-疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料

生物制品學(xué)艾滋病疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室張海紅生物制品學(xué)1第三篇基因工程疫苗第一章基因工程第二章基因工程疫苗第三章基因工程疫苗質(zhì)量控制第三篇基因工程疫苗2第一章基因工程

第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程

第一章基因工程第一節(jié)基因工程概述3第一節(jié)、基因工程概述一、基因工程的定義二、基因工程的基本操作程序三、基因工程歷史上的重要人物四、理論基礎(chǔ)第一節(jié)、基因工程概述一、基因工程的定義4一、基因工程定義

基因工程(Geneticengineering)是一種DNA重組技術(shù)，它是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，即把供體細(xì)胞中的基因或基因組提取出來(lái)，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，經(jīng)過(guò)體外加工重組，或者把人工合成的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并獲得新的遺傳特性的技術(shù)。由于被轉(zhuǎn)移的基因必須與載體DNA重組后才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，所以基因工程也叫做重組DNA技術(shù)。一、基因工程定義基因工程(Geneticenginee5二、基因工程的基本操作程序（1）目的基因的分離或合成；（2）用工具酶對(duì)目的基因和載體（Vector）進(jìn)行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；（3）把重組DNA分子引入受體細(xì)胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達(dá)；（4）轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的擴(kuò)增；（5）重組體細(xì)胞的鑒定與篩選。二、基因工程的基本操作程序（1）目的基因的分離或合成；6三、基因工程歷史上的重要人物三、基因工程歷史上的重要人物7--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料8--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料9--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料10

不能忘記的人

PaulBerg

伯格（美國(guó)生物化學(xué)家）通過(guò)把兩個(gè)不同來(lái)源的DNA連結(jié)在一起并發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)功能，證明了完全可以在體外對(duì)基因進(jìn)行操作。他作為“重組DNA技術(shù)之父”于1980年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。不能忘記的人PaulBerg11

不能忘記的人KaryBMullis1985年穆利斯發(fā)明了高效復(fù)制DNA片段的聚和酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展。不能忘記的人KaryBMullis12四、理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可切割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的；多肽和基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳給下一代。四、理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；13

第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一、構(gòu)建過(guò)程示意圖二、發(fā)酵的一般過(guò)程三、下游加工過(guò)程第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一、構(gòu)建過(guò)程示意圖142.生產(chǎn)過(guò)程上游構(gòu)建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)（發(fā)酵工程）純化制備

2.生產(chǎn)過(guò)程上游構(gòu)建發(fā)酵生產(chǎn)純化制備15一、構(gòu)建過(guò)程示意圖①②③④⑤⑥①?gòu)募?xì)胞中分離出目的DNA②限制酶截取DNA片斷③分離表達(dá)載體（質(zhì)粒等）④DNA重組⑤用重組后的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞⑥培養(yǎng)宿主細(xì)胞克隆大量基因一、構(gòu)建過(guò)程示意圖①②③④⑤⑥①?gòu)募?xì)胞中分離出目的DNA②限161.載體（Vector）的選擇種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。選擇標(biāo)準(zhǔn)：

能自主復(fù)制；

具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；

有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）；

分子量小，以容納較大的外源DNA。1.載體（Vector）的選擇種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒17

質(zhì)粒（Plasmid）

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。質(zhì)粒18--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料19--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料20--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料21

原核表達(dá)體系：如大腸桿菌（E.coli

）等2.表達(dá)體系的選擇

優(yōu)點(diǎn)：

強(qiáng)啟動(dòng)子,表達(dá)量大 翻譯調(diào)控序列 生產(chǎn)簡(jiǎn)單

不足：缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制 缺乏翻譯后加工機(jī)制 表達(dá)產(chǎn)物形成不溶性包涵體 很難表達(dá)大量可溶性蛋白2.表達(dá)體系的選擇不足：缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制22

優(yōu)點(diǎn)：可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)一般具有天然活性 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)積累真核表達(dá)體系

如酵母、昆蟲(chóng)及哺乳類動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)酵母菌的結(jié)構(gòu) 真核表達(dá)體系缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)酵母菌的結(jié)構(gòu)23二、發(fā)酵的一般過(guò)程

發(fā)酵工藝多種多樣，但基本上包括以下三個(gè)過(guò)程:

發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)示意圖

1、菌種制備

2、種子擴(kuò)大培養(yǎng)

3、大規(guī)模罐批培養(yǎng)二、發(fā)酵的一般過(guò)程 發(fā)酵工藝多種多樣，但基本24三、下游加工過(guò)程

從發(fā)酵液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程稱為發(fā)酵生產(chǎn)的下游加工過(guò)程。它是生產(chǎn)過(guò)程中最重要、成本費(fèi)用最高的環(huán)節(jié)。至今高效液相色譜仍是最常用的手段。一般可分為四個(gè)階段：

1、發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離

2、提取

3、精制

4、成品加工三、下游加工過(guò)程從發(fā)酵液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的25--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料26

27

28基因工程疫苗第一節(jié)基因工程亞單位疫苗第二節(jié)基因工程載體疫苗第三節(jié)核酸疫苗第四節(jié)基因缺失活疫苗第五節(jié)蛋白工程疫苗第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)基因工程疫苗第一節(jié)基因工程亞單位疫苗29第一節(jié)基因工程亞單位疫苗一、定義二、抗原基因的選擇三、表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié)基因工程亞單位疫苗一、定義30一、定義：

