細(xì)胞中eIF-5A定位的方法研究

.PAGE*;;細(xì)胞中eIF-5A定位的方法研究項(xiàng)目完成單位：國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心項(xiàng)目完成人：周濤靳寶鋒楊怡李慧艷張颯張德添張學(xué)敏一、立題依據(jù)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步進(jìn)行了細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的研究。以對(duì)阻斷泛素-蛋白酶體通路(簡(jiǎn)稱UPS通路)極為敏感的白血病細(xì)胞系M-07e為模型，用泛素-蛋白酶體通路特異阻斷劑Z-TL-CHO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡前后雙向電泳上T蛋白點(diǎn)的表達(dá)量顯著增加，經(jīng)生物質(zhì)譜鑒定T蛋白點(diǎn)就是eIF-5A。這說(shuō)明M-07e細(xì)胞凋亡過(guò)程中，eIF-5A被誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與了細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。那么，被誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)量的eIF-5A定位在細(xì)胞的什么位置？在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中定位有無(wú)變化？如有，是如何變化的？總量上又是如何變化的?這都是需要解決的問(wèn)題。eIF-5A的亞細(xì)胞定位雖有報(bào)道，但結(jié)果不一致，相互沖突。如：RuhlM等認(rèn)為eIF-5A定位于細(xì)胞核，RosoriusO等人則進(jìn)一步精確定位至細(xì)胞核的核孔復(fù)合物上，shiXP等認(rèn)為eIF-5A主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而Jao和Chen等則認(rèn)為eIF-5A為全細(xì)胞分布。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的定位信息將為其功能的研究提供重要線索，因此我們同時(shí)采用了間接免疫熒光、熒光蛋白標(biāo)記等方法進(jìn)行eIF-5A亞細(xì)胞定位的研究。解決蛋白定位的問(wèn)題，比較常用的是間接免疫熒光標(biāo)記和免疫膠體金技術(shù)，近年來(lái)發(fā)展了利用綠色熒光蛋白(GFP)來(lái)示蹤胞內(nèi)蛋白的技術(shù)。間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)因?yàn)槭窃诠忡R水平進(jìn)行研究，因此無(wú)法進(jìn)行精確的亞細(xì)胞定位。而免疫膠體金技術(shù)則因?yàn)橹茦舆^(guò)程繁瑣復(fù)雜，非特異性標(biāo)記較高，且重復(fù)性差。利用GFP融合蛋白技術(shù)來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞定位研究是目前較為通行的一種方法，但仍是在光鏡水平進(jìn)行研究，只是不需要制樣，沒(méi)有非特異性標(biāo)記的影響。并且GFP的分子量為27kD，eIF-5A的分子量為16～18kD，若利用GFP來(lái)定位，是否對(duì)eIF-5A的定位有干擾還不清楚，因此我們必須尋找更好的定位分析方法。最近，美國(guó)圣迭哥大學(xué)Griffin,BA等合成了一種有機(jī)砷的化合物FlAsH，與特定的能形成α-螺旋的含4個(gè)半胱氨酸殘基的肽段結(jié)合后，可發(fā)射熒光。這種肽段一般只需要十幾個(gè)氨基酸殘基，但其核心區(qū)域必須是-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-。此外其衍生物中可發(fā)紅色熒光的ReAsH相對(duì)于FlAsH來(lái)說(shuō)，還有另外一個(gè)特點(diǎn)，即在有氧情況下，可對(duì)二氨基聯(lián)苯(DAB)發(fā)生光轉(zhuǎn)化反應(yīng)，經(jīng)激光掃描共聚集顯微鏡高強(qiáng)度激光照射后，可產(chǎn)生一種電鏡下可觀察的褐色產(chǎn)物，從而將激光掃描共聚焦顯微鏡與電鏡有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定位。利用FlAsH和ReAsH可發(fā)射不同顏色熒光，又都是與同樣的肽段相結(jié)合的特點(diǎn)，可以在不同的時(shí)相對(duì)細(xì)胞內(nèi)該蛋白進(jìn)行脈沖追蹤，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白生命周期的觀察。激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,以下簡(jiǎn)稱共聚焦顯微鏡）因其獨(dú)特的設(shè)計(jì)原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及對(duì)比度，使圖像更為精確清晰，因此極其適于進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等定位及活體動(dòng)態(tài)研究。二、主要研究?jī)?nèi)容1．真核表達(dá)載體的構(gòu)建①引物設(shè)計(jì)利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)FlAsH試劑所需的結(jié)構(gòu)，選定肽段Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala，根據(jù)此肽段并按照所需構(gòu)建的載體酶切位點(diǎn)的要求，設(shè)計(jì)如下引物：1．TCGAGGCTGAGGCTGCCGCCCGCGAGGCTTGCTGCCGCGAGTGCTGTGCCAGG2．