現(xiàn)代儀器分析HPLC課件

本章內(nèi)容介紹第一節(jié)概述第二節(jié)高效液相色譜儀第三節(jié)高效液色譜法的基本理論第四節(jié)各類高效液色譜法第五節(jié)固定相第六節(jié)流動(dòng)相第七節(jié)HPLC分析條件的選擇第八節(jié)定性與定量分析第九節(jié)LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)介第十節(jié)超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介本章內(nèi)容介紹第一節(jié)概述第一節(jié)概述

HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入GC的理論和技術(shù),采用：高速——高壓泵高效——固定相；高靈敏度——檢測(cè)器第一節(jié)概述

HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入GCHPLC與經(jīng)典液相色譜的比較

高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。HPLC與經(jīng)典液相色譜的比較

高速：HPLC和GC的比較流動(dòng)相：

HPLC液體種類多，可選范圍多GC氣體，種類少，改變載氣影響柱效和分離少固定相：

HPLC新型吸附劑，化學(xué)鍵合相，粒度小GC吸附劑，擔(dān)體+吸附劑，粒度大應(yīng)用范圍：

HPLC高沸點(diǎn)，難揮發(fā)，對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)GC低沸點(diǎn)，易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定物質(zhì)此外，HPLC流出組分可以收集，檢測(cè)器靈敏度高。HPLC和GC的比較流動(dòng)相：高效液相色譜儀高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC儀組成：輸液系統(tǒng);進(jìn)樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC儀組成：輸液系統(tǒng);進(jìn)樣系統(tǒng)流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程流程及主要部件

processandmainasse主要部件輸液系統(tǒng)（一）流動(dòng)相貯器耐酸堿的瓶子（棕色或無(wú)色），高于泵體，保持輸液靜壓差。主要部件輸液系統(tǒng)（二）脫氣裝置液體流動(dòng)相使用前要脫氣，除去其溶解的氣體。（基線噪音，氧化組分！?。┓椒ǎ海?）超聲波振動(dòng)脫氣（2）抽真空脫氣（3）加熱回流脫氣（4）吹氦脫氣（5）真空在線脫氣（二）脫氣裝置(三)高壓輸液泵要求：流量準(zhǔn)確可調(diào)，耐高壓（30MPa），液流穩(wěn)定，泵的死體積小。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(三)高壓輸液泵雙泵串聯(lián)補(bǔ)償法將兩個(gè)柱塞桿往復(fù)泵串聯(lián),泵1比泵2體積大一倍,柱塞桿運(yùn)動(dòng)方向相反。（目的是：減少輸液脈沖）泵1泵2色譜柱吸（排）排（吸）雙泵串聯(lián)補(bǔ)償法泵1泵2色譜柱吸（排）排（吸）(四)梯度淋洗裝置梯度洗脫：分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序地改變流動(dòng)相的組成（極性，PH或離子強(qiáng)度）。類型：高壓梯度低壓梯度(四)梯度淋洗裝置梯度洗脫：分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序地改變外梯度（二元高壓梯度）:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度（四元低壓梯度）

:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。外梯度（二元高壓梯度）:內(nèi)梯度（四元低壓梯度）二.進(jìn)樣系統(tǒng)

（一）六通進(jìn)樣閥

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣精確，重現(xiàn)性好。二.進(jìn)樣系統(tǒng)（一）六通進(jìn)樣閥優(yōu)點(diǎn)：三.色譜分離系統(tǒng)（一）保護(hù)柱

位置：接在色譜柱之前，保護(hù)色譜柱。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5cm。填料跟分析柱一樣，粒徑大。三.色譜分離系統(tǒng)（一）保護(hù)柱（二）色譜柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。常用的分析柱是內(nèi)徑2～4.6mm，柱長(zhǎng)10～25cm（二）色譜柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～4（三）柱恒溫箱精確控制柱溫可以提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。柱溫升高，保留時(shí)間減少。常用溫度：室溫-65度（三）柱恒溫箱精確控制柱溫可以提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。（四）色譜柱柱效的評(píng)價(jià)《中國(guó)藥典》05版規(guī)定：建立HPLC法時(shí)，需要進(jìn)行“色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”實(shí)驗(yàn)。最佳分離狀態(tài)下色譜柱應(yīng)達(dá)到的：n理論？分離度R？拖尾因子T？（四）色譜柱柱效的評(píng)價(jià)《中國(guó)藥典》05版規(guī)定：建立HPLC法四.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器：檢測(cè)器分為溶質(zhì)性檢測(cè)器（只對(duì)流動(dòng)相中的被分離分析組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)）和總體型檢測(cè)器（對(duì)流動(dòng)相的總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)）。（1）溶質(zhì)性檢測(cè)器：紫外（UVD）、熒光（FLD）、電化學(xué)（ECD）檢測(cè)器等。四.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器：檢測(cè)器分為溶質(zhì)性檢測(cè)器（只對(duì)流動(dòng)相中的紫外檢測(cè)器—基于被測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以進(jìn)行定性定量分析。a．固定波長(zhǎng)型檢測(cè)器—是一種光源波長(zhǎng)固定的紫外光度計(jì)，一般由低壓汞燈作光源，發(fā)射波長(zhǎng)為254nm波長(zhǎng)的光。對(duì)在254nm波長(zhǎng)附近有吸收的物質(zhì)有響應(yīng)。b．可變波長(zhǎng)型檢測(cè)器—是一臺(tái)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)任意可調(diào)。紫外檢測(cè)器—基于被測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收，且吸

