第二章DNA復(fù)制與損傷教材課件

§3-1DNA復(fù)制概貌§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白§3-3DNA的復(fù)制過程第三章DNA的復(fù)制§3-4DNA的修復(fù)§3-5DNA的突變§3-1DNA復(fù)制概貌第三章DNA的復(fù)制§3-4D1DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控的過程；

§3-1DNA復(fù)制概貌DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)的生物大分子。DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控21958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA復(fù)制的半保留性。

一、DNA復(fù)制的半保留性(Semiconservativereplication)

1958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代3二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNAsynthesisissemidiscontinuous二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制4（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）三、復(fù)制的起點(diǎn)、方向（即順序性及復(fù)制單位）

replicationorigin&direction（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）三、復(fù)制的起點(diǎn)、方向（即順5許多實(shí)驗(yàn)證明，DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。E.coli染色體復(fù)制原點(diǎn)oriC成串排列3個13bp重復(fù)序列(GATCTNTTNTTTT)反向重復(fù)出現(xiàn)4個9bp序列(TTATCCACA)許多實(shí)驗(yàn)證明，DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。E.col6復(fù)制子（replicon）一般把生物體的獨(dú)立復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點(diǎn)。即能啟動DNA復(fù)制開始的基因組上的DNA順序，包括復(fù)制原點(diǎn)和引發(fā)復(fù)制的結(jié)構(gòu)基因，以及在其控制下的DNA區(qū)段統(tǒng)稱為復(fù)制子。復(fù)制子（replicon）一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點(diǎn)。即能7發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。coli分開連鎖體需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（屬于類型Ⅱtopo酶）參與作用。細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷5’OH⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。DNApolII進(jìn)行DNA鏈的延伸一、DNA聚合酶DNAPolymerase5’3’聚合酶活性。1958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA復(fù)制的半保留性。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。5’3’核酸外切酶活性。甲基轉(zhuǎn)移酶因此而失活。在烷基化作用下，堿基可被烷基化，使G≡C對變?yōu)镚＝T，易突變?yōu)锳＝T對。C鏈--A2C4----持續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水解為一大一小兩個片段。③UvrC蛋白結(jié)合到UvrB，UvrB切開損傷部位3'端第5個磷酸二酯鍵，UvrC切開5'側(cè)第8個磷酸二酯鍵。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子鏈DNA延伸方向

新鏈合成只能從5’到3’方向發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。58不同細(xì)胞的復(fù)制參數(shù)

原核生物（大腸桿菌）真核生物（人）細(xì)胞內(nèi)復(fù)制子的數(shù)目（個）1（1）多個（103～104）復(fù)制子平均長度（kb）3～9×106約105～106復(fù)制方向多為雙向多為雙向復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)等速（850）等速（60～90）不同細(xì)胞的復(fù)制參數(shù)

原核生物（大腸桿菌）真核生物（人）細(xì)胞內(nèi)9§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特點(diǎn)：1.以4種dNTP為底物；2.反應(yīng)需要接受模板指導(dǎo)；3.反應(yīng)需要有3’-OH存在；4.DNA鏈的合成方向?yàn)?’3’；5.產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同?！?-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白一、DNA聚合酶DNAPo10第二章DNA復(fù)制與損傷教材課件11(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一種多功能酶。包括：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。從3′端將DNA鏈水解，DNA的校對（proofreading）功能。從5′端將DNA鏈水解，DNA的修復(fù)功能。將dNTP加到DNA鏈的3′-OH上，DNA的聚合功能。(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一種多功能酶。包括：512第二章DNA復(fù)制與損傷教材課件13klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水解為一大一小兩個片段。較大的C末端片斷分子量為68KD，叫klenow片斷，具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的外切酶活性，常用做體外合成DNA的工具酶。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性從5′端切除DNA受損傷的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性隨即開始工作，使DNA鏈向3′端延伸，這稱為切口平移（nicktranslation）。在DNA復(fù)制中，RNA引物的切除；DNA的損傷修復(fù)；在體外，制備高放射性活性的DNA探針。klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水14(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)

1.α亞基、ε亞基和θ亞基相連組成核心酶（coreenzyme）α亞基具有5′→3′的聚合酶活性.ε亞基具有3′→5′的外切酶活性.

θ亞基可能起組建的作用.(二)DNA聚合酶Ⅲ多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)152.DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.β亞基的功能猶如夾子:提高了酶的持續(xù)合成能力.

