第七章色譜法分離原理課件

第七章色譜法分離原理第七章色譜法分離原理§7—1概述★色譜法是一種分離技術(shù)，

是混合物最有效的分離、

分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置——色譜原型裝置，如右圖所示?！?—1概述★色譜法是一種分離技術(shù)，茨維特實(shí)驗(yàn)茨維特實(shí)驗(yàn)一、色譜：色譜法又叫色層法、層析法，以試樣組分在固定相和流動(dòng)相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的各種分離分析方法。色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長(zhǎng)管。固定相：管內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。流動(dòng)相：流經(jīng)固定相的空隙或表面的沖洗劑。一、色譜：色譜法又叫色層法、層析法，以試樣組分在固定相和流動(dòng)色譜法分離實(shí)質(zhì)：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。色譜法分離實(shí)質(zhì)：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)二、色譜分析法的崛起：二、色譜分析法的崛起：三、色譜的分類：1.按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類：色譜氣相色譜（流→氣）液相色譜（流→液）氣－固色譜氣－液色譜液－固色譜液－液色譜三、色譜的分類：1.按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類：色譜氣相2.按產(chǎn)生分離過程的相系統(tǒng)的形式分類：柱色譜法毛細(xì)管色譜法平板色譜法用玻璃柱子做色譜柱，固定相填裝在柱子中用毛細(xì)管做色譜柱，固定相填裝在管壁用平整的板子作固定相支持的載體，固定相平鋪在板上2.按產(chǎn)生分離過程的相系統(tǒng)的形式分類：柱色譜法毛細(xì)管色譜法平3.按分離過程原理分類：吸附萃取靜電作用和擴(kuò)散擴(kuò)散生物特性吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜生物親和色譜3.按分離過程原理分類：吸附萃取靜電作用和擴(kuò)散擴(kuò)散生物特性4.按展開程序分類：洗脫法頂替法迎頭法組分與固定相作用力＞流動(dòng)相與固定相作用力組分與固定相作用力＜流動(dòng)相或其他物質(zhì)與固定相作用力將試樣連續(xù)地通過色譜柱，吸附或溶解最弱的組分，首先以純物質(zhì)狀態(tài)流出色譜柱，然后順次流出的是次弱組分和第一流出組分的混合物，依次類推，從而實(shí)現(xiàn)混合物分離的色譜法。4.按展開程序分類：洗脫法頂替法迎頭法組分與固定相作用四、色譜法的特點(diǎn)：●分離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體，手性異構(gòu)體?！耢`敏度高可以檢測(cè)出10-6級(jí)甚至10-9級(jí)的物質(zhì)量?！穹治鏊俣瓤煲话阍趲追昼娀驇资昼妰?nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析?！駪?yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點(diǎn)≤400℃的各種有機(jī)或無機(jī)樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。●不足之處：被分離組分的定性較為困難。四、色譜法的特點(diǎn)：●分離效率高五、色譜分離過程：色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的五、色譜分離過程：色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的§7—2線性洗脫色譜及名詞術(shù)語一、線性洗脫色譜：1.分配等溫線與分配系數(shù)K：●分配等溫線：在一定溫度下，溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間的分配曲線，此曲線稱為分配等溫線?！穹峙湎禂?shù)K：分配等溫線的斜率?！?—2線性洗脫色譜及名詞術(shù)語一、線性洗脫色譜：1.分配①若K與濃度無關(guān)，則分配等溫線為直線；②在色譜過程中，圖中的C、D型很少出現(xiàn)；