又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，主要指將病原微生物的抗原基因用分子生物學(xué)的方法分離，然后與載體DNA相連接，在經(jīng)載體將抗原基因帶進(jìn)受體進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，最后將基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原分離純化后制成疫苗。一、定義：31二、抗原基因的選擇1、一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因2、對(duì)于易變異的病毒（如HA）則應(yīng)選擇各亞型共有的核心蛋白的主要保護(hù)性抗原基因3、一般選擇兩種以上的抗原基因構(gòu)建重組體二、抗原基因的選擇1、一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因32三、表達(dá)系統(tǒng)1、種類：大腸桿菌：BL21枯草桿菌:酵母細(xì)胞:畢赤酵母昆蟲(chóng)細(xì)胞：SF9哺乳細(xì)胞：CHO、轉(zhuǎn)基因植物:番茄、馬鈴薯、香蕉轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:牛三、表達(dá)系統(tǒng)1、種類：33三、表達(dá)系統(tǒng)2、表達(dá)系統(tǒng)選擇的依據(jù)（1）表達(dá)抗原的免疫原性強(qiáng)弱—蛋白翻譯后修飾哺乳細(xì)胞〉酵母細(xì)胞〉大腸桿菌（2）表達(dá)效率的高低大腸桿菌〉酵母細(xì)胞〉哺乳細(xì)胞（3）表達(dá)產(chǎn)物純化的難易程度表達(dá)量越大越容易純化帶標(biāo)簽的容易純化三、表達(dá)系統(tǒng)2、表達(dá)系統(tǒng)選擇的依據(jù)34基因工程亞單位疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):與傳統(tǒng)疫苗相比，安全性較好缺點(diǎn)：免疫效果價(jià)差增強(qiáng)免疫原性的方法：調(diào)整基因組合，使其表達(dá)成顆粒結(jié)構(gòu)在體外將抗原聚團(tuán)化，如包入脂質(zhì)體或膠囊微球加入有免疫增強(qiáng)作用的化合物作為佐劑基因工程亞單位疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):與傳統(tǒng)疫苗相比，安全性較好35第二節(jié)基因工程載體疫苗一、定義：利用微生物作載體，將保護(hù)性抗原基因重組到微生體中，利用這種能表達(dá)保護(hù)性抗原基因的重組微生物制成的疫苗，稱載體疫苗。二、分類以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗以病毒為載體的基因工程疫苗第二節(jié)基因工程載體疫苗一、定義：361、以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗減毒的沙門氏菌和卡介苗是最重要的和用途最廣的載體；前者能誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，后者以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主。減毒沙門氏菌載體傷寒沙門氏菌是一種腸道致病菌。美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床的傷寒Ty21a減毒活疫苗顯示了很好的安全性和免疫原性。至今已有結(jié)核桿菌、霍亂弧菌、乙肝、流感、和血吸蟲(chóng)等數(shù)十種病原微生物的外源基因在沙門氏菌的減毒活疫苗中獲得了不同程度的表達(dá)。1、以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗減毒的沙門氏菌和卡介苗是最重要37卡介苗載體：卡介苗的使用已有半個(gè)世紀(jì)，全世界已有40多億人接種過(guò)卡介苗，誘導(dǎo)的反應(yīng)可長(zhǎng)達(dá)5-50年。是理想的表達(dá)載體。但是臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，主要原因是卡介苗本身會(huì)刺激接種者產(chǎn)生很強(qiáng)的針對(duì)分枝桿菌的免疫反應(yīng)?？ń槊巛d體：382、以病毒為載體的基因工程疫苗可視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋白質(zhì)疫苗的結(jié)合。主要有：痘病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、和單純皰疹病毒。2、以病毒為載體的基因工程疫苗可視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋391、痘病毒優(yōu)點(diǎn)：（1）安全性好，是人類使用了近200年的最為安全的疫苗；（2）宿主廣泛，能感染多種類型的細(xì)胞；（3）插入外源基因的容量大，可插入20kDa的外源基因。（4）易培養(yǎng)，病毒自身的耐熱性強(qiáng)和容易獲得高效價(jià)的培養(yǎng)特點(diǎn)。缺點(diǎn)：雖然已有很多牛痘基因工程疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但還有很多問(wèn)題需要克服，如不能口服，接種過(guò)天花疫苗的人有預(yù)存免疫等問(wèn)題。1、痘病毒優(yōu)點(diǎn)：402、腺病毒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：預(yù)存免疫2、腺病毒優(yōu)點(diǎn)：41第三節(jié)核酸疫苗核酸疫苗的研究背景構(gòu)建核酸疫苗的基本要素——目的基因和載體核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)第三節(jié)核酸疫苗核酸疫苗的研究背景42核酸疫苗的研究背景1992年，Tang等給小鼠直接注射含有人生長(zhǎng)素基因的質(zhì)粒DNA，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了針對(duì)人生長(zhǎng)激素的抗體，標(biāo)志著核酸疫苗的出現(xiàn)。1994年，開(kāi)始，美國(guó)FDA已陸續(xù)批準(zhǔn)了艾滋病、流感、乙肝、單純皰疹病毒、瘧疾和癌胚抗原等核酸疫苗進(jìn)入臨床。1995年美國(guó)紐約科學(xué)院召開(kāi)會(huì)議專門研討DNA疫苗，稱之為疫苗學(xué)的新紀(jì)元和疫苗的第三次革命核酸疫苗的研究背景1992年，Tang等給小鼠直接注射含有人43構(gòu)建核酸疫苗的基本要素1、目的基因可以是針對(duì)某一抗原的單基因片段或基因的cDNA,也可以是一組基因、多個(gè)基因（多重抗原性基因）或嵌合型基因。是核酸疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素。構(gòu)建核酸疫苗的基本要素1、目的基因44構(gòu)建核酸疫苗的基本要素2、DNA疫苗的載體（1）可以克隆外源基因的多重限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（2）具有真核細(xì)胞啟動(dòng)子（3）具有CpG核苷酸基序（4）具有用于選擇的標(biāo)記最好卡那霉素，氨卡青霉素有預(yù)存免疫（5）具有能在大腸桿菌中復(fù)制的基因構(gòu)建核酸疫苗的基本要素2、DNA疫苗的載體45核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（1）免疫保護(hù)力增強(qiáng)。CTL應(yīng)答是機(jī)體殺死癌變細(xì)胞的有效清除途徑。腫瘤基因疫苗接種機(jī)體后，其表達(dá)的內(nèi)源性抗原有利于MHC-Ⅰ類分子的抗原提呈和CTL的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫，并促進(jìn)體液免疫功能的加強(qiáng)，從而預(yù)防和免疫治療腫瘤。（2）產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答，腫瘤DNA疫苗可在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，持續(xù)的刺激免疫系統(tǒng)，使其抗瘤作用持久存在，在腫瘤的治療和預(yù)防上均有著廣闊的前景。（3）有很好的可控性，其誘生的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向性，可通過(guò)改變接種方法和部位、質(zhì)粒中的免疫刺激序列以及細(xì)胞因子和共刺激分子基因的同時(shí)使用等進(jìn)行調(diào)整，可將多個(gè)抗原表位基因克隆在同一表達(dá)載體而制備成多價(jià)疫苗的特點(diǎn)，是常規(guī)疫苗無(wú)法比擬的。核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（1）免疫保護(hù)力增強(qiáng)。CTL應(yīng)答是機(jī)體殺死癌變46核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（4）腫瘤DNA疫苗具有制備容易、生產(chǎn)成本低廉、可批量生產(chǎn)。（5）質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，便于貯存和運(yùn)輸，無(wú)須冷藏、使用方法簡(jiǎn)單，有利于將來(lái)的推廣應(yīng)用。（6）安全性好，由于基因疫苗一般采用表達(dá)載體在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行抗原表達(dá)，不與宿主染色體DNA整合。因此與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗的應(yīng)用性和可操作性都大為增強(qiáng)。