夾子裝置器（clamploader）:兩個γ亞基與另4個亞基（δ亞基、δ′亞基、χ亞基、ψ亞基）構(gòu)成γ復(fù)合物，其主要功能時幫助β亞基夾住DNA，故稱夾子裝置器。γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶

τ亞基起促使核心酶二聚化的作用

2.DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.β亞基的功能猶如夾子:提16二、DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAGyrase)DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個負(fù)超螺旋,可去除解螺旋產(chǎn)生的扭曲張力.并依賴于β亞基催化ATP水解,以使酶構(gòu)象復(fù)原.DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制細(xì)菌的合成.二、DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAGyrase)DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一17三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和單鏈結(jié)合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。防止核酸水解酶的作用

避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈對單鏈DNA有很高的親和性

它們與DNA結(jié)合時有協(xié)同作用2.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：三、DNA解旋酶(DNAHelicase)1.DNA解螺旋18

RNA聚合酶[RifS]完成對先導(dǎo)鏈引物的合成

實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始引發(fā)酶[RifR]

完成對后隨鏈引物的合成

較先導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII進(jìn)行DNA鏈的延伸

四、引發(fā)酶(Primerase)RNA聚合酶[RifS]完成對先導(dǎo)鏈引物的合19酶-AMP將腺苷?；ˋMP）轉(zhuǎn)移給DNA切口處的5′磷?；鶊F(tuán)，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。五、連接酶(Ligase)DNA連接酶催化雙股鏈內(nèi)相鄰單鏈切口的3′-OH與5′-P酰基形成磷酸酯鍵。酶的活化通過相鄰DNA的3′-OH對活化的P原子進(jìn)行親核攻擊，生成3′，5′-磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。

催化過程：

腺苷?；疍NA親核攻擊完成DNA連接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），與酶活性中心的賴氨酸殘基的ε-NH2以磷酰胺鍵結(jié)合，形成共價中間體酶-AMP；

。

酶-AMP將腺苷?；ˋMP）轉(zhuǎn)移給DNA切口處的5′磷酰20§3-3DNA的復(fù)制過程一、E.coli的DNA復(fù)制（環(huán)型雙股DNA，雙向θ方式）分為三個階段：起始、延伸和終止復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成復(fù)合物稱為復(fù)制體。DNA復(fù)制的階段表現(xiàn)在于復(fù)制體結(jié)構(gòu)的變化?！?-3DNA的復(fù)制過程一、E.coli的DNA復(fù)制（環(huán)型21復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成復(fù)合物稱為復(fù)制體。一、DNA復(fù)制的半保留性（2）AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開。DNA的損傷是指正常DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或物理結(jié)構(gòu)在某些物理、化學(xué)因素（如射線和化學(xué)試劑）以及細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的基因毒素等干擾作用下發(fā)生改變的現(xiàn)象。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，(2)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)3'端一邊時，修復(fù)途徑類似。O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）三、D環(huán)復(fù)制（displacementreplication）DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。并依賴于β亞基催化ATP水解,以使酶構(gòu)象復(fù)原.即能啟動DNA復(fù)制開始的基因組上的DNA順序，包括復(fù)制原點(diǎn)和引發(fā)復(fù)制的結(jié)構(gòu)基因，以及在其控制下的DNA區(qū)段統(tǒng)稱為復(fù)制子。DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控的過程；Polδ（2亞基）：有持續(xù)合成DNA鏈的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈（baseexcisionrepair）γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。分別為polα、β、γ、δ、ε。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性從5′端切除DNA受損傷的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性隨即開始工作，使DNA鏈向3′端延伸，這稱為切口平移（nicktranslation）。復(fù)制子平均長度（kb）復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉222.復(fù)制的終止1.環(huán)行E.coli染色體上的兩個復(fù)制叉相遇在排列有許多重復(fù)拷貝Ter序列（長約22bp）的一個終止區(qū)域（terminus），并停止復(fù)制。2.稱為Tus(terminusutilizatlconsubstance，終點(diǎn)利用物質(zhì)）的蛋白質(zhì)的結(jié)合于Ter序列，Tus_—Ter復(fù)合物只能夠阻止一個方向的復(fù)制叉。3.E.coli分開連鎖體需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（屬于類型Ⅱtopo酶）參與作用。分開兩閉合環(huán)。2.復(fù)制的終止1.環(huán)行E.coli染色體上的兩個復(fù)制叉相遇在23二、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）ΦX174的基因組DNA是單鏈環(huán)型DNA，復(fù)制中首先合成其互補(bǔ)鏈（而非其自身），形成復(fù)制型（replicationform,RF），然后進(jìn)行滾環(huán)型（roollingcircle）復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3‘_OH上不斷地發(fā)生DNA聚合物作用，因而也叫共價延伸（covalenceelongation）。