A、B型常見，但不能用于測(cè)定；③在溶質(zhì)濃度低時(shí)，Cs

基本上正比于Cm，曲線近似直線。①若K與濃度無關(guān)，則分②在色譜過程中，圖中③在溶質(zhì)濃度2.線性洗脫色譜：●在色譜中，分配系數(shù)K為常數(shù)時(shí)所進(jìn)行的色譜過程，即稱為線性洗脫色譜。結(jié)論：CS值大，則K值大，溶質(zhì)進(jìn)入固定相的量就多。推論：溶質(zhì)流過色譜柱時(shí)，分配系數(shù)K值大的組分通過色譜柱所需時(shí)間長(zhǎng)，而K值小的組分通過色譜柱所需時(shí)間短。當(dāng)樣品中各組分在兩相的分配系數(shù)K不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離的目的。2.線性洗脫色譜：●在色譜中，分配系數(shù)K為常數(shù)時(shí)所進(jìn)行的色譜二、相關(guān)術(shù)語：二、相關(guān)術(shù)語：色譜圖：色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖。縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留值。色譜圖：色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線只有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，在實(shí)驗(yàn)操作條件下，反映檢測(cè)器噪聲隨時(shí)間變化的曲線。色譜峰（樣品峰）頂點(diǎn)到基線之間的垂直距離，以h表示。只有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，在實(shí)驗(yàn)操作條件下，反映檢測(cè)器噪聲隨時(shí)保留值：（熱力學(xué)因素）——即組分在色譜柱中固定相上停留的時(shí)間。不被固定相吸附或溶解的組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)該物質(zhì)的峰極大點(diǎn)時(shí)所需的時(shí)間，用tM表示。被分析組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)被分析組分的峰極大點(diǎn)時(shí)所需要的時(shí)間（它包括組分通過色譜柱所需時(shí)間和組分與固定相作用所需的時(shí)間。）

，用tR表示。某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后所剩的時(shí)間，用表示。

=tR-tM

保留值：（熱力學(xué)因素）——即組分在色譜柱中固不被固定相吸附或①式中各項(xiàng)單位可用min、s、cm等表示；③保留時(shí)間是色譜定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間受流動(dòng)相流速的影響，因此，色譜定性分析常采用保留體積等定性。=tR-tM

②實(shí)際上是組分在固定相中停留的總時(shí)間；①式中各項(xiàng)單位可用min、s、cm等表示；③保留時(shí)間死體積VM：指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒之間的空間、色譜儀器管路的空間及檢測(cè)器的空間的總和?；蛘哒f，在死時(shí)間內(nèi)通過色譜柱的流動(dòng)相體積。

VM=tM×F0（流動(dòng)相流速，L/min）保留體積VR：在保留時(shí)間內(nèi)通過色譜柱的流動(dòng)相體積。即將組分從柱中帶出所需的流動(dòng)相體積。

VR=tR×F0死體積VM：指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒之間的空間、色相對(duì)保留值r21：某組分2與組分1的調(diào)整保留值之比。某組分的保留體積扣除死體積后的剩余體積，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

=VR-VM

調(diào)整保留體積：相對(duì)保留值r21：某組分2與組分1的調(diào)整保留值之比。某組分①r21只與色譜柱溫度和固定相的性質(zhì)有關(guān)，與色譜柱的柱長(zhǎng)、柱徑、填充情況以及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它是一個(gè)廣泛使用的定性數(shù)據(jù)；②

在多元混合物分析時(shí)，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種情況下，r21可用α表示：

為后出峰的組分的調(diào)整保留時(shí)間，故α總是大于1的。①r21只與色譜柱溫度和固定相的性質(zhì)有關(guān)，與色②在多元混分配比k：也稱容量因子。它是指組分在固定相和流動(dòng)相中的分配量之比。分配比k：也稱容量因子。它是指組分在固定相和流動(dòng)相中的分配量區(qū)域?qū)挾龋海▌?dòng)力學(xué)因素）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，用Y1/2表示。色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，用Y表示。

Y＝4σ區(qū)域?qū)挾龋海▌?dòng)力學(xué)因素）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜三、色譜圖的作用：三、色譜圖的作用：§7—3色譜法基本原理一、色譜法中組分分離條件A、B兩組分沿色譜柱移動(dòng)時(shí)，不同位置處的濃度輪廓§7—3色譜法基本原理一、色譜法中組分分離條件A、B兩組第七章色譜法分離原理課件①兩組分的分配系數(shù)必須有差異；②區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)該小于區(qū)域分離的速率；必要條件③在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。①兩組分的分配系數(shù)必須有②區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)該小于必要條件二、色譜法基本理論<一>塔板理論1.理論假設(shè)

將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成，每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。二、色譜法基本理論<一>塔板理論1.理論假設(shè)第七章色譜法分離原理課件②流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積(ΔVm)；③所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略；④分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。塔板理論假設(shè)：①在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H；②流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是③所有組分開始時(shí)存第七章色譜法分離原理課件2.理論塔板數(shù)（溶質(zhì)平衡次數(shù)）根據(jù)塔板理論假設(shè)，在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。對(duì)于一根長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：理論塔板數(shù)色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。色譜柱分離混合組分的能力2.理論塔板數(shù)（溶質(zhì)平衡次數(shù)）根據(jù)塔板理論假設(shè)，在每一塊塔板3．塔板理論對(duì)色譜的解釋：第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n

