損傷修復(fù)與誘變育種

關(guān)于損傷修復(fù)與誘變育種第一頁，共八十頁，2022年，8月28日2直接修復(fù)：光復(fù)活修復(fù)，轉(zhuǎn)甲基酶，插入酶堿基錯配修復(fù)：甲基化引導(dǎo)的錯配修復(fù)系統(tǒng)切除修復(fù)：UvrABC,Ap切除修復(fù)，糖基化酶切除修復(fù)GO系統(tǒng)重組修復(fù):

同源重組SOS修復(fù)鏈交聯(lián)的修復(fù)鏈斷裂的修復(fù)第四節(jié)DNA損傷的修復(fù)機制第二頁，共八十頁，2022年，8月28日3第五節(jié)突變過程與誘變育種技術(shù)回復(fù)突變與抑制突變誘發(fā)突變的過程誘變育種的主要流程誘變育種中需要注意的幾個問題第三頁，共八十頁，2022年，8月28日4一回復(fù)突變與抑制突變表型回復(fù)為野生型，可能是真正的回復(fù)突變（backmutation)

產(chǎn)生的，也可能是發(fā)生了抑制突變造成的。抑制突變（

suppressormutation）抵消或抑制了前一次突變的表型效應(yīng)第四頁，共八十頁，2022年，8月28日5區(qū)分回復(fù)突變與抑制突變的方法第五頁，共八十頁，2022年，8月28日6抑制突變的特點如下：(1)抑制突變是在第一次突變不同位點將它抵消的。因此原來的突變可以通過野生型和回復(fù)突變型之間的雜交又恢復(fù)為突變型；

(2)抑制突變可能發(fā)生相同的基因中，抑制原來的突變，稱基因內(nèi)抑制，或發(fā)生在不同的基因中稱基因間抑制。

(3)不同的抑制突變其作用方式不同。如有的抑制是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，有的可能是通過細(xì)胞生理功能來實現(xiàn)。第六頁，共八十頁，2022年，8月28日71基因內(nèi)抑制第七頁，共八十頁，2022年，8月28日8LeuBS286MLeuB3(β)-異丙基蘋果酸脫氫酶,作用于亮氨酸生物合成的第二步LeuBS286L第八頁，共八十頁，2022年，8月28日9LeuBS286VLeuBS286LL308P第九頁，共八十頁，2022年，8月28日10第十頁，共八十頁，2022年，8月28日11野生型蛋白X軸切面電勢分布S286V沿X軸切面電勢分布S286L沿X軸切面電勢分布S286LL308PS286LS286S第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日12假定某一基因突變使一種蛋白質(zhì)變?yōu)槿菀诪榱硪晃镔|(zhì)所抑制，因而使野生型表型不能出現(xiàn)，再假定另一基因發(fā)生突變后這抑制物不再產(chǎn)生，那么后一突變基因便是前一突變基因的抑制基因。假定某一突變基因使某一代謝產(chǎn)物不能形成，再假定另一突變基因使同一代謝產(chǎn)物由另一途徑合成，那么它也是前一突變基因的抑制基因。如果某一代謝中間產(chǎn)物具有某種表型效應(yīng)，假定第一個突變基因中斷了這一中間產(chǎn)物以后的代謝途徑而使中間產(chǎn)物積累，再假定另一突變基因使中間產(chǎn)物出現(xiàn)以前的代謝途徑中斷，那么它也成為前一突變基因的抑制基因。2基因間抑制——代謝補償?shù)谑?，共八十頁?022年，8月28日13例1粗糙脈孢菌的腺嘌呤缺陷型(ade)突變35203產(chǎn)生一種由腺核苷酸合成的代謝中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變來的紫色色素。在這一基因不發(fā)生回復(fù)突變的情況下，另外三個腺嘌呤缺陷型27663、28610、44411中的任何一個都抑制紫色色素的產(chǎn)生而恢復(fù)了野生型的不產(chǎn)色素這一性狀。對于突變型35203的產(chǎn)生紫色色素這一性狀來講,突變基因27663、28610、44411都是它的抑制基因。第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日14例2精氨酸的滲漏突變是嘧啶缺陷的抑制突變第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日152基因間抑制——校正tRNA突變抑制基因（suppressor）或稱校正基因