核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（4）腫瘤DNA疫苗具有制備容易、生產(chǎn)成本低廉47第四節(jié)基因缺失活疫苗就是應(yīng)用基因操作技術(shù)，將病原微生物中與致病性有關(guān)的毒力序列除去或關(guān)閉，使之成為無(wú)毒株或弱毒株，但仍保持有良好的免疫原性，從而制成安全有效的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：與自然減毒株相比，基因缺失突變株具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易返租等優(yōu)點(diǎn)。第四節(jié)基因缺失活疫苗就是應(yīng)用基因操作技術(shù)，將病原微生物中與48第五節(jié)蛋白質(zhì)工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變、插入、缺失等構(gòu)型改變，甚至進(jìn)行不同基因或部分結(jié)構(gòu)域的人工組合，以增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性、擴(kuò)大反應(yīng)普、去除有害作用或副反應(yīng)的一類疫苗。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變49第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗目的：通過(guò)導(dǎo)入特定的外源基因來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植物，以改良作物、研究植物基因功能、生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白質(zhì)等。研究的兩個(gè)方面：1、與植物重要生命活動(dòng)有關(guān)的基因或其cDNA的克隆。2、將外源基因?qū)氩⒄系街参锘蚪M以獲得轉(zhuǎn)基因植物。第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗目的：通過(guò)導(dǎo)入特定的外源基因來(lái)獲得轉(zhuǎn)50一、生產(chǎn)疫苗用轉(zhuǎn)基因植物的選擇作為生產(chǎn)疫苗用的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)有的特點(diǎn)：該植物可以在世界上較多地區(qū)，特別是發(fā)展中國(guó)家種植，并能獲得較高的產(chǎn)量；容易該嬰幼兒喂服，并能被家長(zhǎng)們接受；作為疫苗的植物，其可食部分必須是可生食的含有較高的蛋白質(zhì)含量。一、生產(chǎn)疫苗用轉(zhuǎn)基因植物的選擇作為生產(chǎn)疫苗用的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)有511、煙草優(yōu)勢(shì)：是植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的模式生物，易獲得轉(zhuǎn)基因植物；蛋白質(zhì)含量豐富，可通過(guò)純化技術(shù)獲得；劣勢(shì)：但含有個(gè)尼古丁等有害物質(zhì)1、煙草優(yōu)勢(shì)：522、馬鈴薯優(yōu)勢(shì)：馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，在很短的時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物；馬鈴薯可使用的塊莖組織特異性啟動(dòng)子已被克隆，可使外源基因在塊莖內(nèi)特異的大量表達(dá)；馬鈴薯的組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)業(yè)已成熟，可以供應(yīng)大量遺傳背景一致的種苗；馬鈴薯可以被很多動(dòng)物食用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不成問(wèn)題。劣勢(shì)：馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量較低，人類無(wú)生食馬鈴薯的習(xí)慣。2、馬鈴薯優(yōu)勢(shì)：533、香蕉優(yōu)勢(shì)：在東南亞、非洲、印度次大陸、河南美等發(fā)展中國(guó)家被大量種植，價(jià)格非常便宜；香蕉的蛋白質(zhì)含量較高，一個(gè)香蕉可以給10個(gè)嬰兒接種免疫可以口服。劣勢(shì)：香蕉的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究尚待進(jìn)一步完善，至今還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因香蕉種植成功的報(bào)道。3、香蕉優(yōu)勢(shì)：54二、轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)越性1、植物具有全能性。2、植物細(xì)胞具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行反以后修飾和加工，與高等等動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗原具有一致的免疫原性及生物學(xué)活性。3、可誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。黏膜免疫是人體的第一道屏障。4、生產(chǎn)簡(jiǎn)單，成本低廉。陽(yáng)光和土地5、接種簡(jiǎn)單?？煽诜?、安全。本質(zhì)即食物，安全可靠。二、轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)越性1、植物具有全能性。55三、目前在研的幾種主要的轉(zhuǎn)基因植物疫苗主要研究方向：利用植物作為工廠來(lái)生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)抗原，然后經(jīng)過(guò)分離和提純，在制備成疫苗；不需要分離提純，將植物或其某部分作為可以直接口服的疫苗。三、目前在研的幾種主要的轉(zhuǎn)基因植物疫苗主要研究方向：561、非直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗1）乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因植物疫苗基因插入質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后在轉(zhuǎn)入煙草，顆粒為22nm，與人血清中的類似，而酵母表達(dá)的顆粒為17nm。2）諾瓦克病毒衣殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物疫苗諾瓦克病毒是能引起腹瀉的病原體，每年造成300萬(wàn)兒童死亡。用煙草表達(dá)量可達(dá)煙草的0.23%3）狂犬病毒糖蛋白轉(zhuǎn)基因植物疫苗McGarvey等在番茄中表達(dá)的狂犬病毒表面糖蛋白，能與病毒天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體形成免疫沉淀，并在小鼠中測(cè)到了中和抗體。1、非直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗1）乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因植物疫572、直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗大腸桿菌腸毒素植物疫苗結(jié)核轉(zhuǎn)基因植物疫苗把結(jié)核桿菌分泌性蛋白質(zhì)MPT-64和ESET-6的基因?qū)霟煵?、黃瓜、番茄和胡蘿卜的研究正在進(jìn)行中。其中MPT-64蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)在番茄中獲得了表達(dá)。動(dòng)物傳染病的轉(zhuǎn)基因植物疫苗Carrillo等報(bào)道了將編碼家畜口蹄疫病單獨(dú)結(jié)構(gòu)基因VP1的基因轉(zhuǎn)入到植物擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植物葉子的提取物能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，能保護(hù)小鼠地抵抗口蹄疫病毒的襲侵襲。2、直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗大腸桿菌腸毒素植物疫苗58四、轉(zhuǎn)基因植物存在的問(wèn)題1、產(chǎn)生免疫保護(hù)所需的具體劑量不清楚2、如何去除轉(zhuǎn)基因植物帶中的抗生素3、植物細(xì)胞壁的天然生物膠囊作用雖然能避免植物疫苗在消化道中過(guò)早被降解，但如果久久不能被釋放也是致命的缺點(diǎn)。尋找一個(gè)最佳平衡點(diǎn)，是植物疫苗在最適合的部位發(fā)揮作用也是今后研究的方向。四、轉(zhuǎn)基因植物存在的問(wèn)題1、產(chǎn)生免疫保護(hù)所需的具體劑量不清楚59第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)一、基因疫苗的優(yōu)越性二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)60一、基因疫苗的優(yōu)越性1、安全性2、經(jīng)濟(jì)效益一、基因疫苗的優(yōu)越性1、安全性61二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)1、主要研究常規(guī)技術(shù)不能決絕或很難解決的新疫苗2、積極進(jìn)行傳統(tǒng)疫苗的改造3、加強(qiáng)治療性疫苗的研究4、發(fā)展多價(jià)疫苗二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)1、主要研究常規(guī)技術(shù)不能決絕或很難62第三章基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制第三節(jié)純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制第四節(jié)目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制第三章基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制63意義