大于50時(shí)，可得到基本對(duì)稱的峰形曲線；第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離；第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：即在tR一定時(shí)，若色譜峰越窄，則n值越大，H越小，柱效能越高。3．塔板理論對(duì)色譜的解釋：第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理4.有效塔板數(shù)注意：同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不同的。當(dāng)選用這些指標(biāo)表示柱效時(shí)，應(yīng)指明對(duì)何種物質(zhì)而言。4.有效塔板數(shù)注意：同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不5.塔板理論的特點(diǎn)①定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率；●成功點(diǎn)：②解釋了流出曲線的形狀；③提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效能高低的參數(shù)。●不足點(diǎn)：①定性地給出板高的概念，卻不能找出影響板高的因素；②不能說明為什么在不同的流速下，可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)。5.塔板理論的特點(diǎn)①定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率；<二>速率理論：速率理論指出：在色譜分離過程中，譜峰的擴(kuò)寬受渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力三個(gè)動(dòng)力學(xué)因素的控制。板高方程為：A、B、C——

常數(shù)。A為渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)

B為分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)

C為傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)——

流動(dòng)相的平均線速度；<二>速率理論：速率理論指出：在色譜分離過程中，譜峰的擴(kuò)

一定時(shí)，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，板高H才能小，柱效才會(huì)高；反之，則柱效低，色譜峰擴(kuò)張。一定時(shí)，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，板高H才能小，柱效才會(huì)高1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）變寬的程度由下式?jīng)Q定：A=2λdp①A與填充物的平均直徑dp和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)；②使用顆粒細(xì)和均勻的填料，采用均勻填充，是減小渦流擴(kuò)散和提高柱效的有效途徑。1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）變寬的程度由下式?jīng)Q定：A=2λdp①第七章色譜法分離原理課件氣體分子的分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B為：B=2γDgγ——

彎曲因子。它表示柱填充物對(duì)分子擴(kuò)散的阻礙程度。Dg——

組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2.s-1）。Dg除與組分性質(zhì)有關(guān)外，還與組分在氣相中的保留時(shí)間、柱溫、柱壓和載氣的性質(zhì)等因素有關(guān)。2.分子擴(kuò)散項(xiàng)（）氣體分子的分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B為：B=2γDgγ——彎曲因子。第七章色譜法分離原理課件為減小分子擴(kuò)散引起的色譜峰變寬，可采用：①用較高的載氣流速；②使用相對(duì)分子量較大的載氣；③控制較低的柱溫。為減小分子擴(kuò)散引起的色譜峰變寬，可采用：①用較高的載氣流速3.傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cǔ）物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質(zhì)遷移（從一相轉(zhuǎn)入另一相）過程。影響傳質(zhì)過程進(jìn)行速度的阻力。傳質(zhì)：傳質(zhì)阻力：①氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg

Cg——描述影響組分從氣相轉(zhuǎn)移到固定相表面這一過程的傳質(zhì)速度的因素。造成譜峰擴(kuò)寬3.傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cǔ）物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質(zhì)遷移第七章色譜法分離原理課件對(duì)于填充柱：采用粒度小的填充物和相對(duì)分子量小的載氣，可減小Cg值，提高柱效。②液相傳質(zhì)阻力系數(shù)ClCl——描述影響組分在液相中傳質(zhì)速度的因素。對(duì)于填充柱：采用粒度小的填充物和相對(duì)分子量小的載氣，可減小a.降低固定液含量，df減小，但容量因子k也隨之變小，對(duì)分離不利；b.固定液含量一定時(shí)，df值隨載體的比表面積增加而降低。因此，一般用比表面積較大的載體來降低df值；c.提高柱溫，Dl增大，但k值減小，故應(yīng)控制適當(dāng)?shù)闹鶞亍p小固定液的液膜厚度df，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)Dl，可以減小Cl值。a.降低固定液含量，df減小，但容量因子k也b.固定液含量一4.范氏方程式（速率理論方程式：）選擇色譜分離條件具有重要的指導(dǎo)意義。它可以說明固定相的填充均勻程度、粒度、液膜厚度、載氣種類和流速等因素的變化對(duì)柱效和色譜峰展寬的影響。4.范氏方程式（速率理論方程式：）選擇色譜分離條件具有重要§7—4分離度一、柱效和選擇性柱效——色譜柱對(duì)相鄰兩峰分離的能力。用理論塔板數(shù)n或有效塔板數(shù)n有效進(jìn)行衡量選擇性——色譜圖上兩峰之間的距離大小。①一般用相對(duì)保留值α表示兩組分在給定色譜柱上的選擇性；②色譜柱的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學(xué)性質(zhì)?！?—4分離度一、柱效和選擇性柱效——色譜柱對(duì)相鄰兩峰分二、總分離效能指標(biāo)——分離度Rs：<一>分離度Rs：定義：相鄰兩組分色譜峰保留值之差與該兩組分色譜峰基線寬度平均值之比。定義式：二、總分離效能指標(biāo)——分離度Rs：<一>分離度Rs：定義：①當(dāng)Rs＜1時(shí)，兩色譜峰總是有部分重疊；②當(dāng)Rs=1.0時(shí)，兩色譜峰的分離程度可達(dá)