二、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplicat24三、D環(huán)復(fù)制（displacement

replication）線粒體DNA的雙股鏈分為輕鏈和重鏈。它的復(fù)制是一種單向不對稱的特殊復(fù)制方式,稱為Ｄ—環(huán)復(fù)制。復(fù)制從重鏈（Ｈ鏈）的原點(diǎn)開始，新合成的Ｈ鏈置換原來鏈，游離的單鏈稱為取代鏈（displacement）或Ｄ環(huán)。當(dāng)Ｈ鏈合成進(jìn)行到約2/3時，輕鏈（Ｌ鏈）的原點(diǎn)暴露出來，并引發(fā)其合成，延伸方向與Ｈ鏈的相反。三、D環(huán)復(fù)制（displacementreplicatio25四、真核生物復(fù)制特點(diǎn)（一）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的相同點(diǎn)。（二）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：１．真核DNA有多個復(fù)制原點(diǎn)；2．真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前不能再重新開始復(fù)制，而在快速生長的原核生物中起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。3．真核生物復(fù)制的調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物更為復(fù)雜。4．真核生物有多種聚合酶。四、真核生物復(fù)制特點(diǎn)（一）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA26從哺乳動物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。無外切酶活性。持續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。Polδ（2亞基）：有持續(xù)合成DNA鏈的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。

Polε（>1亞基）：相當(dāng)于E.coli的polⅠ，是一種修復(fù)酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亞基）：與損傷修復(fù)有關(guān)。Polγ（2亞基）：是線粒體DNA合成酶（3'→5'外切酶）

從哺乳動物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ27五、真核生物端粒的復(fù)制五、真核生物端粒的復(fù)制28（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.3．真核生物復(fù)制的調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物更為復(fù)雜。親核攻擊完成DNA連接MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，直接修復(fù)是指不需要移去任何堿基或核苷酸就可以將損傷逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)的修復(fù)機(jī)制。DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)的生物大分子。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。催化酶：Dam甲基化酶滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3‘_OH上不斷地發(fā)生DNA聚合物作用，因而也叫共價延伸（covalenceelongation）?！?-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)(1)當(dāng)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)5'端時，去甲基化以3'→5'方向降解（從切點(diǎn)→錯配點(diǎn)）?！穸肆NA(Telomer)DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。(二)DNA聚合酶ⅢO6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)的催化過程（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以29七、DNA復(fù)制的忠實(shí)性1.DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行的。

2.DNA聚合酶本身具有校正功能。

5.DNA的錯配校正和修復(fù)系統(tǒng)保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。3.RNA引物的存在與清除有利于降低錯配率。

4.DNA聚合酶催化的反應(yīng)機(jī)制，即DNA聚合酶僅催化5'→3'方向的反應(yīng)。七、DNA復(fù)制的忠實(shí)性1.DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)30§3-4DNA的損傷及修復(fù)一、DNA的損傷DNA的損傷是指正常DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或物理結(jié)構(gòu)在某些物理、化學(xué)因素（如射線和化學(xué)試劑）以及細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的基因毒素等干擾作用下發(fā)生改變的現(xiàn)象。（P221）（一）物理因素如電離輻射：使鏈的斷裂、堿基及五碳糖的損傷。紫外照射（254nm）：使DNA分子的相鄰的2個T形成二聚體（環(huán)丁基二聚體）；（二）化學(xué)因素1.烷基化