無義抑制（nonsensesuppressor）

錯義抑制

(missensesuppressor)tRNA反密碼子的突變tRNA其它結(jié)構(gòu)的改變第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日16第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日17第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日18氨基酰tRNA合成酶對tRNA和氨基酸兩者具有專一性，它對氨基酸的識別特異性很高，而對tRNA識別的特異性較低。按照一般原理，酶和底物的正確結(jié)合是由二者相嵌的幾何形狀所決定的，只有適合的氨基酸和適合的tRNA進入合成酶的相應(yīng)位點，才能合成正確的氨酰基tRNA?，F(xiàn)已經(jīng)知道合成酶與L形tRNA的內(nèi)側(cè)面結(jié)合，結(jié)合點包括接近臂，DHU臂和反密碼子臂。第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日19無義抑制第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日20第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日21錯義抑制第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日22tRNA基因造成的抑制突變的特點:1.不是所有抑制基因都能產(chǎn)生有功能的蛋白質(zhì)，關(guān)鍵是要看氨基酸取代的情況。

2.校正的作用不可能是完全的。①校正的tRNA分子是有限的而且還要和釋放因子競爭；②若是錯義抑制的話，由于氨基酸發(fā)生取代,使得蛋白質(zhì)的活性有所降低。

3.每種抑制tRNA一般都只識別UAG終止密碼子，而不再識別原來相應(yīng)的密碼子。第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日234.赭石突變抑制基因不僅可以識別赭石密碼子（UUA），也可以抑制琥珀（Am）密碼子UAG。但反過來Am抑制基因（CUA）就不能抑制赭石突變（UAA），這是由于擺動緣故所造成。5.當(dāng)細(xì)胞中含有多個tRNA拷貝時，抑制才能發(fā)揮作用。6.有的抑制基因，不僅可以識別終止密碼子，而且還可以識別原來的密碼子。如野生型tRNATrp的反密碼子是CCA，它可以識別原來的密碼子UGG，而且還可以識別終止密碼子UGA。第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日247.校正基因一般不會影響正常的終止(1)校正基因識別的終止密碼子不一定和正常終止的密碼子相同。有時正常終止位點有兩個連續(xù)的終止密碼子，而且結(jié)構(gòu)不同，如UAG-UAA；(2)釋放因子將和抑制基因競爭和終止密碼子的結(jié)合；(3)抑制基因的效率很低，通常為1~5%，所以常不會抑制正常終止。第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日25二誘發(fā)突變的生物學(xué)過程第一階段誘變劑接觸DNA分子之前

進入細(xì)胞－－細(xì)胞表面屏障作用穿過細(xì)胞質(zhì)，失活或增加活性細(xì)胞的生理狀態(tài)（復(fù)制轉(zhuǎn)錄態(tài)）第二階段從前突變到突變

DNA分子上的損傷，突變產(chǎn)生（經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)對損傷DNA的修復(fù)，抑制基因作用）第三階段基因突變到突變表型

表型遲延（phenotypiclag)生理性遲延和遺傳性遲延第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日26Phenotypiclag表型遲延分離性遲延（Segregationallag）

對數(shù)生長期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，而突變通常發(fā)生在一個核上，包含突變的變異細(xì)胞必須經(jīng)過多代細(xì)胞分離后，由雜和狀態(tài)變?yōu)榧兒蜖顟B(tài)，才有可能表現(xiàn)突變表型。生理性遲延Physiologicallag

變異細(xì)胞變?yōu)榧兒蜖顟B(tài)后，在雜和期由正常基因所形成的蛋白（酶）仍然發(fā)揮作用，必須經(jīng)過多代細(xì)胞分離后，才能將這些非變異的蛋白（酶）稀釋掉，最終表現(xiàn)出突變的表型。第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日27誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。誘變育種具有極其重要的實踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。三誘變育種第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日28誘變育種

誘變

+篩選

誘變是隨機的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株都是經(jīng)過突變改造過的。第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日29誘變育種的基本過程—小概率事件第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日30誘變育種的基本過程選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日31誘變劑選擇誘變劑量選擇平板篩選技術(shù)第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日321出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株：用來進行育種處理的起始菌株◆出發(fā)菌株應(yīng)具備