98%；③當(dāng)Rs=1.5時(shí)，兩色譜峰的分離程度達(dá)

99.7%。④當(dāng)Rs值更大時(shí)，分離效果更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，使色譜峰變寬，對(duì)分析反而不利。Rs=1.5為相鄰兩色譜峰完全分離的標(biāo)志①當(dāng)Rs＜1時(shí)，兩色譜峰總是有部分重疊；②當(dāng)Rs=1.0<二>影響Rs的因素：

②容量因子k值增大，分離度增大，分析時(shí)間延長(zhǎng)，甚至造成譜帶檢測(cè)困難。通?？刂迫萘恳蜃觡=2～7；③相對(duì)保留值α有微小增大，都會(huì)使Rs值有較大增加。當(dāng)α=1時(shí)，Rs=0,不能分離。增加塔板數(shù)，可以增加分離度。①Rs∝（降低板高的方法來增大塔板數(shù)）<二>影響Rs的因素：②容量因子k值增大，分離度增大，第七章色譜法分離原理課件§7—5色譜定性分析和定量分析一、定性分析：●色譜定性分析的任務(wù)：比較已知物質(zhì)與未知物質(zhì)在相同條件下的保留參數(shù)或在固定相上的位置，即可確定物質(zhì)物質(zhì)是何種物質(zhì)。確定色譜圖上每一個(gè)色譜峰所代表的是什么物質(zhì)?！穹椒ǎ骸?—5色譜定性分析和定量分析一、定性分析：●色譜定性分二、定量分析<一>色譜定量分析的理論依據(jù)：在一定色譜條件下，組分的質(zhì)量或其在流動(dòng)相中的濃度，與檢測(cè)器的響應(yīng)值成正比。絕對(duì)校正因子絕對(duì)校正因子色譜峰面積色譜峰峰高二、定量分析<一>色譜定量分析的理論依據(jù)：在一定色譜條件下，<二>峰高和峰面積的測(cè)定峰高——從色譜圖上直接測(cè)量。峰面積——計(jì)算的辦法求得：<二>峰高和峰面積的測(cè)定峰高——從色譜圖上直接測(cè)量。峰面積<三>定量校正因子1.絕對(duì)校正因子絕對(duì)校正因子表示單位峰面積或單位峰高所代表的物質(zhì)質(zhì)量：不易準(zhǔn)確測(cè)量不易準(zhǔn)確測(cè)量<三>定量校正因子1.絕對(duì)校正因子絕對(duì)校正因子表示單位峰面2.相對(duì)校正因子fis①相對(duì)校正因子：是指某組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)S的絕對(duì)校正因子之比。質(zhì)量校正因子：②相對(duì)校正因子的測(cè)定準(zhǔn)確稱取被測(cè)組分和標(biāo)準(zhǔn)組分的量，然后在實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，測(cè)量各色譜峰的面積或峰高，代入fis表達(dá)式計(jì)算。2.相對(duì)校正因子fis①相對(duì)校正因子：是指某組分i與基準(zhǔn)物<四>定量方法1.外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法：①方法：將待測(cè)組分的純物質(zhì)配成不同含量的標(biāo)液，定量進(jìn)樣，然后以色譜圖上對(duì)應(yīng)的峰面積或峰高對(duì)百分含量作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下，注入同體積的試樣分析，用內(nèi)插法定量。②特點(diǎn)：¤

操作簡(jiǎn)單，不需測(cè)定校正因子；¤

適合工廠控制和自動(dòng)化分析。<四>定量方法1.外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法：①方法：將待測(cè)組2.歸一化法：若試樣中有n各組分，則組分i的百分含量為：①使用條件：樣品中所有組分必須都能產(chǎn)生可測(cè)量的色譜峰。②特點(diǎn)：¤

簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，操作條件對(duì)分析影響較小；¤

適于進(jìn)樣量不易測(cè)量準(zhǔn)確的樣品。2.歸一化法：若試樣中有n各組分，則組分i的百分含量為：①3.內(nèi)標(biāo)法：①方法：在一定量的試樣中，加入一定量某種純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行色譜分析。根據(jù)被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，即可求得被測(cè)物的含量。設(shè)：組分i的質(zhì)量為mi試樣質(zhì)量為M加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量為ms3.內(nèi)標(biāo)法：①方法：在一定量的試樣中，加入一定量某種純物質(zhì)以內(nèi)標(biāo)物作基準(zhǔn)物質(zhì)，則以內(nèi)標(biāo)物作基準(zhǔn)物質(zhì)，則②要求：a內(nèi)標(biāo)物必須是試樣中不存在的物質(zhì)；b內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)與試樣中各組分峰分開；c內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)盡量接近欲分析峰。③特點(diǎn)：¤

定量準(zhǔn)確；¤

操作條件影響較?。弧?/p>

每次測(cè)定都必須準(zhǔn)確稱量。②要求：a內(nèi)標(biāo)物必須是試樣中不存在的b內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)與試樣中例：用3米長(zhǎng)的填充柱進(jìn)行色譜分離，得到如下圖所示的分離。為了使二者剛好能夠分離完全，柱子長(zhǎng)度最短需多少？例：用3米長(zhǎng)的填充柱進(jìn)行色譜分離，得到如解：分析：分離完全？Rs＝1.5最短柱長(zhǎng)？分離條件不變，H、k2、α為常數(shù)解：分析：分離完全？Rs＝1.5最短柱長(zhǎng)？分離條件不變，H、解：∵∴

由題可知，分離條件未變，故板高H、相對(duì)保留值α、容量因子k等不變，它們是常數(shù)，則有：解：∵∴由題可知，分離條件未變，故板高H、相對(duì)保留值α、對(duì)于3米長(zhǎng)的色譜柱，由題給的條件可計(jì)算出它的分離度Rs值。由圖可知：∵∴對(duì)于3米長(zhǎng)的色譜柱，由題給的條件可計(jì)算出它的分離度Rs值。由若要完全分離，則要求Rs＝1.5，設(shè)此時(shí)需要柱長(zhǎng)為L(zhǎng)x，則有：解之得：答：（略）若要完全分離，則要求Rs＝1.5，設(shè)此時(shí)需要柱長(zhǎng)為L(zhǎng)x，則有本章結(jié)束本章結(jié)束第七章色譜法分離原理第七章色譜法分離原理§7—1概述★色譜法是一種分離技術(shù)，