2.亞硝基

3.堿基類似物4.吖啶類分子，如EB§3-4DNA的損傷及修復(fù)一、DNA的損傷DNA的損傷是指31（三）自發(fā)性損傷1.脫嘌呤和脫嘧啶(AP位點(diǎn)的產(chǎn)生)2.堿基的脫氨基作用3.堿基的互變異構(gòu)4.細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷（三）自發(fā)性損傷1.脫嘌呤和脫嘧啶(AP位點(diǎn)的產(chǎn)生)2.32二、DNA的損傷修復(fù)（一）錯配修復(fù)1.模板區(qū)分機(jī)制催化酶：Dam甲基化酶發(fā)生時制：DNA復(fù)制后的一段時間內(nèi)（約幾秒或幾分鐘）發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。二、DNA的損傷修復(fù)（一）錯配修復(fù)1.模板區(qū)分機(jī)制催化酶：332.修復(fù)位點(diǎn)的識別MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，MutH結(jié)合于GATC順序；MutL可以與MutS形成復(fù)合物，并與MutH結(jié)合，在錯配堿基兩邊的DNA鏈沿著復(fù)合物的移動是等速，穿過MutL—MutS復(fù)合物產(chǎn)生一個DNA環(huán)，直到復(fù)合物碰上甲基化的GATC順序。MutH催化切斷GATC順序G堿基5‘一邊的未甲基化鏈，給該修復(fù)的鏈作上記號。2.修復(fù)位點(diǎn)的識別MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，MutH結(jié)合34γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶成串排列3個13bp重復(fù)序列(GATCTNTTNTTTT)（二）切除修復(fù)（excisionrepair）二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制（二）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：光復(fù)活酶在生物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物一直到鳥類都有。5’OH3’五、真核生物端粒的復(fù)制在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。一、DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA聚合酶本身具有校正功能。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，5’3’聚合酶活性?！?-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白§3-3DNA的復(fù)制過程§3-4DNA的損傷及修復(fù)MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)一、DNA復(fù)制的半保留性3.修復(fù)的切割與聚合(1)當(dāng)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)5'端時，去甲基化以3'→5'方向降解（從切點(diǎn)→錯配點(diǎn)）。這個過程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

-外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA連接酶。

(2)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)3'端一邊時，修復(fù)途徑類似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解單鏈DNA）。γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶3.修復(fù)的切割與聚合(35（二）切除修復(fù)（excisionrepair）

1.堿基切割修復(fù)（baseexcisionrepair）（1）由細(xì)胞內(nèi)一類特異的DNA糖苷酶（glycosylase）識別DNA中不正常的堿基，并將其水解下來，形成AP位點(diǎn)。

（2）AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開。（不同AP核酸內(nèi)切酶的作用方式不同，或是在5'側(cè)切開，或是在3'側(cè)切開）。

（3）核酸外切酶將包括AP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA鏈切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。（二）切除修復(fù)（excisionrepair）1.堿基36AP位點(diǎn)的產(chǎn)生AP位點(diǎn)的產(chǎn)生372.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一種核酸內(nèi)切酶，但與一般的核酸內(nèi)切酶不同，在鏈的損傷兩側(cè)同時切開。編碼此酶的基因是Uvr基因。大腸桿菌中ABC切除酶催化過程：①UvrA和UvrB復(fù)合物（A2B）尋找并結(jié)合到損傷部位。②UvrA離解，UvrB與DNA牢固結(jié)合。③UvrC蛋白結(jié)合到UvrB，UvrB切開損傷部位3'端第5個磷酸二酯鍵，UvrC切開5'側(cè)第8個磷酸二酯鍵。④UvrD解螺旋酶幫助除去。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。2.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excision38（三）直接修復(fù)（directrepair）

直接修復(fù)是指不需要移去任何堿基或核苷酸就可以將損傷逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)的修復(fù)機(jī)制。（P229）1.光復(fù)活修復(fù)（potoreactivationrepair）

2.O6—甲基鳥嘌呤的修復(fù)光復(fù)活(photoreactivation)是在可見光(300～600nm)的活化之下，光復(fù)活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或稱光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧啶二聚體分解成為單體的過程。

光復(fù)活酶在生物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物一直到鳥類都有。在烷基化作用下，堿基可被烷基化，使G≡C對變?yōu)镚＝T，易突變?yōu)锳＝T對。O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。甲基轉(zhuǎn)移酶因此而失活。（三）直接修復(fù)（directrepair）直接修復(fù)是指不39（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）

