MLPA技術(shù)原理2解讀課件

MLPA技術(shù)原理

MLPA

技術(shù)原理王曉琳 MLPA技術(shù)原理王曉琳1

2002年，荷蘭科學(xué)家發(fā)明了一種名為多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex

ligation-dependent

probe

amplification，MLPA)的高通量的基因檢測方法，該技術(shù)利用核酸雜交、連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以在同一反應(yīng)管內(nèi)對多達(dá)45種不同的核苷酸序列進(jìn)行檢測和定量分析。

MLPA

技術(shù)原理 MLPA技術(shù)原理2

該技術(shù)主要包括：探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴(kuò)增和結(jié)果的檢測分析。針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，其由一個(gè)短的寡核苷酸片段（短探針）和一個(gè)長的寡核苷酸片段（長探針）組成。該技術(shù)的特色之一是僅擴(kuò)增連接完好的探針，而不是擴(kuò)增樣本靶序列。

MLPA

技術(shù)原理 MLPA技術(shù)原理3

該技術(shù)的擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅需2條引物，一是引物GP1，另一是引物GP2。在所有短探針的5’端均有一段共同序列，該序列與引物GP1的核酸序列相同；在所有長探針的3’端均有一段共同序列，該序列與引物GP2的核酸序列互補(bǔ)?？梢?，所有連接探針的PCR擴(kuò)增用的是同一對引物。MLPA

技術(shù)原理該技術(shù)的擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅需2條引物，一是引物4

若兩探針連接，則擴(kuò)增可進(jìn)行；而若兩探針未連接，則擴(kuò)增無法進(jìn)行。各長探針在共同序列和與靶序列互補(bǔ)的序列間有不同長度的填充片段，該片段長度不同使連接后的MLPA探針長度不同，故其擴(kuò)增片段長度亦不同。一般相臨兩產(chǎn)物的長度相差6～8bp，因此可同時(shí)檢測基因組的多種不同靶基因。擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測分析比對，得出結(jié)論。MLPA

技術(shù)原理若兩探針連接，則擴(kuò)增可進(jìn)行；而若兩探針未連接5MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理6MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理7MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理8MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理9MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理10

多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)的特點(diǎn)，且發(fā)揚(yáng)了其連接依賴的特色，優(yōu)點(diǎn)如下：MLPA

技術(shù)原理Add

Your

Text多種靶基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測所需樣本量小，最少僅需20ngDNA即可完成檢測檢測方法靈活

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Text檢測精確度高，能夠檢測出單個(gè)堿基的突變或SNP及基因拷貝數(shù)

一倍量的增加或減少可實(shí)現(xiàn)多重分析，同時(shí)對耗時(shí)短，24h內(nèi)即可出結(jié)果自動(dòng)化程度高

MLPA6

大優(yōu)點(diǎn)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技11MLPA

技術(shù)原理LOPMTM-MLPA實(shí)驗(yàn)的3

個(gè)步驟：

MLPA

LOPMTM

針對目標(biāo)序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關(guān)的模板UT（UnrelatedTemplate），如質(zhì)粒等設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，其中的一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得特異長度的生物素標(biāo)記的核酸序列，利用親和素磁珠進(jìn)行純化，最終獲得單鏈寡核苷酸（非生物素標(biāo)記），從而制備獲得長度特異的寡核苷酸單鏈。

針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，由一個(gè)短的化學(xué)合成寡核苷酸片段和一個(gè)長的通過磁珠法制備的寡核苷酸片段組成。檢測時(shí)先使待測雙鏈DNA變性解鏈，加入連接酶，調(diào)節(jié)連接溫度。若待測核酸中含有靶序列，則兩個(gè)探針與待測核酸互補(bǔ)良好，連接反應(yīng)可進(jìn)行，反之，若其中一條探針的序列與待測靶基因序列不完全互補(bǔ)，甚至只有一個(gè)堿基不互補(bǔ)，也會(huì)使雜交不完全而使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。結(jié)果檢測★瓊脂糖凝膠電泳★PAGE★毛細(xì)管電泳★固相芯片法★液相芯片法★DHPLCMLPA技術(shù)原理LOPMTM-MLPA實(shí)驗(yàn)的3個(gè)步驟：12MLPA

技術(shù)原理

針對目標(biāo)序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關(guān)的模板U（UnrelatedTemplate），如質(zhì)粒等設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，其中的一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得特異長度的生物素標(biāo)記的核酸序列，利用親和素磁珠進(jìn)行純化，最終獲得單鏈寡核苷酸（非生物素標(biāo)記），從而制備獲得長度特異的寡核苷酸單鏈。LOPMTMMLPA技術(shù)原理 LOPMTM13MLPA

技術(shù)原理針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，由一個(gè)短的化學(xué)合成寡核苷酸片段和一個(gè)長的通過磁珠法制備的寡核苷酸片段組成。檢測時(shí)先使待測雙鏈DNA變性解鏈，加入連接酶，調(diào)節(jié)連接溫度。若待測核酸中含有靶序列，則兩個(gè)探針與待測核酸互補(bǔ)良好，連接反應(yīng)可進(jìn)行，反之，若其中一條探針的序列與待測靶基因序列不完全互補(bǔ)，甚至只有一個(gè)堿基不互補(bǔ)，也會(huì)使雜交不完全而使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。MLPA技術(shù)原理針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLP14MLPA