是混合物最有效的分離、

分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置——色譜原型裝置，如右圖所示。§7—1概述★色譜法是一種分離技術(shù)，茨維特實(shí)驗(yàn)茨維特實(shí)驗(yàn)一、色譜：色譜法又叫色層法、層析法，以試樣組分在固定相和流動(dòng)相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的各種分離分析方法。色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長(zhǎng)管。固定相：管內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。流動(dòng)相：流經(jīng)固定相的空隙或表面的沖洗劑。一、色譜：色譜法又叫色層法、層析法，以試樣組分在固定相和流動(dòng)色譜法分離實(shí)質(zhì)：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。色譜法分離實(shí)質(zhì)：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)二、色譜分析法的崛起：二、色譜分析法的崛起：三、色譜的分類：1.按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類：色譜氣相色譜（流→氣）液相色譜（流→液）氣－固色譜氣－液色譜液－固色譜液－液色譜三、色譜的分類：1.按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類：色譜氣相2.按產(chǎn)生分離過程的相系統(tǒng)的形式分類：柱色譜法毛細(xì)管色譜法平板色譜法用玻璃柱子做色譜柱，固定相填裝在柱子中用毛細(xì)管做色譜柱，固定相填裝在管壁用平整的板子作固定相支持的載體，固定相平鋪在板上2.按產(chǎn)生分離過程的相系統(tǒng)的形式分類：柱色譜法毛細(xì)管色譜法平3.按分離過程原理分類：吸附萃取靜電作用和擴(kuò)散擴(kuò)散生物特性吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜生物親和色譜3.按分離過程原理分類：吸附萃取靜電作用和擴(kuò)散擴(kuò)散生物特性4.按展開程序分類：洗脫法頂替法迎頭法組分與固定相作用力＞流動(dòng)相與固定相作用力組分與固定相作用力＜流動(dòng)相或其他物質(zhì)與固定相作用力將試樣連續(xù)地通過色譜柱，吸附或溶解最弱的組分，首先以純物質(zhì)狀態(tài)流出色譜柱，然后順次流出的是次弱組分和第一流出組分的混合物，依次類推，從而實(shí)現(xiàn)混合物分離的色譜法。4.按展開程序分類：洗脫法頂替法迎頭法組分與固定相作用四、色譜法的特點(diǎn)：●分離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體，手性異構(gòu)體?！耢`敏度高可以檢測(cè)出10-6級(jí)甚至10-9級(jí)的物質(zhì)量?！穹治鏊俣瓤煲话阍趲追昼娀驇资昼妰?nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析?！駪?yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點(diǎn)≤400℃的各種有機(jī)或無機(jī)樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析?！癫蛔阒帲罕环蛛x組分的定性較為困難。四、色譜法的特點(diǎn)：●分離效率高五、色譜分離過程：色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的五、色譜分離過程：色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的§7—2線性洗脫色譜及名詞術(shù)語一、線性洗脫色譜：1.分配等溫線與分配系數(shù)K：●分配等溫線：在一定溫度下，溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間的分配曲線，此曲線稱為分配等溫線?！穹峙湎禂?shù)K：分配等溫線的斜率?！?—2線性洗脫色譜及名詞術(shù)語一、線性洗脫色譜：1.分配①若K與濃度無關(guān)，則分配等溫線為直線；②在色譜過程中，圖中的C、D型很少出現(xiàn)；

A、B型常見，但不能用于測(cè)定；③在溶質(zhì)濃度低時(shí)，Cs

基本上正比于Cm，曲線近似直線。①若K與濃度無關(guān)，則分②在色譜過程中，圖中③在溶質(zhì)濃度2.線性洗脫色譜：●在色譜中，分配系數(shù)K為常數(shù)時(shí)所進(jìn)行的色譜過程，即稱為線性洗脫色譜。結(jié)論：CS值大，則K值大，溶質(zhì)進(jìn)入固定相的量就多。推論：溶質(zhì)流過色譜柱時(shí)，分配系數(shù)K值大的組分通過色譜柱所需時(shí)間長(zhǎng)，而K值小的組分通過色譜柱所需時(shí)間短。當(dāng)樣品中各組分在兩相的分配系數(shù)K不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離的目的。2.線性洗脫色譜：●在色譜中，分配系數(shù)K為常數(shù)時(shí)所進(jìn)行的色譜二、相關(guān)術(shù)語：二、相關(guān)術(shù)語：色譜圖：色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖?？v坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留值。色譜圖：色譜柱流出物通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線只有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，在實(shí)驗(yàn)操作條件下，反映檢測(cè)器噪聲隨時(shí)間變化的曲線。色譜峰（樣品峰）頂點(diǎn)到基線之間的垂直距離，以h表示。只有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，在實(shí)驗(yàn)操作條件下，反映檢測(cè)器噪聲隨時(shí)保留值：（熱力學(xué)因素）——即組分在色譜柱中固定相上停留的時(shí)間。不被固定相吸附或溶解的組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)該物質(zhì)的峰極大點(diǎn)時(shí)所需的時(shí)間，用tM表示。被分析組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)被分析組分的峰極大點(diǎn)時(shí)所需要的時(shí)間（它包括組分通過色譜柱所需時(shí)間和組分與固定相作用所需的時(shí)間。）

，用tR表示。某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后所剩的時(shí)間，用表示。

=tR-tM

保留值：（熱力學(xué)因素）——即組分在色譜柱中固不被固定相吸附或①式中各項(xiàng)單位可用min、s、cm等表示；③保留時(shí)間是色譜定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間受流動(dòng)相流速的影響，因此，色譜定性分析常采用保留體積等定性。=tR-tM

②實(shí)際上是組分在固定相中停留的總時(shí)間；①式中各項(xiàng)單位可用min、s、cm等表示；③保留時(shí)間死體積VM：指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒之間的空間、色譜儀器管路的空間及檢測(cè)器的空間的總和?；蛘哒f，在死時(shí)間內(nèi)通過色譜柱的流動(dòng)相體積。