1.復(fù)制酶系在損傷部位無法通過堿基配對合成子代DNA鏈，它就跳過損傷部位，在下一個堿基相應(yīng)位置處重新合成引物和DNA鏈，結(jié)果子代鏈在損傷相對應(yīng)處留下缺口。2.遺傳信息有缺損的子代DNA分子可通過遺傳重組而加以彌補(bǔ)，即從同源DNA的母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口，然后用再合成的序列補(bǔ)上母鏈的空缺。3.在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。4.實(shí)際上消除了損傷的影響。（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）40DNA聚合酶I是一種多功能酶。在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。（二）切除修復(fù)（excisionrepair）復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)（1）由細(xì)胞內(nèi)一類特異的DNA糖苷酶（glycosylase）識別DNA中不正常的堿基，并將其水解下來，形成AP位點(diǎn)。光復(fù)活(photoreactivation)是在可見光(300～600nm)的活化之下，光復(fù)活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或稱光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧啶二聚體分解成為單體的過程。細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個負(fù)超螺旋,可去除解螺旋產(chǎn)生的扭曲張力.DNA的錯配校正和修復(fù)系統(tǒng)保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性?！?-3DNA的復(fù)制過程5’OH3’telomerase（baseexcisionrepair）DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。四、引發(fā)酶(Primerase)三、D環(huán)復(fù)制（displacementreplication）以4種dNTP為底物；DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行的。5’OH復(fù)制子（replicon）O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。當(dāng)Ｈ鏈合成進(jìn)行到約2/3時，輕鏈（Ｌ鏈）的原點(diǎn)暴露出來，并引發(fā)其合成，延伸方向與Ｈ鏈的相反。5’OH（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）分為三個階段：起始、延伸和終止在烷基化作用下，堿基可被烷基化，使G≡C對變?yōu)镚＝T，易突變?yōu)锳＝T對。從哺乳動物中分出５種DNApol酶。DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制細(xì)菌的合成.七、DNA復(fù)制的忠實(shí)性三、DNA解旋酶(DNAHelicase)5’3’聚合酶活性。復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)§3-5DNA的突變完成10±NtRNA引物合成后.編碼此酶的基因是Uvr基因。DNA的錯配校正和修復(fù)系統(tǒng)保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。Polγ（2亞基）：是線粒體DNA合成酶（3'→5'外切酶）DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制細(xì)菌的合成.(二)DNA聚合酶Ⅲ（四）應(yīng)急反應(yīng)（SOS）和易錯修復(fù)（errorpronerepair）應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。

SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯的修復(fù)（errorfreerepair）和易產(chǎn)生差錯的修復(fù)（errorpronerepair）兩類。

SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對功能的DNA聚合酶。SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ，它們不具有3'核苷酸外切酶校正功能。DNA聚合酶I是一種多功能酶。O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)41§3-1DNA復(fù)制概貌§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白§3-3DNA的復(fù)制過程第三章DNA的復(fù)制§3-4DNA的修復(fù)§3-5DNA的突變§3-1DNA復(fù)制概貌第三章DNA的復(fù)制§3-4D42DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控的過程；

§3-1DNA復(fù)制概貌DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)的生物大分子。DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控431958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA復(fù)制的半保留性。

一、DNA復(fù)制的半保留性(Semiconservativereplication)

1958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代44二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNAsynthesisissemidiscontinuous二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制45（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）三、復(fù)制的起點(diǎn)、方向（即順序性及復(fù)制單位）

replicationorigin&direction（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）三、復(fù)制的起點(diǎn)、方向（即順46許多實(shí)驗(yàn)證明，DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。E.coli染色體復(fù)制原點(diǎn)oriC成串排列3個13bp重復(fù)序列(GATCTNTTNTTTT)反向重復(fù)出現(xiàn)4個9bp序列(TTATCCACA)許多實(shí)驗(yàn)證明，DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。E.col47復(fù)制子（replicon）一般把生物體的獨(dú)立復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點(diǎn)。即能啟動DNA復(fù)制開始的基因組上的DNA順序，包括復(fù)制原點(diǎn)和引發(fā)復(fù)制的結(jié)構(gòu)基因，以及在其控制下的DNA區(qū)段統(tǒng)稱為復(fù)制子。復(fù)制子（replicon）一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點(diǎn)。即能48發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。coli分開連鎖體需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（屬于類型Ⅱtopo酶）參與作用。細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷5’OH⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。DNApolII進(jìn)行DNA鏈的延伸一、DNA聚合酶DNAPolymerase5’3’聚合酶活性。1958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記幾代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA復(fù)制的半保留性。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。5’3’核酸外切酶活性。甲基轉(zhuǎn)移酶因此而失活。在烷基化作用下，堿基可被烷基化，使G≡C對變?yōu)镚＝T，易突變?yōu)锳＝T對。C鏈--A2C4----持續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水解為一大一小兩個片段。③UvrC蛋白結(jié)合到UvrB，UvrB切開損傷部位3'端第5個磷酸二酯鍵，UvrC切開5'側(cè)第8個磷酸二酯鍵。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子鏈DNA延伸方向

新鏈合成只能從5’到3’方向發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。549不同細(xì)胞的復(fù)制參數(shù)

原核生物（大腸桿菌）真核生物（人）細(xì)胞內(nèi)復(fù)制子的數(shù)目（個）1（1）多個（103～104）復(fù)制子平均長度（kb）3～9×106約105～106復(fù)制方向多為雙向多為雙向復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)等速（850）等速（60～90）不同細(xì)胞的復(fù)制參數(shù)