利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。意義利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜64

宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過(guò)程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中65第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制

原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制66

根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：⒈明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下67⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動(dòng)子）的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；⒊應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如68⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中啟動(dòng)與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合69第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制

在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定； 始終能排除外源微生物污染。第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求70

生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含71

原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)72

對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材73

在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)74

培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如75第三節(jié)純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制

產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。第三節(jié)純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有76

在精制過(guò)程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測(cè)方法。在精制過(guò)程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、77第四節(jié)目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。第四節(jié)目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物的78⒈產(chǎn)品的鑒別

常用的鑒定方法:

電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳免疫學(xué)方法:放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA)

受體結(jié)合試驗(yàn)高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分析、圓二色譜、核磁共振--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料79⑴肽圖分析

肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),對(duì)生成的肽段進(jìn)行分離分析。它是檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏高效是對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。常用HPLC、毛細(xì)管電泳。⑴肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降80⑵氨基酸成分分析

50個(gè)氨基酸較理想⑶部分氨基酸序列分析

N端15個(gè)氨基酸可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。⑵氨基酸成分分析81

⑷重組蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和相對(duì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法有:福林-酚法、雙縮脲法蛋白相對(duì)分子量的測(cè)定:凝膠過(guò)濾法、SD-SPAGE法⑷重組蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和相對(duì)分子量的測(cè)定82⑸蛋白質(zhì)二硫鍵分析測(cè)定方法有:

對(duì)氯汞苯甲酸法等

5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法⑸蛋白質(zhì)二硫鍵分析83⒉純度分析⑴蛋白質(zhì)含量測(cè)定

SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳⑵雜質(zhì)①蛋白類雜質(zhì)殘留宿主細(xì)胞蛋白采用免疫分析的方法②非蛋白類雜質(zhì)⒉純度分析84②非蛋白類雜質(zhì)非蛋白類雜質(zhì)主要有:病毒、細(xì)菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、致敏源及DNA。②非蛋白類雜質(zhì)85常用檢測(cè)方法：雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SDS、CE其它蛋白雜質(zhì)免疫分析、SDS、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽譜、HPLC、質(zhì)譜、氨基酸分析產(chǎn)物變性或聚和脫氨基SDS、IEF、HPLC、CE、質(zhì)譜、凝膠過(guò)濾常用檢測(cè)方法：86雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法單克隆抗體SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、CE微生物微生物學(xué)檢查支原體微生物學(xué)檢查病毒微生物學(xué)檢查雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法87⒊生物學(xué)活性測(cè)定需通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定。⒋穩(wěn)定性考查是藥品有效性安全性的重要指標(biāo)，是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。⒌產(chǎn)品一致性的保證⒊生物學(xué)活性測(cè)定88五、產(chǎn)品的保存⒈液態(tài)保存⑴低溫保存⑵在穩(wěn)定的下保存⑶高濃度保存⑷加保護(hù)劑保存⒉固態(tài)保存五、產(chǎn)品的保存89生物制品學(xué)艾滋病疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室張海紅生物制品學(xué)90第三篇基因工程疫苗第一章基因工程第二章基因工程疫苗第三章基因工程疫苗質(zhì)量控制第三篇基因工程疫苗91第一章基因工程

第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程

第一章基因工程第一節(jié)基因工程概述92第一節(jié)、基因工程概述一、基因工程的定義二、基因工程的基本操作程序三、基因工程歷史上的重要人物四、理論基礎(chǔ)第一節(jié)、基因工程概述一、基因工程的定義93一、基因工程定義

基因工程(Geneticengineering)是一種DNA重組技術(shù)，它是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，即把供體細(xì)胞中的基因或基因組提取出來(lái)，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，經(jīng)過(guò)體外加工重組，或者把人工合成的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并獲得新的遺傳特性的技術(shù)。由于被轉(zhuǎn)移的基因必須與載體DNA重組后才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，所以基因工程也叫做重組DNA技術(shù)。一、基因工程定義基因工程(Geneticenginee94二、基因工程的基本操作程序（1）目的基因的分離或合成；（2）用工具酶對(duì)目的基因和載體（Vector）進(jìn)行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；（3）把重組DNA分子引入受體細(xì)胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達(dá)；（4）轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的擴(kuò)增；（5）重組體細(xì)胞的鑒定與篩選。二、基因工程的基本操作程序（1）目的基因的分離或合成；95三、基因工程歷史上的重要人物三、基因工程歷史上的重要人物96--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料97--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料98--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料99

不能忘記的人

PaulBerg

伯格（美國(guó)生物化學(xué)家）通過(guò)把兩個(gè)不同來(lái)源的DNA連結(jié)在一起并發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)功能，證明了完全可以在體外對(duì)基因進(jìn)行操作。他作為“重組DNA技術(shù)之父”于1980年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。不能忘記的人PaulBerg100

不能忘記的人KaryBMullis1985年穆利斯發(fā)明了高效復(fù)制DNA片段的聚和酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展。不能忘記的人KaryBMullis101四、理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可切割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的；多肽和基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳給下一代。四、理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；102

第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一、構(gòu)建過(guò)程示意圖二、發(fā)酵的一般過(guò)程三、下游加工過(guò)程第二節(jié)基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一、構(gòu)建過(guò)程示意圖1032.生產(chǎn)過(guò)程上游構(gòu)建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)（發(fā)酵工程）純化制備

2.生產(chǎn)過(guò)程上游構(gòu)建發(fā)酵生產(chǎn)純化制備104一、構(gòu)建過(guò)程示意圖①②③④⑤⑥①?gòu)募?xì)胞中分離出目的DNA②限制酶截取DNA片斷③分離表達(dá)載體（質(zhì)粒等）④DNA重組⑤用重組后的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞⑥培養(yǎng)宿主細(xì)胞克隆大量基因一、構(gòu)建過(guò)程示意圖①②③④⑤⑥①?gòu)募?xì)胞中分離出目的DNA②限1051.載體（Vector）的選擇種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。選擇標(biāo)準(zhǔn)：

能自主復(fù)制；

具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；

有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）；

分子量小，以容納較大的外源DNA。1.載體（Vector）的選擇種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒106

質(zhì)粒（Plasmid）

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。質(zhì)粒107--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料108--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料109--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料110

原核表達(dá)體系：如大腸桿菌（E.coli

）等2.表達(dá)體系的選擇

優(yōu)點(diǎn)：

強(qiáng)啟動(dòng)子,表達(dá)量大 翻譯調(diào)控序列 生產(chǎn)簡(jiǎn)單

不足：缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制 缺乏翻譯后加工機(jī)制 表達(dá)產(chǎn)物形成不溶性包涵體 很難表達(dá)大量可溶性蛋白2.表達(dá)體系的選擇不足：缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制111

優(yōu)點(diǎn)：可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)一般具有天然活性 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)積累真核表達(dá)體系

如酵母、昆蟲(chóng)及哺乳類動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)酵母菌的結(jié)構(gòu) 真核表達(dá)體系缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)酵母菌的結(jié)構(gòu)112二、發(fā)酵的一般過(guò)程

發(fā)酵工藝多種多樣，但基本上包括以下三個(gè)過(guò)程:

發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)示意圖

1、菌種制備

2、種子擴(kuò)大培養(yǎng)