a.b.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

a.b.紫外檢測(cè)器c.光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）一種新型記錄方式的紫外檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器組成：它由光源、光柵、1024個(gè)二極管陣列（各檢測(cè)特定波長(zhǎng)），計(jì)算機(jī)。光源發(fā)射的光被組分選擇性吸收，經(jīng)光柵分光后照射到二極管陣列上，使每納米光波的光強(qiáng)變成相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)累積和計(jì)算機(jī)處理后得到試樣或每個(gè)組分的吸收光譜?？梢垣@得t、A、λ的三維圖－光譜和色譜圖的加合圖。c.光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）一種新型記錄方式的紫外現(xiàn)代儀器分析HPLC課件光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器應(yīng)用三維時(shí)間-色譜-光譜圖除了定量外，可以綜合定性分析:(1)色譜峰的純度檢查(2)色譜峰的分離狀況光電二極管陣列檢測(cè)器應(yīng)用三維時(shí)間-色譜-光譜圖（二）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD

ELSD是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光電轉(zhuǎn)換器等部件構(gòu)成。（二）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelight-檢測(cè)過(guò)程：

流出液霧化成微細(xì)液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)溶劑被蒸發(fā)掉，留下溶質(zhì)激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。散射光強(qiáng)度正比組分的量檢測(cè)過(guò)程：流出液霧化成微細(xì)液滴通蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD應(yīng)用散射光強(qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。（糖類，甾體皂甙，脂肪酸等）其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD應(yīng)用散射光強(qiáng)只與溶質(zhì)（三）熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；能在紫外光激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；（三）熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetec（四）示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

（四）示差折光檢測(cè)器

（differentialref五數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀+工作站六儀器性能指標(biāo)

分離性能：流量精度，噪聲，漂移，線性檢測(cè)性能：比如UV有波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度五數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀+工作站現(xiàn)代儀器分析HPLC課件第三節(jié)高效液色譜法的基本理論

基本理論及色譜流程與氣相色譜法相似；如塔板理論、速率理論、保留值、分離度等都可用于高效液相色譜法。兩者不同的是流動(dòng)相，因而在基本理論方面需要考慮這些特點(diǎn)。其影響最大的是速率理論。描述其板高與影響因素關(guān)系的范氏方程如下：

渦流縱向傳質(zhì)阻力

H＝A＋B/u＋Cu第三節(jié)高效液色譜法的基本理論

基本理論及色譜流程與氣相色但在液相色譜中流動(dòng)相是液體，黏度大，柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)小，所以B/u很小可以忽略，則：

H＝A＋Cu因此：（1）從A項(xiàng)考慮：A=2λdp

①減小dp，小粒固定相，可以提高柱效；②降低λ采用球形，顆粒均勻分布的固定相，有利于提高柱效；但在液相色譜中流動(dòng)相是液體，黏度大，柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)小，所以（2）從C項(xiàng)考慮：在HPLC中：C=Cm+Csm+Cs通常采用化學(xué)鍵合相，固定液被鍵合到載體的表面。所以

C=Cm+CsmH＝A+Cm+Csm范式方程提高柱效的方法：（1）減小dp，采用球形小粒固定相，化學(xué)鍵合相（2）低黏度流動(dòng)相，低流量（1ml/Min）（3）柱溫25-30（2）從C項(xiàng)考慮：第四節(jié)各類高效液色譜法一、液-液分配色譜法二、液-固吸附色譜法三、離子交換色譜法四、離子色譜五、離子對(duì)色譜六、排阻色譜色譜第四節(jié)各類高效液色譜法一、液-液分配色譜法一、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，采用化學(xué)鍵合固定相（一）正相分配色譜親水性固定液+疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性；分離物質(zhì)：強(qiáng)極性化合物（糖類和多肽類）；極性大的后出峰；氰基化學(xué)鍵合相：誘導(dǎo)力，分離可極化的物質(zhì)