原核生物（大腸桿菌）真核生物（人）細(xì)胞內(nèi)50§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特點(diǎn)：1.以4種dNTP為底物；2.反應(yīng)需要接受模板指導(dǎo)；3.反應(yīng)需要有3’-OH存在；4.DNA鏈的合成方向?yàn)?’3’；5.產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同?！?-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白一、DNA聚合酶DNAPo51第二章DNA復(fù)制與損傷教材課件52(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一種多功能酶。包括：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。從3′端將DNA鏈水解，DNA的校對（proofreading）功能。從5′端將DNA鏈水解，DNA的修復(fù)功能。將dNTP加到DNA鏈的3′-OH上，DNA的聚合功能。(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一種多功能酶。包括：553第二章DNA復(fù)制與損傷教材課件54klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水解為一大一小兩個片段。較大的C末端片斷分子量為68KD，叫klenow片斷，具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的外切酶活性，常用做體外合成DNA的工具酶。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性從5′端切除DNA受損傷的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性隨即開始工作，使DNA鏈向3′端延伸，這稱為切口平移（nicktranslation）。在DNA復(fù)制中，RNA引物的切除；DNA的損傷修復(fù)；在體外，制備高放射性活性的DNA探針。klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理可以將DNA聚合酶I水55(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)

1.α亞基、ε亞基和θ亞基相連組成核心酶（coreenzyme）α亞基具有5′→3′的聚合酶活性.ε亞基具有3′→5′的外切酶活性.

θ亞基可能起組建的作用.(二)DNA聚合酶Ⅲ多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)562.DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.β亞基的功能猶如夾子:提高了酶的持續(xù)合成能力.

夾子裝置器（clamploader）:兩個γ亞基與另4個亞基（δ亞基、δ′亞基、χ亞基、ψ亞基）構(gòu)成γ復(fù)合物，其主要功能時幫助β亞基夾住DNA，故稱夾子裝置器。γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶

τ亞基起促使核心酶二聚化的作用

2.DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.β亞基的功能猶如夾子:提57二、DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAGyrase)DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個負(fù)超螺旋,可去除解螺旋產(chǎn)生的扭曲張力.并依賴于β亞基催化ATP水解,以使酶構(gòu)象復(fù)原.DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制細(xì)菌的合成.二、DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAGyrase)DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一58三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和單鏈結(jié)合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。防止核酸水解酶的作用

避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈對單鏈DNA有很高的親和性

它們與DNA結(jié)合時有協(xié)同作用2.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：三、DNA解旋酶(DNAHelicase)1.DNA解螺旋59

RNA聚合酶[RifS]完成對先導(dǎo)鏈引物的合成

實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始引發(fā)酶[RifR]

完成對后隨鏈引物的合成

較先導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII進(jìn)行DNA鏈的延伸

四、引發(fā)酶(Primerase)RNA聚合酶[RifS]完成對先導(dǎo)鏈引物的合60酶-AMP將腺苷?；ˋMP）轉(zhuǎn)移給DNA切口處的5′磷酰基團(tuán)，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。五、連接酶(Ligase)DNA連接酶催化雙股鏈內(nèi)相鄰單鏈切口的3′-OH與5′-P?；纬闪姿狨ユI。酶的活化通過相鄰DNA的3′-OH對活化的P原子進(jìn)行親核攻擊，生成3′，5′-磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。

催化過程：

腺苷?；疍NA親核攻擊完成DNA連接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），與酶活性中心的賴氨酸殘基的ε-NH2以磷酰胺鍵結(jié)合，形成共價中間體酶-AMP；

