植物組織培養(yǎng)技術(shù)一

關(guān)于植物組織培養(yǎng)技術(shù)一第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)簡介

定義：離體（invitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日

植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，近三十年來由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，發(fā)表的文獻浩如煙海，幾乎以植物為研究對象的各個分支學(xué)科都在廣泛進行組織培養(yǎng)。

第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日發(fā)展簡史1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide和Schwann發(fā)表了細胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt根據(jù)細胞學(xué)說，提出單個細胞的植物細胞全能性（totipotency）理論。

1904年，Hanning最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。

1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。

1934年，White用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。

1958年，英國科學(xué)家Steward等用胡蘿卜根的愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細胞全能性理論得到證實，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。

1962年，Murashinge和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。

1964-1966年，印度科學(xué)家Guha和Maheswari在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。

1972年，Carlson通過兩個種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個體細胞雜交的雜種植株。……

第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用領(lǐng)域

1、快速繁殖運用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖到400萬株。

2、種苗脫毒針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。

3、遠緣雜交利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。比如遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。

4、突變育種采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。象中國林科院用逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。

5、基因工程基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。

6、生物制品有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物--紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞來直接生產(chǎn)。近年國內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得生長量高達0.49gFW/（gFW·d）的細胞系，每升細胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達0.25mg。

第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)的分類外植體（explant)：由活體（invivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細胞、組織、器官等。廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為：器官培養(yǎng)（organculture）、莖尖分生組織培養(yǎng)(shoottipculture,shootapexculture,apicalmeristemculture)、愈傷組織培養(yǎng)(callusecultrue)、細胞培養(yǎng)(cellculture)、原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplastculture)愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團無序生長狀態(tài)的薄壁細胞。第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日返回第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日返回第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)——

植物細胞的全能性植物細胞的全能性（totipotent)：植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。原理：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細胞都應(yīng)該具有全能性。差異：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的細胞中，體細胞的全能性比生殖細胞的低。潛在全能性的原因：基因表達的選擇性科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物細胞全能性的表達

脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細胞的分裂活性。再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細胞類型的能力。第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日離體的植物器官、組織、細胞脫分化愈傷組織再分化根芽植物體植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)條件：

含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時光照等。第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)特點①培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。②生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往20—30d為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。

③管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。

第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二章組織培養(yǎng)實驗技術(shù)

第一節(jié)

實驗室在進行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實驗室。實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室時，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來沒計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日1實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。2實驗室組成：化學(xué)實驗室、洗滌菌室、無菌操作室（接種室）、培養(yǎng)室、細胞學(xué)實驗室。第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日

化學(xué)實驗室（準(zhǔn)備室）：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.

洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設(shè)備：水池、操作臺、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日無菌操作室（接種室）：主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術(shù)程序。主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問，面積1m2為宜。進入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1．7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，如采用40W日光燈，則長I．3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20—27℃左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70%～80%為好，可安裝加濕器?？刂乒庹諘r間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長日照植物需要長日照條件?，F(xiàn)代組培實驗室大多設(shè)計為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補充。主要設(shè)備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日細胞學(xué)實驗室：用于對培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計數(shù)等。主要設(shè)備：雙筒實體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。其他小型儀器設(shè)備：分注器、血球計數(shù)器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺式離心機等。

第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件一、營養(yǎng)條件——培養(yǎng)基(culturemedium)

培養(yǎng)基：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對綠色植物的成分進行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機鹽營養(yǎng)，設(shè)計出了由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的進行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)，也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點如下：(1)MS培養(yǎng)基它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。(2)B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。(3)White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。（4）N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。(5)KM—8P培養(yǎng)基它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。

第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的成分

培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日無機元素(inorganicelement)

大量元素，指濃度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時以NO3—N和NH4—N兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有N03—N又含NH4—N。NH4—N對植物生長較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。有時，也添加氨基酸來補充氮素。(2)P是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。(3)K對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大，一般為1—3mg／L為好。制備培養(yǎng)基時，常以KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和Ca、Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO4·7H20提供。用量為1—3mg／l較為適宜；Ca是構(gòu)成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2·2H2O提供。第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日微量元素指小于0.5mmol／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進作用。在制做培養(yǎng)基時不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO4·7H20和Na2—EDTA結(jié)合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長、發(fā)育異?，F(xiàn)象。第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日有機化合物(organiccompound)

培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基（basicmedium)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機物以利于快速生長。常加入的有機成分主要有以下幾類：第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%，但在胚培養(yǎng)時采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實驗時要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。高壓滅菌時，一部分糖會發(fā)生分解，制定配方時要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日維生素(vitamin)

這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。雖然大多數(shù)的植物細胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上，還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0．1—1．0mg／L。有時用量較高。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日肌醇(myo—inosltol)又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進一步形成磷脂，參與細胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為lOOmg／L，適當(dāng)使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日氨基酸(alminoacide)

是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日天然復(fù)合物其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日1)椰乳是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%—20%，與其果實成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1nun時，椰乳就不發(fā)生作用。2)香蕉用量為150-200ml／L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進作用。3)馬鈴薯(potato)

去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150—200g／L。對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4)水解酪蛋白為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用時要注意。5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0.01%～0.5%)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。

第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日植物生長調(diào)節(jié)物(hormone)

植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動，在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日生長素類(auxin)

在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-5—10-8rng／L)就可促進生長，其次是莖和芽。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。IBA(indolebutyriacid吲哚丁酸)是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。2，4—D(2，4—二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日細胞分裂素類(cytokinin)

這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6—BA(6—芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最強，但非常昂貴，常用的是6—BA。在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長。②促進細胞分裂與擴大。③抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時使用較少或用量較低。第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日GA(gibberellicacid赤霉素)

有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當(dāng)生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。

第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日激素配比模式生長素與細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈傷組織的形成生長素/細胞分裂素適中有利于根芽的分化低有利于芽的形成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細胞分裂素0.05—10mg／L。第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface

Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日NoBAP

BAPreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)材料的支持物瓊脂(agar)

在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40~C即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂的用量在6—10g／L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。

加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物組織或細胞的營養(yǎng)問題時，則應(yīng)避免使用瓊脂。可在液體培養(yǎng)基表面安放一個無菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進行愈傷組織培養(yǎng)。

其他有玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。

第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗生物質(zhì)(antibiotic)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5—20mg/L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時間。尤其對大量通氣長期培養(yǎng)，效果更好。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%—10%的抗菌素?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但是應(yīng)當(dāng)注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，可能某些植物適宜用青霉素，而另一些植物卻不大適應(yīng)。值得提醒的是，在工作中不能以為有了抗菌素，而放松滅菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來造成。第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日活性炭(activecarbon)活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5—l0g／L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5—羥甲基糖醛及激素等。第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日活性炭的應(yīng)用莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進新梢的形成和伸長，但其作用有一個閾值，一般為0.1%—0.2%，不能超過0.2%?；钚蕴吭谏鶗r有明顯的促進作用，其機理一般認為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進根生長的IAA，但IAA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護了IAA，從而間接促進了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強，反過來又促進莖、葉的生長。此外，在培養(yǎng)基中加入0.3%活性