氨基化學(xué)鍵合相：誘導(dǎo)力+氫鍵作用力一、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液（二）反相分配色譜疏水性固定液+親水性流動(dòng)相，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。分離物質(zhì)：非極性化合物（廣泛）；極性小的后出峰；十八烷基鍵合相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（ODS反相柱）。疏溶劑理論：

烴基鍵合相，強(qiáng)疏水性，組分中非極性部分與烴基鍵合相結(jié)合。親水性流動(dòng)相使組分分離。（二）反相分配色譜疏水性固定液+親水性流動(dòng)相，流動(dòng)二、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用：分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的脂溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；二、液-固吸附色譜

liquid-soli三、離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；早期采用的離子交換樹(shù)脂被離子鍵合相代替。

流動(dòng)相：陽(yáng)離子離子交換色譜，采用堿性水溶液；陰離子離子交換色譜，采用酸性水溶液；

三、離子交換色譜

ion-exchang基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應(yīng)用：離子及可離解的化合物，有機(jī)和無(wú)機(jī)分離，氨基酸、核酸等?；驹恚航M分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交四、離子色譜

ionchromatography（IC）

離子色譜是與離子交換色譜的區(qū)別：采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。

四、離子色譜

ionchromatography（I一、離子色譜法原理

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象,在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速發(fā)展。傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。一、離子色譜法原理

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：2.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快（2）分離能力高

離子色譜裝置類型

抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型

非抑制型:當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹(shù)脂的交換容量，使用低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。離子色譜裝置類型

抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型非抑制型:離子色譜抑制裝置圖陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-離子色譜抑制裝置圖陰離子交換：離子色譜連續(xù)抑制原理圖離子色譜連續(xù)抑制原理圖離子色譜的應(yīng)用

陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。離子色譜的應(yīng)用

陰離子分析:五、離子對(duì)色譜

ionpairchromatography原理：將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配，從而控制被分離組分的保留值的色譜法。（LLC法基礎(chǔ)上演變來(lái)的?。?/p>

A++B-=(A+

B-

)org離子對(duì)的體積較大，又無(wú)凈電荷，所以有顯著的疏水性；離子有親水性，離子對(duì)有疏水性（親油性）；故可將萃取原理用來(lái)討論離子對(duì)色譜的分離問(wèn)題。五、離子對(duì)色譜

i選擇合適的反離子和濃度，就能有效地將被分離組分萃取進(jìn)有機(jī)相。正相離子對(duì)色譜：如以水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，離子對(duì)容易流出色譜柱；反離子對(duì)色譜：反之，則離子對(duì)被保留。常用離子對(duì)試劑：陰離子分離：常采用烷基胺類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲胺作為對(duì)離子；陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；選擇合適的反離子和濃度，就能有效地將被分離組分萃取進(jìn)有機(jī)相。六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

VR＝V0+KVi

流動(dòng)相：四氫呋喃、二甲基甲酰胺等）。應(yīng)用：可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離六、排阻色譜色譜

size-exclusionchro七、膠束色譜（MC）流動(dòng)相：膠束水溶液，多了一個(gè)膠束相，所以有三個(gè)界面，三個(gè)分配系數(shù)，有比較好的選擇性。

七、膠束色譜（MC）流動(dòng)相：膠束水溶液，現(xiàn)代儀器分析HPLC課件HPLC固定相：硅膠，化學(xué)鍵合相，，凝膠，離子交換劑一.硅膠吸附色譜常用，應(yīng)用廣（極性至弱極性物質(zhì)）。類型：表面多孔硅膠，無(wú)定形全多孔，球形全多孔，堆積硅珠第五節(jié)固定相表面多孔型型球形全多孔型表面多孔HPLC固定相：硅膠，化學(xué)鍵合相，，凝膠，離子交換劑第五節(jié)二．化學(xué)鍵合相

以硅膠為載體，經(jīng)化學(xué)反映后，將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面上?；瘜W(xué)鍵合相優(yōu)點(diǎn)：（1）減少固定液的流失，增加色譜柱的使用壽命；（2）化學(xué)穩(wěn)定，PH2-8溶液（3）傳質(zhì)快，柱效高，載樣量大封尾：化學(xué)反應(yīng)將載體表面硅醇基出去。二．化學(xué)鍵合相現(xiàn)代儀器分析HPLC課件鍵合類型：①硅氧碳型（Si-O-C）鍵合相－醇與硅羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)得到；易發(fā)生水解，目前少用。②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）鍵合相－硅羥基與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)得到，穩(wěn)定多用：鍵合類型：②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）鍵合相－硅羥基鍵合類型有：（一）非極性鍵合相疏水基團(tuán)－不同鏈長(zhǎng)的烷基，甲基和苯基等；最廣：十八烷基鍵合相（C-18柱或ODS柱）