VM=tM×F0（流動(dòng)相流速，L/min）保留體積VR：在保留時(shí)間內(nèi)通過色譜柱的流動(dòng)相體積。即將組分從柱中帶出所需的流動(dòng)相體積。

VR=tR×F0死體積VM：指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒之間的空間、色相對(duì)保留值r21：某組分2與組分1的調(diào)整保留值之比。某組分的保留體積扣除死體積后的剩余體積，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

=VR-VM

調(diào)整保留體積：相對(duì)保留值r21：某組分2與組分1的調(diào)整保留值之比。某組分①r21只與色譜柱溫度和固定相的性質(zhì)有關(guān)，與色譜柱的柱長(zhǎng)、柱徑、填充情況以及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它是一個(gè)廣泛使用的定性數(shù)據(jù)；②

在多元混合物分析時(shí)，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種情況下，r21可用α表示：

為后出峰的組分的調(diào)整保留時(shí)間，故α總是大于1的。①r21只與色譜柱溫度和固定相的性質(zhì)有關(guān)，與色②在多元混分配比k：也稱容量因子。它是指組分在固定相和流動(dòng)相中的分配量之比。分配比k：也稱容量因子。它是指組分在固定相和流動(dòng)相中的分配量區(qū)域?qū)挾龋海▌?dòng)力學(xué)因素）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，用Y1/2表示。色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，用Y表示。

Y＝4σ區(qū)域?qū)挾龋海▌?dòng)力學(xué)因素）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜三、色譜圖的作用：三、色譜圖的作用：§7—3色譜法基本原理一、色譜法中組分分離條件A、B兩組分沿色譜柱移動(dòng)時(shí)，不同位置處的濃度輪廓§7—3色譜法基本原理一、色譜法中組分分離條件A、B兩組第七章色譜法分離原理課件①兩組分的分配系數(shù)必須有差異；②區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)該小于區(qū)域分離的速率；必要條件③在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。①兩組分的分配系數(shù)必須有②區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)該小于必要條件二、色譜法基本理論<一>塔板理論1.理論假設(shè)

將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成，每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。二、色譜法基本理論<一>塔板理論1.理論假設(shè)第七章色譜法分離原理課件②流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積(ΔVm)；③所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略；④分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。塔板理論假設(shè)：①在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H；②流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是③所有組分開始時(shí)存第七章色譜法分離原理課件2.理論塔板數(shù)（溶質(zhì)平衡次數(shù)）根據(jù)塔板理論假設(shè)，在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。對(duì)于一根長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：理論塔板數(shù)色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。色譜柱分離混合組分的能力2.理論塔板數(shù)（溶質(zhì)平衡次數(shù)）根據(jù)塔板理論假設(shè)，在每一塊塔板3．塔板理論對(duì)色譜的解釋：第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n

大于50時(shí)，可得到基本對(duì)稱的峰形曲線；第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離；第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：即在tR一定時(shí)，若色譜峰越窄，則n值越大，H越小，柱效能越高。3．塔板理論對(duì)色譜的解釋：第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理4.有效塔板數(shù)注意：同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不同的。當(dāng)選用這些指標(biāo)表示柱效時(shí)，應(yīng)指明對(duì)何種物質(zhì)而言。4.有效塔板數(shù)注意：同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不5.塔板理論的特點(diǎn)①定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率；●成功點(diǎn)：②解釋了流出曲線的形狀；③提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效能高低的參數(shù)?！癫蛔泓c(diǎn)：①定性地給出板高的概念，卻不能找出影響板高的因素；②不能說明為什么在不同的流速下，可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)。5.塔板理論的特點(diǎn)①定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率；<二>速率理論：速率理論指出：在色譜分離過程中，譜峰的擴(kuò)寬受渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力三個(gè)動(dòng)力學(xué)因素的控制。板高方程為：A、B、C——

常數(shù)。A為渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)

B為分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)

C為傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)——

流動(dòng)相的平均線速度；<二>速率理論：速率理論指出：在色譜分離過程中，譜峰的擴(kuò)

一定時(shí)，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，板高H才能小，柱效才會(huì)高；反之，則柱效低，色譜峰擴(kuò)張。一定時(shí)，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，板高H才能小，柱效才會(huì)高1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）變寬的程度由下式?jīng)Q定：A=2λdp①A與填充物的平均直徑dp和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)；②使用顆粒細(xì)和均勻的填料，采用均勻填充，是減小渦流擴(kuò)散和提高柱效的有效途徑。1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）變寬的程度由下式?jīng)Q定：A=2λdp①第七章色譜法分離原理課件氣體分子的分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B為：B=2γDgγ——