技術(shù)原理★瓊脂糖凝膠電泳★PAGE★毛細(xì)管電泳★固相芯片法★液相芯片法★DHPLCMLPA技術(shù)原理★瓊脂糖凝膠電泳15

MLPA技術(shù)原理

MLPA

技術(shù)原理王曉琳 MLPA技術(shù)原理王曉琳16

2002年，荷蘭科學(xué)家發(fā)明了一種名為多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex

ligation-dependent

probe

amplification，MLPA)的高通量的基因檢測方法，該技術(shù)利用核酸雜交、連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以在同一反應(yīng)管內(nèi)對多達(dá)45種不同的核苷酸序列進(jìn)行檢測和定量分析。

MLPA

技術(shù)原理 MLPA技術(shù)原理17

該技術(shù)主要包括：探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴(kuò)增和結(jié)果的檢測分析。針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，其由一個(gè)短的寡核苷酸片段（短探針）和一個(gè)長的寡核苷酸片段（長探針）組成。該技術(shù)的特色之一是僅擴(kuò)增連接完好的探針，而不是擴(kuò)增樣本靶序列。

MLPA

技術(shù)原理 MLPA技術(shù)原理18

該技術(shù)的擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅需2條引物，一是引物GP1，另一是引物GP2。在所有短探針的5’端均有一段共同序列，該序列與引物GP1的核酸序列相同；在所有長探針的3’端均有一段共同序列，該序列與引物GP2的核酸序列互補(bǔ)?？梢?，所有連接探針的PCR擴(kuò)增用的是同一對引物。MLPA

技術(shù)原理該技術(shù)的擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅需2條引物，一是引物19

若兩探針連接，則擴(kuò)增可進(jìn)行；而若兩探針未連接，則擴(kuò)增無法進(jìn)行。各長探針在共同序列和與靶序列互補(bǔ)的序列間有不同長度的填充片段，該片段長度不同使連接后的MLPA探針長度不同，故其擴(kuò)增片段長度亦不同。一般相臨兩產(chǎn)物的長度相差6～8bp，因此可同時(shí)檢測基因組的多種不同靶基因。擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測分析比對，得出結(jié)論。MLPA

技術(shù)原理若兩探針連接，則擴(kuò)增可進(jìn)行；而若兩探針未連接20MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理21MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理22MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理23MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理24MLPA

技術(shù)原理MLPA技術(shù)原理25

多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)的特點(diǎn)，且發(fā)揚(yáng)了其連接依賴的特色，優(yōu)點(diǎn)如下：MLPA

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Text多種靶基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測所需樣本量小，最少僅需20ngDNA即可完成檢測檢測方法靈活

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Text檢測精確度高，能夠檢測出單個(gè)堿基的突變或SNP及基因拷貝數(shù)

一倍量的增加或減少可實(shí)現(xiàn)多重分析，同時(shí)對耗時(shí)短，24h內(nèi)即可出結(jié)果自動(dòng)化程度高

MLPA6

大優(yōu)點(diǎn)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技26MLPA

技術(shù)原理LOPMTM-MLPA實(shí)驗(yàn)的3

個(gè)步驟：

MLPA

LOPMTM

針對目標(biāo)序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關(guān)的模板UT（UnrelatedTemplate），如質(zhì)粒等設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，其中的一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得特異長度的生物素標(biāo)記的核酸序列，利用親和素磁珠進(jìn)行純化，最終獲得單鏈寡核苷酸（非生物素標(biāo)記），從而制備獲得長度特異的寡核苷酸單鏈。

針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，由一個(gè)短的化學(xué)合成寡核苷酸片段和一個(gè)長的通過磁珠法制備的寡核苷酸片段組成。檢測時(shí)先使待測雙鏈DNA變性解鏈，加入連接酶，調(diào)節(jié)連接溫度。若待測核酸中含有靶序列，則兩個(gè)探針與待測核酸互補(bǔ)良好，連接反應(yīng)可進(jìn)行，反之，若其中一條探針的序列與待測靶基因序列不完全互補(bǔ)，甚至只有一個(gè)堿基不互補(bǔ)，也會(huì)使雜交不完全而使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。結(jié)果檢測★瓊脂糖凝膠電泳★PAGE★毛細(xì)管電泳★固相芯片法★液相芯片法★DHPLCMLPA技術(shù)原理LOPMTM-MLPA實(shí)驗(yàn)的3個(gè)步驟：27MLPA

技術(shù)原理

針對目標(biāo)序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關(guān)的模板U（UnrelatedTemplate），如質(zhì)粒等設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，其中的一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得特異長度的生物素標(biāo)記的核酸序列，利用親和素磁珠進(jìn)行純化，最終獲得單鏈寡核苷酸（非生物素標(biāo)記），從而制備獲得長度特異的寡核苷酸單鏈。LOPMTMMLPA技術(shù)原理 LOPMTM28MLPA

技術(shù)原理針對每一個(gè)待測靶基因序列，均有一對MLPA探針，由一個(gè)短的化學(xué)合成寡核苷酸片段和一個(gè)長的通過磁珠法制備的寡核苷酸片段組成。檢測時(shí)先使待測雙鏈DNA變性解鏈，加