：將十八烷基通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面上。。影響因素：1.載體性質(zhì)：比表面大，鍵合基團(tuán)多，k大，t長(zhǎng)YWG-C18，YQG-C182.表面覆蓋度：表面覆蓋度大，殘留硅醇基少，則分配占主導(dǎo)地位。3.鍵合基團(tuán)的鏈長(zhǎng)：鏈長(zhǎng)增加，極性低，k大載體官能團(tuán)鍵合類型有：（一）非極性鍵合相載體官能團(tuán)（二）中等極性鍵合相醚基鍵合相（ROR），如：YWG-ROR（三）極性鍵合相分析糖類極性基團(tuán)－氨基、氰基、醚基和醇基等；

（1）氰基化學(xué)鍵合相：中強(qiáng)極性YWG-CN（2）氨基化學(xué)鍵合相：強(qiáng)極性YWG-NH2三.凝膠（一）半硬質(zhì)凝膠：苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)，壓縮性，易裝柱（二）硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠等無(wú)機(jī)材料，易碎，柱效低（三）主要性能參數(shù)：分子量排斥極限，平均孔徑原則：全滲透點(diǎn)的分子量<樣品分子量<分子量排斥極限（二）中等極性鍵合相四.離子交換劑離子鍵合相－陰離子交換基團(tuán)胺基、季銨基、陽(yáng)離子交換基團(tuán)磺酸基。以含有離子交換基團(tuán)（磺基、氨基、羧基等）的鍵合相為固定相。例如:YWG-SO3H,YWG-R3NClZipax-SCX(薄殼型陽(yáng)離子鍵合相)四.離子交換劑一.HPLC對(duì)流動(dòng)相的要求：不與固定相發(fā)生不可逆化學(xué)變化；溶解樣品；與檢測(cè)器相配；粘度小，有利于獲得高柱效；廉價(jià)、毒性小、易于純化等。選擇原則：“相似相溶”。試樣極性、固定相極性及流動(dòng)相極性之間的配合與經(jīng)典色譜法相似。第六節(jié)流動(dòng)相一.HPLC對(duì)流動(dòng)相的要求：第六節(jié)流動(dòng)相二.常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)（一）沸點(diǎn)（b.p）：低沸點(diǎn)（二）黏度：黏度太大，C項(xiàng)大，柱效低（三）互溶性：好（四）極性：用羅氏常數(shù)描述。調(diào)節(jié)極性可以使樣品組分的k在合適范圍。極性參數(shù)P:Pab’=φaPa’+φbPb’極性參數(shù)與k關(guān)系:k2/k1=10(P1’-P2’)/2(正相色譜)k1/k2=10(P1’-P2’)/2(反相色譜)二.常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)三.溶劑的選擇性與分類四.不同色譜選不同流動(dòng)相(一)吸附色譜用流動(dòng)相通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇。(二)分配色譜用流動(dòng)相:指導(dǎo)原則1<k<10正相:最常用的流動(dòng)相：飽和烷烴，如已烷，庚烷反相:最常用的流動(dòng)相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水－甲醇體系：大約50％水的時(shí)候粘度最大水－乙腈體系：35％水的時(shí)候粘度最大。三.溶劑的選擇性與分類(三)離子交換色譜用流動(dòng)相緩沖溶液，可以解離離子。(四)尺寸排阻色譜用流動(dòng)相不需要改變流動(dòng)相組成來(lái)改變分離，只要流動(dòng)相能溶解樣品，黏度低就可以。(三)離子交換色譜用流動(dòng)相第七節(jié)HPLC分析條件的選擇一.分離條件的選擇(一)分離方法的選擇第七節(jié)HPLC分析條件的選擇一.分離條件的選擇考慮分離方法的選擇，主要考慮以下三個(gè)方面：（1）相對(duì)分子量分子量小于200的一般選用氣相法；200~2000的選用液－液、液－固、或離子交換色譜法；大于2000的可用排斥色譜法。（2）溶解度水溶性樣品最好用離子交換或液－液分配色譜法；微溶于水的，但在酸、或堿存在下能很好離解的，可用離子交換色譜法；油溶性、或相對(duì)極性較弱的混合物，可用液－固色譜法。（3）化學(xué)結(jié)構(gòu)離子型、或易離子化、或易形成離子對(duì)的化合物宜用離子色譜法；異構(gòu)體的分離，宜用液－固色譜法；同系物的分離，宜用液－液分配色譜法；高分子化合物宜用排阻色譜法?？紤]分離方法的選擇，主要考慮以下三個(gè)方面：(二)梯度洗脫分離指導(dǎo)原則是組分:1<k<10等度洗脫（流動(dòng)相比例不變）:樣品組分少，性質(zhì)差別不大。梯度洗脫：一個(gè)分析周期內(nèi)，程序控制流動(dòng)相的組成（極性，PH，離子強(qiáng)度）改變，使每個(gè)組分都能在適宜條件下分離。跟GC程序升溫作用相似。

