基因克隆技術(shù)課件

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討1基因工程所用到的酶系（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）?；蚬こ趟玫降拿赶担ㄒ唬┫拗菩院怂醿?nèi)切酶（restrict2取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。EcoRI表示大腸桿菌屬名第一個字母E：表示種名頭兩個字母co：表示株名R：表示該菌中第一個被分離出來的酶。I：取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組3HindIII的識別序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶一般不在識別序列的對稱軸上切割，而是交錯切割結(jié)果形成5或3單鏈突出的粘性末端的DNA限制片段。二個具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通過堿基的互補(bǔ)及DNA連接酶的作用而重新連接起來。HindIII的識別序列：5`-AAGCTT-34HpaI的識別序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈。具有平末端的DNA片段也可以在DNA連接酶的作用連接起來HpaI的識別序列：5`-GTTAAC-35（三）DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶可以將兩個DNA片段的3’-OH與5’-P連接起來

（二）DNA聚合酶具有催化DNA鏈從5’→3’方向聚合反應(yīng)的活性，還具有從5’→3’(其小片段)和從3’→5’(大片段)的外切核酸酶活性。

（三）DNA連接酶（DNAligase）（二）DNA聚合酶6基因克隆技術(shù)課件7三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆載體（cloningvector）（1）載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制（3）載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記（2）載體應(yīng)具有酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆8a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)9基因克隆技術(shù)課件10穿梭載體穿梭載體11表達(dá)載體表達(dá)載體12基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4.特定克隆子的篩選基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.13基因克隆技術(shù)課件14構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選能功能互補(bǔ)的克隆獲得目的基因鳥槍法克隆新的目的基因構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選15有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建16TotalDNAextractionSau3AIpartialdigest(gatc)TotalDNAextractionSau3AIpar17Recoveryof2-4kbfragmentsligation載體脫磷puc19載體BamHI酶切puc19載體提取gatcctagSau3AI:ggatcccctaggBamHI:轉(zhuǎn)化,挑選轉(zhuǎn)化子篩選陽性克隆Recoveryof2-4kbfragmentslig18在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計公式計算：N=ln（1-p）/ln（1-x/y）P是從建成的文庫中可能篩選出某個基因的概率，x指該文庫中每個獨(dú)立克隆所含有外源DNA片段的平均長度，y是該生物基因組的大小，N是該文庫應(yīng)含的克隆數(shù)目。在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計公式計算：19Positiveclonesandpuc19陽性克隆在含有相應(yīng)農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈Positiveclonesandpuc19陽性克隆在20基因克隆技術(shù)課件21基因克隆技術(shù)課件22如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因為例設(shè)計一個功能驗證的策略設(shè)計一個片段分解的策略選擇合適的載體選擇內(nèi)切酶種類和設(shè)計引物載體雙酶切片段PCR克隆,雙酶切酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а三親雜交到KT功能驗證如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因為例設(shè)計一個功23雙酶切雙酶切酶連雙酶切雙酶切酶連24內(nèi)切酶的選擇只有ApaI和EcoRI可供選擇內(nèi)切酶的選擇只有ApaI和EcoRI可供選擇255’---CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATATCGCTTAG---3’5’---TATAGGGCCCTTGGCTTGATCGCTAAA---3’正向引物反向引物EcoRIApaI保護(hù)堿基保護(hù)堿基5’---CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATAT262008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討27基因工程所用到的酶系（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）?；蚬こ趟玫降拿赶担ㄒ唬┫拗菩院怂醿?nèi)切酶（restrict28取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。EcoRI表示大腸桿菌屬名第一個字母E：表示種名頭兩個字母co：表示株名R：表示該菌中第一個被分離出來的酶。I：取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組29HindIII的識別序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶一般不在識別序列的對稱軸上切割，而是交錯切割結(jié)果形成5或3單鏈突出的粘性末端的DNA限制片段。二個具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通過堿基的互補(bǔ)及DNA連接酶的作用而重新連接起來。HindIII的識別序列：5`-AAGCTT-330HpaI的識別序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈。具有平末端的DNA片段也可以在DNA連接酶的作用連接起來HpaI的識別序列：5`-GTTAAC-331（三）DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶可以將兩個DNA片段的3’-OH與5’-P連接起來

（二）DNA聚合酶具有催化DNA鏈從5’→3’方向聚合反應(yīng)的活性，還具有從5’→3’(其小片段)和從3’→5’(大片段)的外切核酸酶活性。

（三）DNA連接酶（DNAligase）（二）DNA聚合酶32基因克隆技術(shù)課件33三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆載體（cloningvector）（1）載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制（3）載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記（2）載體應(yīng)具有酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆34a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)35基因克隆技術(shù)課件36穿梭載體穿梭載體37表達(dá)載體表達(dá)載體38基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4.特定克隆子的篩選基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.39基因克隆技術(shù)課件40構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選能功能互補(bǔ)的克隆獲得目的基因鳥槍法克隆新的目的基因構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選41有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建42TotalDNAextractionSau3AIpartialdigest(gatc)TotalDNAextractionSau3AIpar43Recoveryof2-4kbfragmentsligation載體脫磷puc19載體BamHI酶切puc19載體提取gatcctagSau3AI:ggatcccctaggBamHI:轉(zhuǎn)化,挑選轉(zhuǎn)化子篩選陽性克隆Recoveryof2-4kbfragmentslig44在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計公式計算：N=ln（1-p）/ln（1-x/y）P是從建成的文庫中可能篩選出某個基因的概率，x指該文庫中每個獨(dú)立克隆所含有外源DNA片段的平均長度，y是該生物基因組的大小，N是該文庫應(yīng)含的克隆數(shù)目。在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計公式計算：45Positiveclonesandpuc19陽性克隆在含有相應(yīng)農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈Positiveclonesandpuc19陽性克隆在46基因克隆技術(shù)課件47基因克隆技術(shù)課件48如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因為例設(shè)計一個功能驗證的策略設(shè)計一個片段分解的策略選擇合適的載體選擇內(nèi)切酶種類和設(shè)計引物載體雙酶切片段PCR克隆,雙酶切酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а三親雜交到KT功能驗證如何做亞克隆?-----以四氫嘧