CCGACTCCGACGGCGGGCGCTCCGCACGACGGCGCTCACGACACGGTCCGCCTAATGATCGGATTACTAGATC這1對(duì)序列通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬檢索，引物自身無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且引物之間不形成二聚體。其中上游TCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，下游T為XbaICAGATC酶切位點(diǎn)。②載體構(gòu)建將以上合成引物退火后裝入pcDNA3.0載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，并將pEGFP-N1/eIF-5A用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，把BamHI-eIF-5A-HindIII片段連入已構(gòu)建好pcDNA3.0/FlAsH，得到表達(dá)eIF-5A-FlAsH肽段融合蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體。2．免疫熒光檢測(cè)將均勻種植在玻片上的COS-7和HEK293細(xì)胞，用PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定4℃30min，PBS洗3遍。0.2%TritonX-100-PBS5min。10%的小牛血清封閉（PBS稀釋），37℃30min。PBS洗后，加入eIF-5A抗體（1:500），4℃過(guò)夜。PBS洗3遍。加羊抗兔IgG-FITC（1:50），室溫30min，PBS洗后用激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。3．轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞因?yàn)橐陨蟚IF-5A-FlAsH載體表達(dá)后的融合蛋白質(zhì)尚缺少合適的檢測(cè)方法，因此先用pEGFP-N1/eIF-5A進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件的探索。當(dāng)cos7或293T細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，接種到共聚焦顯微鏡專用的玻璃底培養(yǎng)皿（35mmpetridish，10mmMicrowell）中，培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到30%~50%時(shí)，將表達(dá)載體質(zhì)粒2ug和脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)2l分別溶于100l無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫放置15min，再將兩種溶液充分混勻，室溫放置30min。同時(shí)用無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM洗滌待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞2~3次，向DNA-脂質(zhì)體混合物中加入800l無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，混合后加入到培養(yǎng)細(xì)胞中。培養(yǎng)皿放入37℃孵箱孵育6~8hr后吸去雙無(wú)培養(yǎng)液，加入2~3ml含抗生素和10%FCS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24~72hr。4．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察將上述細(xì)胞分別在24、、36、48、72小時(shí)用共焦顯微鏡觀察，采用Bio-Rad公司Radiance2100?激光掃描共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)為Arion激光器488nm，發(fā)射濾片選用HQ515/30帶通濾片。采集軟件是LaserSharp2000，采集時(shí)均選取一系列光學(xué)切片中熒光強(qiáng)度最大的一幅圖像，采集條件如下：Laser488nm，Power16.3%，Iris2.2，Gain20.2,black1.6。5．電鏡原位制樣及觀察原位包埋法：如原位特定細(xì)胞培養(yǎng)在35mm塑料培養(yǎng)皿或6孔板中，將細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行固定、脫水、浸透、包埋和聚合。細(xì)胞面朝上與液體直接接觸。在光鏡下先選好被觀察的細(xì)胞區(qū)域然后再包埋。由于樣品很薄，塊面修成0.1×0.2mm長(zhǎng)方形。切片前應(yīng)盡量修去多余的樹(shù)脂，以便切片和觀察。聚合后的樣品塊必須先定位再修塊。三、結(jié)果與討論1.成功構(gòu)建FlAsH標(biāo)簽質(zhì)粒，并將eIF-5A片段裝入標(biāo)簽上游，酶切結(jié)果顯示與預(yù)期的長(zhǎng)度一致（圖略）。2.利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)eIF-5A蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。在激光共聚焦顯微鏡下，COS-7和HEK293細(xì)胞輪廓清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的熒光染色明顯，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)明顯的熒光染色，表明eIF-5A定位于胞漿中。ABAB圖1免疫熒光檢測(cè)eIF-5A亞細(xì)胞定位A：COS-7細(xì)胞；B：HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間(hr)24364872GFPGFP-eIF5A圖2hypusine對(duì)eIF-5A的亞細(xì)胞定位的影響只定位在細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞(%)轉(zhuǎn)染時(shí)間(hr)243648