彎曲因子。它表示柱填充物對(duì)分子擴(kuò)散的阻礙程度。Dg——

組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2.s-1）。Dg除與組分性質(zhì)有關(guān)外，還與組分在氣相中的保留時(shí)間、柱溫、柱壓和載氣的性質(zhì)等因素有關(guān)。2.分子擴(kuò)散項(xiàng)（）氣體分子的分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B為：B=2γDgγ——彎曲因子。第七章色譜法分離原理課件為減小分子擴(kuò)散引起的色譜峰變寬，可采用：①用較高的載氣流速；②使用相對(duì)分子量較大的載氣；③控制較低的柱溫。為減小分子擴(kuò)散引起的色譜峰變寬，可采用：①用較高的載氣流速3.傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cǔ）物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質(zhì)遷移（從一相轉(zhuǎn)入另一相）過程。影響傳質(zhì)過程進(jìn)行速度的阻力。傳質(zhì)：傳質(zhì)阻力：①氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg

Cg——描述影響組分從氣相轉(zhuǎn)移到固定相表面這一過程的傳質(zhì)速度的因素。造成譜峰擴(kuò)寬3.傳質(zhì)阻力項(xiàng)（Cǔ）物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質(zhì)遷移第七章色譜法分離原理課件對(duì)于填充柱：采用粒度小的填充物和相對(duì)分子量小的載氣，可減小Cg值，提高柱效。②液相傳質(zhì)阻力系數(shù)ClCl——描述影響組分在液相中傳質(zhì)速度的因素。對(duì)于填充柱：采用粒度小的填充物和相對(duì)分子量小的載氣，可減小a.降低固定液含量，df減小，但容量因子k也隨之變小，對(duì)分離不利；b.固定液含量一定時(shí)，df值隨載體的比表面積增加而降低。因此，一般用比表面積較大的載體來降低df值；c.提高柱溫，Dl增大，但k值減小，故應(yīng)控制適當(dāng)?shù)闹鶞?。減小固定液的液膜厚度df，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)Dl，可以減小Cl值。a.降低固定液含量，df減小，但容量因子k也b.固定液含量一4.范氏方程式（速率理論方程式：）選擇色譜分離條件具有重要的指導(dǎo)意義。它可以說明固定相的填充均勻程度、粒度、液膜厚度、載氣種類和流速等因素的變化對(duì)柱效和色譜峰展寬的影響。4.范氏方程式（速率理論方程式：）選擇色譜分離條件具有重要§7—4分離度一、柱效和選擇性柱效——色譜柱對(duì)相鄰兩峰分離的能力。用理論塔板數(shù)n或有效塔板數(shù)n有效進(jìn)行衡量選擇性——色譜圖上兩峰之間的距離大小。①一般用相對(duì)保留值α表示兩組分在給定色譜柱上的選擇性；②色譜柱的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學(xué)性質(zhì)?！?—4分離度一、柱效和選擇性柱效——色譜柱對(duì)相鄰兩峰分二、總分離效能指標(biāo)——分離度Rs：<一>分離度Rs：定義：相鄰兩組分色譜峰保留值之差與該兩組分色譜峰基線寬度平均值之比。定義式：二、總分離效能指標(biāo)——分離度Rs：<一>分離度Rs：定義：①當(dāng)Rs＜1時(shí)，兩色譜峰總是有部分重疊；②當(dāng)Rs=1.0時(shí)，兩色譜峰的分離程度可達(dá)

98%；③當(dāng)Rs=1.5時(shí)，兩色譜峰的分離程度達(dá)

99.7%。④當(dāng)Rs值更大時(shí)，分離效果更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，使色譜峰變寬，對(duì)分析反而不利。Rs=1.5為相鄰兩色譜峰完全分離的標(biāo)志①當(dāng)Rs＜1時(shí)，兩色譜峰總是有部分重疊；②當(dāng)Rs=1.0<二>影響Rs的因素：

②容量因子k值增大，分離度增大，分析時(shí)間延長(zhǎng)，甚至造成譜帶檢測(cè)困難。通常控制容量因子k=2～7；③相對(duì)保留值α有微小增大，都會(huì)使Rs值有較大增加。當(dāng)α=1時(shí)，Rs=0,不能分離。增加塔板數(shù)，可以增加分離度。①Rs∝（降低板高的方法來增大塔板數(shù)）<二>影響Rs的因素：②容量因