。

酶-AMP將腺苷?；ˋMP）轉(zhuǎn)移給DNA切口處的5′磷酰61§3-3DNA的復(fù)制過程一、E.coli的DNA復(fù)制（環(huán)型雙股DNA，雙向θ方式）分為三個階段：起始、延伸和終止復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成復(fù)合物稱為復(fù)制體。DNA復(fù)制的階段表現(xiàn)在于復(fù)制體結(jié)構(gòu)的變化。§3-3DNA的復(fù)制過程一、E.coli的DNA復(fù)制（環(huán)型62復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，它們構(gòu)成復(fù)合物稱為復(fù)制體。一、DNA復(fù)制的半保留性（2）AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開。DNA的損傷是指正常DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或物理結(jié)構(gòu)在某些物理、化學(xué)因素（如射線和化學(xué)試劑）以及細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的基因毒素等干擾作用下發(fā)生改變的現(xiàn)象。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，(2)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)3'端一邊時，修復(fù)途徑類似。O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。（四）重組修復(fù)（recombinationrepair）三、D環(huán)復(fù)制（displacementreplication）DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。并依賴于β亞基催化ATP水解,以使酶構(gòu)象復(fù)原.即能啟動DNA復(fù)制開始的基因組上的DNA順序，包括復(fù)制原點(diǎn)和引發(fā)復(fù)制的結(jié)構(gòu)基因，以及在其控制下的DNA區(qū)段統(tǒng)稱為復(fù)制子。DNA復(fù)制是一個由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控的過程；Polδ（2亞基）：有持續(xù)合成DNA鏈的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈（baseexcisionrepair）γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。分別為polα、β、γ、δ、ε。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性從5′端切除DNA受損傷的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性隨即開始工作，使DNA鏈向3′端延伸，這稱為切口平移（nicktranslation）。復(fù)制子平均長度（kb）復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成的生長點(diǎn)，即復(fù)制叉632.復(fù)制的終止1.環(huán)行E.coli染色體上的兩個復(fù)制叉相遇在排列有許多重復(fù)拷貝Ter序列（長約22bp）的一個終止區(qū)域（terminus），并停止復(fù)制。2.稱為Tus(terminusutilizatlconsubstance，終點(diǎn)利用物質(zhì)）的蛋白質(zhì)的結(jié)合于Ter序列，Tus_—Ter復(fù)合物只能夠阻止一個方向的復(fù)制叉。3.E.coli分開連鎖體需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（屬于類型Ⅱtopo酶）參與作用。分開兩閉合環(huán)。2.復(fù)制的終止1.環(huán)行E.coli染色體上的兩個復(fù)制叉相遇在64二、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）ΦX174的基因組DNA是單鏈環(huán)型DNA，復(fù)制中首先合成其互補(bǔ)鏈（而非其自身），形成復(fù)制型（replicationform,RF），然后進(jìn)行滾環(huán)型（roollingcircle）復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3‘_OH上不斷地發(fā)生DNA聚合物作用，因而也叫共價延伸（covalenceelongation）。

二、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplicat65三、D環(huán)復(fù)制（displacement

replication）線粒體DNA的雙股鏈分為輕鏈和重鏈。它的復(fù)制是一種單向不對稱的特殊復(fù)制方式,稱為Ｄ—環(huán)復(fù)制。復(fù)制從重鏈（Ｈ鏈）的原點(diǎn)開始，新合成的Ｈ鏈置換原來鏈，游離的單鏈稱為取代鏈（displacement）或Ｄ環(huán)。當(dāng)Ｈ鏈合成進(jìn)行到約2/3時，輕鏈（Ｌ鏈）的原點(diǎn)暴露出來，并引發(fā)其合成，延伸方向與Ｈ鏈的相反。三、D環(huán)復(fù)制（displacementreplicatio66四、真核生物復(fù)制特點(diǎn)（一）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的相同點(diǎn)。（二）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：１．真核DNA有多個復(fù)制原點(diǎn)；2．真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前不能再重新開始復(fù)制，而在快速生長的原核生物中起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。3．真核生物復(fù)制的調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物更為復(fù)雜。4．真核生物有多種聚合酶。四、真核生物復(fù)制特點(diǎn)（一）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA67從哺乳動物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。無外切酶活性。持續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。Polδ（2亞基）：有持續(xù)合成DNA鏈的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。

Polε（>1亞基）：相當(dāng)于E.coli的polⅠ，是一種修復(fù)酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亞基）：與損傷修復(fù)有關(guān)。Polγ（2亞基）：是線粒體DNA合成酶（3'→5'外切酶）

從哺乳動物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ68五、真核生物端粒的復(fù)制五、真核生物端粒的復(fù)制69（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力.3．真核生物復(fù)制的調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物更為復(fù)雜。親核攻擊完成DNA連接MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，直接修復(fù)是指不需要移去任何堿基或核苷酸就可以將損傷逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)的修復(fù)機(jī)制。DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)的生物大分子。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。催化酶：Dam甲基化酶滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3‘_OH上不斷地發(fā)生DNA聚合物作用，因而也叫共價延伸（covalenceelongation）?！?-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)(1)當(dāng)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)5'端時，去甲基化以3'→5'方向降解（從切點(diǎn)→錯配點(diǎn)）?！穸肆NA(Telomer)DNA解螺旋酶是利用ATP水解獲得的能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。(二)DNA聚合酶ⅢO6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以將甲基轉(zhuǎn)移到酶自身的半胱氨酸殘基上。應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)的催化過程（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以70七、DNA復(fù)制的忠實(shí)性1.DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行的。