適用：多組分復(fù)雜樣品。

優(yōu)點(diǎn)：縮短分析時(shí)間，提高分離度R，改善峰形，提高靈敏度。(二)梯度洗脫二.檢測(cè)器的選擇選擇UV，ELSD，熒光，電化學(xué)檢測(cè)器？？根據(jù)前面所講的內(nèi)容總結(jié)。三.色譜條件的評(píng)價(jià)（一）理論塔板數(shù)（n）（二）分離度R（三）重復(fù)性重復(fù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品5針，計(jì)算峰面積的RSD〈2.0%（四）拖尾因子T（0.95-1.05）二.檢測(cè)器的選擇選擇UV，ELSD，熒光，電化學(xué)檢測(cè)器？？第八節(jié)定性與定量分析

一.定性分析（一）保留值定性

在一定操作條件下，各組分的保留時(shí)間是一定值。（二）化學(xué)鑒定法收集分離后組分定性。（三）HPLC-光譜聯(lián)用技術(shù)HPLC-MS，HPLC-FTIR，HPLC-NMR第八節(jié)定性與定量分析

一.定性分析二.定量分析與GC差不多。（一）外標(biāo)法：以試樣的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照物質(zhì)，與對(duì)照物質(zhì)對(duì)比求算試樣含量的方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法，外標(biāo)一點(diǎn)法，外標(biāo)二點(diǎn)法。用六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣誤差小，故HPLC常用外標(biāo)法。（二）內(nèi)標(biāo)法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法Ci=bAi/As+a2.內(nèi)標(biāo)對(duì)比法（內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法）二.定量分析與GC差不多。第九節(jié)LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)介L(zhǎng)C-MS技術(shù)飛速發(fā)展：一.接口技術(shù)主要是去除溶劑并使樣品離子化。大氣壓電離源（API）：（1）電噴霧電離源（ESI）（2）大氣壓化學(xué)電離源（APCI）LC-MS分離過(guò)程：樣品經(jīng)色譜分離，由ESI或APCI離子化，進(jìn)入MS分析。第九節(jié)LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)介L(zhǎng)C-MS技術(shù)飛速發(fā)展：LC-MSLC-MS應(yīng)用

（一）定性分析提供未知化合物的分子量，高分辨率的如飛行時(shí)間TOFMS可以得到化合物的信息。（二）定量分析與HPLC方法差不多。采用與待測(cè)組分對(duì)應(yīng)的特征離子得到的質(zhì)量色譜圖，減少干擾。應(yīng)用

（一）定性分析本章內(nèi)容復(fù)習(xí)第一節(jié)概述第二節(jié)高效液相色譜儀第三節(jié)高效液色譜法的基本理論第四節(jié)各類高效液色譜法第五節(jié)固定相第六節(jié)流動(dòng)相第七節(jié)HPLC分析條件的選擇第八節(jié)定性與定量分析第九節(jié)LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)介第十節(jié)超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介本章內(nèi)容復(fù)習(xí)第一節(jié)概述本章內(nèi)容介紹第一節(jié)概述第二節(jié)高效液相色譜儀第三節(jié)高效液色譜法的基本理論第四節(jié)各類高效液色譜法第五節(jié)固定相第六節(jié)流動(dòng)相第七節(jié)HPLC分析條件的選擇第八節(jié)定性與定量分析第九節(jié)LC-MS聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)介第十節(jié)超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介本章內(nèi)容介紹第一節(jié)概述第一節(jié)概述

HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入GC的理論和技術(shù),采用：高速——高壓泵高效——固定相；高靈敏度——檢測(cè)器第一節(jié)概述

HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入GCHPLC與經(jīng)典液相色譜的比較

高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。HPLC與經(jīng)典液相色譜的比較

高速：HPLC和GC的比較流動(dòng)相：

HPLC液體種類多，可選范圍多GC氣體，種類少，改變載氣影響柱效和分離少固定相：

HPLC新型吸附劑，化學(xué)鍵合相，粒度小GC吸附劑，擔(dān)體+吸附劑，粒度大應(yīng)用范圍：

HPLC高沸點(diǎn)，難揮發(fā)，對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)GC低沸點(diǎn)，易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定物質(zhì)此外，HPLC流出組分可以收集，檢測(cè)器靈敏度高。HPLC和GC的比較流動(dòng)相：高效液相色譜儀高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC儀組成：輸液系統(tǒng);進(jìn)樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC儀組成：輸液系統(tǒng);進(jìn)樣系統(tǒng)流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程流程及主要部件