3、大規(guī)模罐批培養(yǎng)二、發(fā)酵的一般過(guò)程 發(fā)酵工藝多種多樣，但基本113三、下游加工過(guò)程

從發(fā)酵液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程稱為發(fā)酵生產(chǎn)的下游加工過(guò)程。它是生產(chǎn)過(guò)程中最重要、成本費(fèi)用最高的環(huán)節(jié)。至今高效液相色譜仍是最常用的手段。一般可分為四個(gè)階段：

1、發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離

2、提取

3、精制

4、成品加工三、下游加工過(guò)程從發(fā)酵液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的114--疫苗2-新型疫苗(生物制品課件)培訓(xùn)材料115

116

117基因工程疫苗第一節(jié)基因工程亞單位疫苗第二節(jié)基因工程載體疫苗第三節(jié)核酸疫苗第四節(jié)基因缺失活疫苗第五節(jié)蛋白工程疫苗第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)基因工程疫苗第一節(jié)基因工程亞單位疫苗118第一節(jié)基因工程亞單位疫苗一、定義二、抗原基因的選擇三、表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié)基因工程亞單位疫苗一、定義119一、定義：

又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，主要指將病原微生物的抗原基因用分子生物學(xué)的方法分離，然后與載體DNA相連接，在經(jīng)載體將抗原基因帶進(jìn)受體進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，最后將基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原分離純化后制成疫苗。一、定義：120二、抗原基因的選擇1、一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因2、對(duì)于易變異的病毒（如HA）則應(yīng)選擇各亞型共有的核心蛋白的主要保護(hù)性抗原基因3、一般選擇兩種以上的抗原基因構(gòu)建重組體二、抗原基因的選擇1、一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因121三、表達(dá)系統(tǒng)1、種類：大腸桿菌：BL21枯草桿菌:酵母細(xì)胞:畢赤酵母昆蟲(chóng)細(xì)胞：SF9哺乳細(xì)胞：CHO、轉(zhuǎn)基因植物:番茄、馬鈴薯、香蕉轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:牛三、表達(dá)系統(tǒng)1、種類：122三、表達(dá)系統(tǒng)2、表達(dá)系統(tǒng)選擇的依據(jù)（1）表達(dá)抗原的免疫原性強(qiáng)弱—蛋白翻譯后修飾哺乳細(xì)胞〉酵母細(xì)胞〉大腸桿菌（2）表達(dá)效率的高低大腸桿菌〉酵母細(xì)胞〉哺乳細(xì)胞（3）表達(dá)產(chǎn)物純化的難易程度表達(dá)量越大越容易純化帶標(biāo)簽的容易純化三、表達(dá)系統(tǒng)2、表達(dá)系統(tǒng)選擇的依據(jù)123基因工程亞單位疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):與傳統(tǒng)疫苗相比，安全性較好缺點(diǎn)：免疫效果價(jià)差增強(qiáng)免疫原性的方法：調(diào)整基因組合，使其表達(dá)成顆粒結(jié)構(gòu)在體外將抗原聚團(tuán)化，如包入脂質(zhì)體或膠囊微球加入有免疫增強(qiáng)作用的化合物作為佐劑基因工程亞單位疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):與傳統(tǒng)疫苗相比，安全性較好124第二節(jié)基因工程載體疫苗一、定義：利用微生物作載體，將保護(hù)性抗原基因重組到微生體中，利用這種能表達(dá)保護(hù)性抗原基因的重組微生物制成的疫苗，稱載體疫苗。二、分類以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗以病毒為載體的基因工程疫苗第二節(jié)基因工程載體疫苗一、定義：1251、以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗減毒的沙門氏菌和卡介苗是最重要的和用途最廣的載體；前者能誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，后者以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主。減毒沙門氏菌載體傷寒沙門氏菌是一種腸道致病菌。美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床的傷寒Ty21a減毒活疫苗顯示了很好的安全性和免疫原性。至今已有結(jié)核桿菌、霍亂弧菌、乙肝、流感、和血吸蟲(chóng)等數(shù)十種病原微生物的外源基因在沙門氏菌的減毒活疫苗中獲得了不同程度的表達(dá)。1、以細(xì)菌為載體的基因工程疫苗減毒的沙門氏菌和卡介苗是最重要126卡介苗載體：卡介苗的使用已有半個(gè)世紀(jì)，全世界已有40多億人接種過(guò)卡介苗，誘導(dǎo)的反應(yīng)可長(zhǎng)達(dá)5-50年。是理想的表達(dá)載體。但是臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，主要原因是卡介苗本身會(huì)刺激接種者產(chǎn)生很強(qiáng)的針對(duì)分枝桿菌的免疫反應(yīng)?？ń槊巛d體：1272、以病毒為載體的基因工程疫苗可視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋白質(zhì)疫苗的結(jié)合。主要有：痘病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、和單純皰疹病毒。2、以病毒為載體的基因工程疫苗可視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋1281、痘病毒優(yōu)點(diǎn)：（1）安全性好，是人類使用了近200年的最為安全的疫苗；（2）宿主廣泛，能感染多種類型的細(xì)胞；（3）插入外源基因的容量大，可插入20kDa的外源基因。（4）易培養(yǎng)，病毒自身的耐熱性強(qiáng)和容易獲得高效價(jià)的培養(yǎng)特點(diǎn)。缺點(diǎn)：雖然已有很多牛痘基因工程疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但還有很多問(wèn)題需要克服，如不能口服，接種過(guò)天花疫苗的人有預(yù)存免疫等問(wèn)題。1、痘病毒優(yōu)點(diǎn)：1292、腺病毒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：預(yù)存免疫2、腺病毒優(yōu)點(diǎn)：130第三節(jié)核酸疫苗核酸疫苗的研究背景構(gòu)建核酸疫苗的基本要素——目的基因和載體核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)第三節(jié)核酸疫苗核酸疫苗的研究背景131核酸疫苗的研究背景1992年，Tang等給小鼠直接注射含有人生長(zhǎng)素基因的質(zhì)粒DNA，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了針對(duì)人生長(zhǎng)激素的抗體，標(biāo)志著核酸疫苗的出現(xiàn)。1994年，開(kāi)始，美國(guó)FDA已陸續(xù)批準(zhǔn)了艾滋病、流感、乙肝、單純皰疹病毒、瘧疾和癌胚抗原等核酸疫苗進(jìn)入臨床。1995年美國(guó)紐約科學(xué)院召開(kāi)會(huì)議專門研討DNA疫苗，稱之為疫苗學(xué)的新紀(jì)元和疫苗的第三次革命核酸疫苗的研究背景1992年，Tang等給小鼠直接注射含有人132構(gòu)建核酸疫苗的基本要素1、目的基因可以是針對(duì)某一抗原的單基因片段或基因的cDNA,也可以是一組基因、多個(gè)基因（多重抗原性基因）或嵌合型基因。