2.DNA聚合酶本身具有校正功能。

5.DNA的錯配校正和修復(fù)系統(tǒng)保證DNA復(fù)制的忠實(shí)性。3.RNA引物的存在與清除有利于降低錯配率。

4.DNA聚合酶催化的反應(yīng)機(jī)制，即DNA聚合酶僅催化5'→3'方向的反應(yīng)。七、DNA復(fù)制的忠實(shí)性1.DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)71§3-4DNA的損傷及修復(fù)一、DNA的損傷DNA的損傷是指正常DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)或物理結(jié)構(gòu)在某些物理、化學(xué)因素（如射線和化學(xué)試劑）以及細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的基因毒素等干擾作用下發(fā)生改變的現(xiàn)象。（P221）（一）物理因素如電離輻射：使鏈的斷裂、堿基及五碳糖的損傷。紫外照射（254nm）：使DNA分子的相鄰的2個T形成二聚體（環(huán)丁基二聚體）；（二）化學(xué)因素1.烷基化

2.亞硝基

3.堿基類似物4.吖啶類分子，如EB§3-4DNA的損傷及修復(fù)一、DNA的損傷DNA的損傷是指72（三）自發(fā)性損傷1.脫嘌呤和脫嘧啶(AP位點(diǎn)的產(chǎn)生)2.堿基的脫氨基作用3.堿基的互變異構(gòu)4.細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對DNA的損傷（三）自發(fā)性損傷1.脫嘌呤和脫嘧啶(AP位點(diǎn)的產(chǎn)生)2.73二、DNA的損傷修復(fù)（一）錯配修復(fù)1.模板區(qū)分機(jī)制催化酶：Dam甲基化酶發(fā)生時制：DNA復(fù)制后的一段時間內(nèi)（約幾秒或幾分鐘）發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以發(fā)生甲基化。二、DNA的損傷修復(fù)（一）錯配修復(fù)1.模板區(qū)分機(jī)制催化酶：742.修復(fù)位點(diǎn)的識別MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，MutH結(jié)合于GATC順序；MutL可以與MutS形成復(fù)合物，并與MutH結(jié)合，在錯配堿基兩邊的DNA鏈沿著復(fù)合物的移動是等速，穿過MutL—MutS復(fù)合物產(chǎn)生一個DNA環(huán)，直到復(fù)合物碰上甲基化的GATC順序。MutH催化切斷GATC順序G堿基5‘一邊的未甲基化鏈，給該修復(fù)的鏈作上記號。2.修復(fù)位點(diǎn)的識別MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，MutH結(jié)合75γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶成串排列3個13bp重復(fù)序列(GATCTNTTNTTTT)（二）切除修復(fù)（excisionrepair）二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制（二）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：光復(fù)活酶在生物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物一直到鳥類都有。5’OH3’五、真核生物端粒的復(fù)制在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。一、DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA聚合酶本身具有校正功能。MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，5’3’聚合酶活性。§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白§3-3DNA的復(fù)制過程§3-4DNA的損傷及修復(fù)MutS結(jié)合在錯配位點(diǎn)，應(yīng)急反應(yīng)（SOS）：許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。多亞基不對稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)一、DNA復(fù)制的半保留性3.修復(fù)的切割與聚合(1)當(dāng)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)5'端時，去甲基化以3'→5'方向降解（從切點(diǎn)→錯配點(diǎn)）。這個過程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

-外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA連接酶。

(2)錯配點(diǎn)在切點(diǎn)3'端一邊時，修復(fù)途徑類似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解單鏈DNA）。γ亞基是一種依賴于DNA的ATP酶3.修復(fù)的切割與聚合(76（二）切除修復(fù)（excisionrepair）

1.堿基切割修復(fù)（baseexcisionrepair）（1）由細(xì)胞內(nèi)一類特異的DNA糖苷酶（glycosylase）識別DNA中不正常的堿基，并將其水解下來，形成AP位點(diǎn)。

（2）AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開。（不同AP核酸內(nèi)切酶的作用方式不同，或是在5'側(cè)切開，或是在3'側(cè)切開）。

（3）核酸外切酶將包括AP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA鏈切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。（二）切除修復(fù)（excisionrepair）1.堿基77AP位點(diǎn)的產(chǎn)生AP位點(diǎn)的產(chǎn)生782.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一種核酸內(nèi)切酶，但與一般的核酸內(nèi)切酶不同，在鏈的損傷兩側(cè)同時切開。編碼此酶的基因是Uvr基因。大腸桿菌中ABC切除酶催化過程：①UvrA和UvrB復(fù)合物（A2B）尋找并結(jié)合到損傷部位。②UvrA離解，UvrB與DN