這些有結(jié)構(gòu)的組織而發(fā)育成苗或完整小植株。愈傷組織通過再分化形成再生植株的方式主要有三種：1)、先產(chǎn)生芽，后在莖的基部長根；2)先長根，再長芽；3)愈傷組織的不同部位分別形成根和芽。三、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物在某些概念：極性—植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象，指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。細(xì)胞無性系—植物離體培養(yǎng)中，任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株，即稱細(xì)胞無性系。概念：

一）、器官的形成

一般愈傷組織開始分化時，由大小不等的細(xì)胞開始逐漸形成大小均勻的細(xì)胞，保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。

在分化時，愈傷組織的表層和內(nèi)部都可形成分生中心。芽多發(fā)生在愈傷組織的表層，屬外起源。

根發(fā)生在組織的深處，與整體植株發(fā)生類似，是內(nèi)起源。

愈傷組織的外部形態(tài)也隨分化而改變，一般由疏松轉(zhuǎn)向緊密。

一）、器官的形成

一般愈傷組織開始分化植物愈傷組織離體培養(yǎng)中，脫分化形成無極性或無明顯形態(tài)的愈傷組織塊。當(dāng)條件適合時，愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生芽或根的分生組織，甚至體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育成苗或完整植株。

愈傷組織的形態(tài)發(fā)生有以下兩種情況：1、不定芽和根的發(fā)生（器官發(fā)生）是愈傷組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。植物愈傷組織離體培養(yǎng)中，脫分化形成無極性或無明顯形態(tài)的1）愈傷組織通過不定芽和根形成器官的階段①外植體脫分化-愈傷組織是細(xì)胞分裂的結(jié)果。②愈傷組織-瘤狀結(jié)構(gòu)是細(xì)胞分化、分化組織出現(xiàn)和有限細(xì)胞分裂的結(jié)果。③

、瘤狀結(jié)構(gòu)-器官原基是分生細(xì)胞團(tuán)分化的結(jié)果。1）愈傷組織通過不定芽和根形成器官的階段葉片愈傷組織的形成葉片愈傷組織的形成二）愈傷組織的器官發(fā)生順序1、無芽的根或無根的芽愈傷組織僅有芽或根器官的分別形成，不能形成完整植株。2、先芽后根愈傷組織先形成芽，芽生長后，其基部發(fā)出根，進(jìn)而形成小植株，是大多數(shù)植物的器官發(fā)生方式。如蘋果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麥、水稻二）愈傷組織的器官發(fā)生順序3、先根后芽先形成根，再從根的基部分化出芽形成小植株，雙子葉植物中普遍。如顛茄、枸杞、苜蓿4、分別形成芽和根愈傷組織鄰近不同部位分別形成芽和根，兩者結(jié)合起來形成一株小植株，類似根芽的天然嫁接，但必須根與芽的維管束相同，才能得到成活植株。如胡蘿卜、石刁柏3、先根后芽三、體細(xì)胞胚的發(fā)生

愈傷組織體細(xì)胞胚植株三、體細(xì)胞胚的發(fā)生

魔芋體細(xì)胞胚魔芋體細(xì)胞胚胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)胚狀體作為植物組培形態(tài)發(fā)生常見的重要方式，與不定芽方式比較，具有自身的優(yōu)點(diǎn)：1、胚狀體的數(shù)量比不定芽多2、胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和貯藏3、胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。

胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)器官分化的植物激素控制理論大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。即：生長素與細(xì)胞分裂素的比例小時則產(chǎn)生苗，比例大時則生根，而兩種激素的比例適中時，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。器官分化的植物激素控制理論大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：植物物種和品種基因型影響愈傷組織的分化程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基因型大豆品種的下胚軸作外植體進(jìn)行組培時，培養(yǎng)基對愈傷組織的影響不明顯；細(xì)胞分裂素（KT）和NAA的配比濃度對其愈傷組織的