是核酸疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素。構(gòu)建核酸疫苗的基本要素1、目的基因133構(gòu)建核酸疫苗的基本要素2、DNA疫苗的載體（1）可以克隆外源基因的多重限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（2）具有真核細(xì)胞啟動(dòng)子（3）具有CpG核苷酸基序（4）具有用于選擇的標(biāo)記最好卡那霉素，氨卡青霉素有預(yù)存免疫（5）具有能在大腸桿菌中復(fù)制的基因構(gòu)建核酸疫苗的基本要素2、DNA疫苗的載體134核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（1）免疫保護(hù)力增強(qiáng)。CTL應(yīng)答是機(jī)體殺死癌變細(xì)胞的有效清除途徑。腫瘤基因疫苗接種機(jī)體后，其表達(dá)的內(nèi)源性抗原有利于MHC-Ⅰ類分子的抗原提呈和CTL的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫，并促進(jìn)體液免疫功能的加強(qiáng)，從而預(yù)防和免疫治療腫瘤。（2）產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答，腫瘤DNA疫苗可在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，持續(xù)的刺激免疫系統(tǒng)，使其抗瘤作用持久存在，在腫瘤的治療和預(yù)防上均有著廣闊的前景。（3）有很好的可控性，其誘生的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向性，可通過(guò)改變接種方法和部位、質(zhì)粒中的免疫刺激序列以及細(xì)胞因子和共刺激分子基因的同時(shí)使用等進(jìn)行調(diào)整，可將多個(gè)抗原表位基因克隆在同一表達(dá)載體而制備成多價(jià)疫苗的特點(diǎn)，是常規(guī)疫苗無(wú)法比擬的。核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（1）免疫保護(hù)力增強(qiáng)。CTL應(yīng)答是機(jī)體殺死癌變135核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（4）腫瘤DNA疫苗具有制備容易、生產(chǎn)成本低廉、可批量生產(chǎn)。（5）質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，便于貯存和運(yùn)輸，無(wú)須冷藏、使用方法簡(jiǎn)單，有利于將來(lái)的推廣應(yīng)用。（6）安全性好，由于基因疫苗一般采用表達(dá)載體在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行抗原表達(dá)，不與宿主染色體DNA整合。因此與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗的應(yīng)用性和可操作性都大為增強(qiáng)。核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)（4）腫瘤DNA疫苗具有制備容易、生產(chǎn)成本低廉136第四節(jié)基因缺失活疫苗就是應(yīng)用基因操作技術(shù)，將病原微生物中與致病性有關(guān)的毒力序列除去或關(guān)閉，使之成為無(wú)毒株或弱毒株，但仍保持有良好的免疫原性，從而制成安全有效的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：與自然減毒株相比，基因缺失突變株具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易返租等優(yōu)點(diǎn)。第四節(jié)基因缺失活疫苗就是應(yīng)用基因操作技術(shù)，將病原微生物中與137第五節(jié)蛋白質(zhì)工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變、插入、缺失等構(gòu)型改變，甚至進(jìn)行不同基因或部分結(jié)構(gòu)域的人工組合，以增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性、擴(kuò)大反應(yīng)普、去除有害作用或副反應(yīng)的一類疫苗。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變138第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗目的：通過(guò)導(dǎo)入特定的外源基因來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植物，以改良作物、研究植物基因功能、生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白質(zhì)等。研究的兩個(gè)方面：1、與植物重要生命活動(dòng)有關(guān)的基因或其cDNA的克隆。2、將外源基因?qū)氩⒄系街参锘蚪M以獲得轉(zhuǎn)基因植物。第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物疫苗目的：通過(guò)導(dǎo)入特定的外源基因來(lái)獲得轉(zhuǎn)139一、生產(chǎn)疫苗用轉(zhuǎn)基因植物的選擇作為生產(chǎn)疫苗用的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)有的特點(diǎn)：該植物可以在世界上較多地區(qū)，特別是發(fā)展中國(guó)家種植，并能獲得較高的產(chǎn)量；容易該嬰幼兒喂服，并能被家長(zhǎng)們接受；作為疫苗的植物，其可食部分必須是可生食的含有較高的蛋白質(zhì)含量。一、生產(chǎn)疫苗用轉(zhuǎn)基因植物的選擇作為生產(chǎn)疫苗用的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)有1401、煙草優(yōu)勢(shì)：是植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的模式生物，易獲得轉(zhuǎn)基因植物；蛋白質(zhì)含量豐富，可通過(guò)純化技術(shù)獲得；劣勢(shì)：但含有個(gè)尼古丁等有害物質(zhì)1、煙草優(yōu)勢(shì)：1412、馬鈴薯優(yōu)勢(shì)：馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，在很短的時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物；馬鈴薯可使用的塊莖組織特異性啟動(dòng)子已被克隆，可使外源基因在塊莖內(nèi)特異的大量表達(dá)；馬鈴薯的組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)業(yè)已成熟，可以供應(yīng)大量遺傳背景一致的種苗；馬鈴薯可以被很多動(dòng)物食用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不成問(wèn)題。劣勢(shì)：馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量較低，人類無(wú)生食馬鈴薯的習(xí)慣。2、馬鈴薯優(yōu)勢(shì)：1423、香蕉優(yōu)勢(shì)：在東南亞、非洲、印度次大陸、河南美等發(fā)展中國(guó)家被大量種植，價(jià)格非常便宜；香蕉的蛋白質(zhì)含量較高，一個(gè)香蕉可以給10個(gè)嬰兒接種免疫可以口服。劣勢(shì)：香蕉的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究尚待進(jìn)一步完善，至今還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因香蕉種植成功的報(bào)道。