processandmainasse主要部件輸液系統(tǒng)（一）流動(dòng)相貯器耐酸堿的瓶子（棕色或無(wú)色），高于泵體，保持輸液靜壓差。主要部件輸液系統(tǒng)（二）脫氣裝置液體流動(dòng)相使用前要脫氣，除去其溶解的氣體。（基線噪音，氧化組分！?。┓椒ǎ海?）超聲波振動(dòng)脫氣（2）抽真空脫氣（3）加熱回流脫氣（4）吹氦脫氣（5）真空在線脫氣（二）脫氣裝置(三)高壓輸液泵要求：流量準(zhǔn)確可調(diào)，耐高壓（30MPa），液流穩(wěn)定，泵的死體積小。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(三)高壓輸液泵雙泵串聯(lián)補(bǔ)償法將兩個(gè)柱塞桿往復(fù)泵串聯(lián),泵1比泵2體積大一倍,柱塞桿運(yùn)動(dòng)方向相反。（目的是：減少輸液脈沖）泵1泵2色譜柱吸（排）排（吸）雙泵串聯(lián)補(bǔ)償法泵1泵2色譜柱吸（排）排（吸）(四)梯度淋洗裝置梯度洗脫：分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序地改變流動(dòng)相的組成（極性，PH或離子強(qiáng)度）。類型：高壓梯度低壓梯度(四)梯度淋洗裝置梯度洗脫：分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序地改變外梯度（二元高壓梯度）:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度（四元低壓梯度）

:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。外梯度（二元高壓梯度）:內(nèi)梯度（四元低壓梯度）二.進(jìn)樣系統(tǒng)

（一）六通進(jìn)樣閥

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣精確，重現(xiàn)性好。二.進(jìn)樣系統(tǒng)（一）六通進(jìn)樣閥優(yōu)點(diǎn)：三.色譜分離系統(tǒng)（一）保護(hù)柱

位置：接在色譜柱之前，保護(hù)色譜柱。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5cm。填料跟分析柱一樣，粒徑大。三.色譜分離系統(tǒng)（一）保護(hù)柱（二）色譜柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。常用的分析柱是內(nèi)徑2～4.6mm，柱長(zhǎng)10～25cm（二）色譜柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～4（三）柱恒溫箱精確控制柱溫可以提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。柱溫升高，保留時(shí)間減少。常用溫度：室溫-65度（三）柱恒溫箱精確控制柱溫可以提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。（四）色譜柱柱效的評(píng)價(jià)《中國(guó)藥典》05版規(guī)定：建立HPLC法時(shí)，需要進(jìn)行“色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”實(shí)驗(yàn)。最佳分離狀態(tài)下色譜柱應(yīng)達(dá)到的：n理論？分離度R？拖尾因子T？（四）色譜柱柱效的評(píng)價(jià)《中國(guó)藥典》05版規(guī)定：建立HPLC法四.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器：檢測(cè)器分為溶質(zhì)性檢測(cè)器（只對(duì)流動(dòng)相中的被分離分析組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)）和總體型檢測(cè)器（對(duì)流動(dòng)相的總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)）。（1）溶質(zhì)性檢測(cè)器：紫外（UVD）、熒光（FLD）、電化學(xué)（ECD）檢測(cè)器等。四.檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器：檢測(cè)器分為溶質(zhì)性檢測(cè)器（只對(duì)流動(dòng)相中的紫外檢測(cè)器—基于被測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以進(jìn)行定性定量分析。a．固定波長(zhǎng)型檢測(cè)器—是一種光源波長(zhǎng)固定的紫外光度計(jì)，一般由低壓汞燈作光源，發(fā)射波長(zhǎng)為254nm波長(zhǎng)的光。對(duì)在254nm波長(zhǎng)附近有吸收的物質(zhì)有響應(yīng)。b．可變波長(zhǎng)型檢測(cè)器—是一臺(tái)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)任意可調(diào)。紫外檢測(cè)器—基于被測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收，且吸

a.b.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

a.b.紫外檢測(cè)器c.光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）一種新型記錄方式的紫外檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器組成：它由光源、光柵、1024個(gè)二極管陣列（各檢測(cè)特定波長(zhǎng)），計(jì)算機(jī)。光源發(fā)射的光被組分選擇性吸收，經(jīng)光柵分光后照射到二極管陣列上，使每納米光波的光強(qiáng)變成相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)累積和計(jì)算機(jī)處理后得到試樣或每個(gè)組分的吸收光譜?？梢垣@得t、A、λ的三維圖－光譜和色譜圖的加合圖。c.光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）一種新型記錄方式的紫外現(xiàn)代儀器分析HPLC課件光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器應(yīng)用三維時(shí)間-色譜-光譜圖除了定量外，可以綜合定性分析:(1)色譜峰的純度檢查(2)色譜峰的分離狀況光電二極管陣列檢測(cè)器應(yīng)用三維時(shí)間-色譜-光譜圖（二）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD

ELSD是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光電轉(zhuǎn)換器等部件構(gòu)成。（二）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelight-檢測(cè)過(guò)程：

流出液霧化成微細(xì)液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)溶劑被蒸發(fā)掉，留下溶質(zhì)激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。散射光強(qiáng)度正比組分的量檢測(cè)過(guò)程：流出液霧化成微細(xì)液滴通蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD應(yīng)用散射光強(qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。（糖類，甾體皂甙，脂肪酸等）其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD應(yīng)用散射光強(qiáng)只與溶質(zhì)（三）熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；能在紫外光激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；（三）熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetec（四）示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

（四）示差折光檢測(cè)器

（differentialref五數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀+工作站六儀器性能指標(biāo)

分離性能：流量精度，噪聲，漂移，線性檢測(cè)性能：比如UV有波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度五數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀+工作站現(xiàn)代儀器分析HPLC課件第三節(jié)高效液色譜法的基本理論

基本理論及色譜流程與氣相色譜法相似；如塔板理論、速率理論、保留值、分離度等都可用于高效液相色譜法。兩者不同的是流動(dòng)相，因而在基本理論方面需要考慮這些特點(diǎn)。其影響最大的是速率理論。描述其板高與影響因素關(guān)系的范氏方程如下：

渦流縱向傳質(zhì)阻力

H＝A＋B/u＋Cu第三節(jié)高效液色譜法的基本理論

基本理論及色譜流程與氣相色但在液相色譜中流動(dòng)相是液體，黏度大，柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)小，所以B/u很小可以忽略，則：

H＝A＋Cu因此：（1）從A項(xiàng)考慮：A=2λdp

①減小dp，小粒固定相，可以提高柱效；②降低λ采用球形，顆粒均勻分布的固定相，有利于提高柱效；但在液相色譜中流動(dòng)相是液體，黏度大，柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)小，所以（2）從C項(xiàng)考慮：在HPLC中：C=Cm+Csm+Cs通常采用化學(xué)鍵合相，固定液被鍵合到載體的表面。所以

C=Cm+CsmH＝A+Cm+Csm范式方程提高柱效的方法：（1）減小dp，采用球形小粒固定相，化學(xué)鍵合相（2）低黏度流動(dòng)相，低流量（1ml/Min）（3）柱溫25-30（2）從C項(xiàng)考慮：第四節(jié)各類高效液色譜法一、液-液分配色譜法二、液-固吸附色譜法三、離子交換色譜法四、離子色譜五、離子對(duì)色譜六、排阻色譜色譜第四節(jié)各類高效液色譜法一、液-液分配色譜法一、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，采用化學(xué)鍵合固定相（一）正相分配色譜親水性固定液+疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性；分離物質(zhì)：強(qiáng)極性化合物（糖類和多肽類）；極性大的后出峰；氰基化學(xué)鍵合相：誘導(dǎo)力，分離可極化的物質(zhì)

氨基化學(xué)鍵合相：誘導(dǎo)力+氫鍵作用力一、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液（二）反相分配色譜疏水性固定液+親水性流動(dòng)相，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。分離物質(zhì)：非極性化合物（廣泛）；極性小的后出峰；十八烷基鍵合相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（ODS反相柱）。疏溶劑理論：

烴基鍵合相，強(qiáng)疏水性，組分中非極性部分與烴基鍵合相結(jié)合。親水性流動(dòng)相使組分分離。（二）反相分配色譜疏水性固定液+親水性流動(dòng)相，流動(dòng)二、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用：分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的脂溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；二、液-固吸附色譜

liquid-soli三、離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；早期采用的離子交換樹(shù)脂被離子鍵合相代替。

流動(dòng)相：陽(yáng)離子離子交換色譜，采用堿性水溶液；陰離子離子交換色譜，采用酸性水溶液；

三、離子交換色譜

ion-exchang基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應(yīng)用：離子及可離解的化合物，有機(jī)和無(wú)機(jī)分離，氨基酸、核酸等。基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交四、離子色譜

ionchromatography（IC）

離子色譜是與離子交換色譜的區(qū)別：采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。

四、離子色譜

ionchromatography（I一、離子色譜法原理

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象,在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速發(fā)展。傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。一、離子色譜法原理

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：2.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快（2）分離能力高

離子色譜裝置類型

抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型

非抑制型:當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹(shù)脂的交換容量，使用低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。離子色譜裝置類型

抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型非抑制型:離子色譜抑制裝置圖陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-離子色譜抑制裝置圖陰離子交換：離子色譜連續(xù)抑制原理圖離子色譜連續(xù)抑制原理圖離子色譜的應(yīng)用

陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。離子色譜的應(yīng)用

陰離子分析:五、離子對(duì)色譜

ionpairchromatography原理：將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配，從而控制被分離組分的保留值的色譜法。（LLC法基礎(chǔ)上演變來(lái)的?。?/p>

A++B-=(A+

B-

)org離子對(duì)的體積較大，又無(wú)凈電荷，所以有顯著的疏水性；離子有親水性，離子對(duì)有疏水性（親油性）；故可將萃取原理用來(lái)討論離子對(duì)色譜的分離問(wèn)題。五、離子對(duì)色譜

i選擇合適的反離子和濃度，就能有效地將被分離組分萃取進(jìn)有機(jī)相。正相離子對(duì)色譜：如以水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，離子對(duì)容易流出色譜柱；反離子對(duì)色譜：反之，則離子對(duì)被保留。常用離子對(duì)試劑：陰離子分離：常采用烷基胺類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲胺作為對(duì)離子；陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；選擇合適的反離子和濃度，就能有效地將被分離組分萃取進(jìn)有機(jī)相。六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

VR＝V0+KVi

流動(dòng)相：四氫呋喃、二甲基甲酰胺等）。應(yīng)用：可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離六、排阻色譜色譜

size-exclusionchro七、膠束色譜（MC）流動(dòng)相：膠束水溶液，多了一個(gè)膠束相，所以有三個(gè)界面，三個(gè)分配系數(shù)，有比較好的選擇性。

七、膠束色譜（MC）流動(dòng)相：膠束水溶液，現(xiàn)代儀器分析HPLC課件HPLC固定相：硅膠，化學(xué)鍵合相，，凝膠，離子交換劑一.硅膠吸附色譜常用，應(yīng)用廣（極性至弱極性物質(zhì)）。類型：表面多孔硅膠，無(wú)定形全多孔，球形全多孔，堆積硅珠第五節(jié)固定相表面多孔型型球形全多孔型表面多孔HPLC固定相：硅膠，化學(xué)鍵合相，，凝膠，離子交換劑第五節(jié)二．化學(xué)鍵合相

以硅膠為載體，經(jīng)化學(xué)反映后，將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面上?；瘜W(xué)鍵合相優(yōu)點(diǎn)：（1）減少固定液的流失，增加色譜柱的使用壽命；（2）化學(xué)穩(wěn)定，PH2-8溶液（3）傳質(zhì)快，柱效高，載樣量大封尾：化學(xué)反應(yīng)將載體表面硅醇基出去。二．化學(xué)鍵合相現(xiàn)代儀器分析HPLC課件鍵合類型：①硅氧碳型（Si-O-C）鍵合相－醇與硅羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)得到；易發(fā)生水解，目前少用。②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）鍵合相－硅羥基與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)得到，穩(wěn)定多用：鍵合類型：②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）鍵合相－硅羥基鍵合類型有：（一）非極性鍵合相疏水基團(tuán)－不同鏈長(zhǎng)的烷基，甲基和苯基等；最廣：十八烷基鍵合相（C-18柱或ODS柱）

：將十八烷基通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面上。。影響因素：1.載體性質(zhì)：比表面大，鍵合基團(tuán)多，k大，t長(zhǎng)YWG-C18，YQG-C182.表面覆蓋度：表面覆蓋度大，殘留硅醇基少，則分配占主導(dǎo)地位。3.鍵合基團(tuán)的鏈長(zhǎng)：鏈長(zhǎng)增加，極性低，k大載體官能團(tuán)鍵合類型有：（一）非極性鍵合相載體官能團(tuán)（二）中等極性鍵合相醚基鍵合相（ROR），如：YWG-ROR（三）極性鍵合相分析糖類極性基團(tuán)－氨基、氰基、醚基和醇基等；

（1）氰基化學(xué)鍵合相：中強(qiáng)極性YWG-CN（2）氨基化學(xué)鍵合相：強(qiáng)極性YWG-NH2三.凝膠（一）半硬質(zhì)凝膠：苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)，壓縮性，易裝柱（二）硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠等無(wú)機(jī)材料，易碎，柱效低（三）主要性能參數(shù)：分子量排斥極限，平均孔徑原則：全滲透點(diǎn)的分子量<樣品分子量<分子量排斥極限（二）中等極性鍵合相四.離子交換劑離子鍵合相－陰離子交換基團(tuán)胺基、季銨基、陽(yáng)離子交換基團(tuán)磺酸基。以含有離子交換基團(tuán)（磺基、氨基、羧基等）的鍵合相為固定相。例如:YWG-SO3H,YWG-R3NClZipax-SCX(薄殼型陽(yáng)離子鍵合相)四.離子交換劑一.H