3、香蕉優(yōu)勢(shì)：143二、轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)越性1、植物具有全能性。2、植物細(xì)胞具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行反以后修飾和加工，與高等等動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗原具有一致的免疫原性及生物學(xué)活性。3、可誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。黏膜免疫是人體的第一道屏障。4、生產(chǎn)簡(jiǎn)單，成本低廉。陽(yáng)光和土地5、接種簡(jiǎn)單。可口服6、安全。本質(zhì)即食物，安全可靠。二、轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)越性1、植物具有全能性。144三、目前在研的幾種主要的轉(zhuǎn)基因植物疫苗主要研究方向：利用植物作為工廠來(lái)生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)抗原，然后經(jīng)過(guò)分離和提純，在制備成疫苗；不需要分離提純，將植物或其某部分作為可以直接口服的疫苗。三、目前在研的幾種主要的轉(zhuǎn)基因植物疫苗主要研究方向：1451、非直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗1）乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因植物疫苗基因插入質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后在轉(zhuǎn)入煙草，顆粒為22nm，與人血清中的類似，而酵母表達(dá)的顆粒為17nm。2）諾瓦克病毒衣殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物疫苗諾瓦克病毒是能引起腹瀉的病原體，每年造成300萬(wàn)兒童死亡。用煙草表達(dá)量可達(dá)煙草的0.23%3）狂犬病毒糖蛋白轉(zhuǎn)基因植物疫苗McGarvey等在番茄中表達(dá)的狂犬病毒表面糖蛋白，能與病毒天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體形成免疫沉淀，并在小鼠中測(cè)到了中和抗體。1、非直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗1）乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因植物疫1462、直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗大腸桿菌腸毒素植物疫苗結(jié)核轉(zhuǎn)基因植物疫苗把結(jié)核桿菌分泌性蛋白質(zhì)MPT-64和ESET-6的基因?qū)霟煵?、黃瓜、番茄和胡蘿卜的研究正在進(jìn)行中。其中MPT-64蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)在番茄中獲得了表達(dá)。動(dòng)物傳染病的轉(zhuǎn)基因植物疫苗Carrillo等報(bào)道了將編碼家畜口蹄疫病單獨(dú)結(jié)構(gòu)基因VP1的基因轉(zhuǎn)入到植物擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植物葉子的提取物能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，能保護(hù)小鼠地抵抗口蹄疫病毒的襲侵襲。2、直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗大腸桿菌腸毒素植物疫苗147四、轉(zhuǎn)基因植物存在的問(wèn)題1、產(chǎn)生免疫保護(hù)所需的具體劑量不清楚2、如何去除轉(zhuǎn)基因植物帶中的抗生素3、植物細(xì)胞壁的天然生物膠囊作用雖然能避免植物疫苗在消化道中過(guò)早被降解，但如果久久不能被釋放也是致命的缺點(diǎn)。尋找一個(gè)最佳平衡點(diǎn)，是植物疫苗在最適合的部位發(fā)揮作用也是今后研究的方向。四、轉(zhuǎn)基因植物存在的問(wèn)題1、產(chǎn)生免疫保護(hù)所需的具體劑量不清楚148第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)一、基因疫苗的優(yōu)越性二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)第七節(jié)基因工程疫苗的優(yōu)越性及其發(fā)展重點(diǎn)149一、基因疫苗的優(yōu)越性1、安全性2、經(jīng)濟(jì)效益一、基因疫苗的優(yōu)越性1、安全性150二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)1、主要研究常規(guī)技術(shù)不能決絕或很難解決的新疫苗2、積極進(jìn)行傳統(tǒng)疫苗的改造3、加強(qiáng)治療性疫苗的研究4、發(fā)展多價(jià)疫苗二、基因工程疫苗發(fā)展的重點(diǎn)1、主要研究常規(guī)技術(shù)不能決絕或很難151第三章基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制第三節(jié)純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制第四節(jié)目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制第三章基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制152意義

利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。意義利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜153

宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過(guò)程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中154第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制

原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。第一節(jié)原材料的質(zhì)量控制155

根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：⒈明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下156⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動(dòng)子）的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；⒊應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如157⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中啟動(dòng)與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合158第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制

在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定； 始終能排除外源微生物污染。第二節(jié)培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求159

生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含160

原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)161

對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性