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株：

③已歷經(jīng)多次育種處理的菌株：第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日33制備單細(xì)胞或單孢子懸液

要求①菌體處于對數(shù)生長期，孢子初萌發(fā)

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，

方法①玻璃珠打散10-15min;

②加吐溫80或Tritonx-100

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：物理誘變劑——生理鹽水，磷酸緩沖液

化學(xué)誘變劑——特定的緩沖液

濃度：細(xì)菌、放線菌＞108個/ml

霉菌、酵母菌＞106個/ml第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日342誘變劑

誘變劑的選擇誘變劑作用的普遍性：

選擇那些在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV，亞硝基胍（NTG），快中子等。

誘變劑的特異性：

經(jīng)驗性：

如，四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，

青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日35菌株的差異：（即使是同一菌）

A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株---用緩和誘變劑

B：遺傳性穩(wěn)定的菌株---首用強，后用緩。

考慮誘變機制：

UV嘧啶，

亞硝酸

嘌呤，因此復(fù)合作用為好

第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日36誘變劑劑量的選擇用90-99%殺菌劑量用50—85%的殺菌劑量，此時正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產(chǎn)菌株。

第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日37第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日38誘變劑的處理方法

誘變劑使用方式：

單一處理，

復(fù)合處理：

誘變處理條件：溫度（生長溫度）

PH（緩沖劑），處理時間

誘變作用的終止：用解毒劑（終止緩沖液）、用水稀釋

第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日39第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日40誘變劑使用方法舉例------紫外線第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日41亞硝酸---緩沖液

終止液第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日42甲基磺酸乙酯（EMS）------母液，工作液，終止液（解毒液）第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日43復(fù)合誘變處理（示例）-------固體誘變第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日443突變株的篩選

中間培養(yǎng)基因型+

環(huán)境

表型

目的：克服表型遲延，使突變充分表達(dá)分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象

第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日45合適的篩選方法：

平皿快速檢測法（初篩）變色圈法

透明圈法

生長圈法抑菌圈法

梯度平板法

搖瓶培養(yǎng)法（復(fù)篩）第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日46第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日47顯色圈第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日48透明圈第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日49抑菌圈第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日50抑菌圈第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日51生長圈第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日52第一輪：

一個出發(fā)菌株→→→

選出200個菌株→→→

選出50株→→→選出5株誘變處理初篩

（每株1瓶）復(fù)篩（每株3-5瓶）

第二輪：

5個出發(fā)菌株→→→

→→

→

選出50株

→→

→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每株1瓶）（每株3-5瓶）復(fù)篩第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日53三類常見突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選

第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日54

產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）孢子懸液------誘變----適當(dāng)培養(yǎng)（表型遲延）-----

涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)----4-5天—

測定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----效價高菌

第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日55第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日56

高產(chǎn)菌株的初篩（抑菌圈法）。指示菌：黑曲霉As3.324；培養(yǎng)時間72小時。A為出發(fā)菌株。第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日57

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日58ATCC25922在0.03125ug/ml的恩諾沙星制備的坡面平板上的菌苔、菌落第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日59第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日60營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選MM基本培養(yǎng)基SM補充培養(yǎng)基CM完全培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷型－＋＋野生型＋＋＋原養(yǎng)型＋＋＋第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日61基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）－

MinimumEssentialMediumMM

：—凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）＋—滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。

補充培養(yǎng)基（supplemental

medium,SM）X

—在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。

第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日62篩選步驟

野生型菌株

C-1：誘變處理

C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

C-3：檢出缺陷型

C-4：鑒定缺陷型第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日63C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

誘變后，仍存在大量的野生型，不利于分離（1）抗生素法野生型菌株在MM上生長+青霉素—殺死Ｇ＋

缺陷型菌株在MM上不生長＋青霉素—-不殺死注意：使環(huán)境的滲透壓提高，避免細(xì)胞破裂?？股靥幚硗旰螅x心收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入低滲溶液制霉菌素法則適合于真菌（例如：酵母、霉菌），可與真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇作用，從而引起溶菌第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日64第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日65（2）菌絲過濾法

適于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：野生型基本培養(yǎng)基上發(fā)育成菌絲；缺陷型孢子不萌發(fā)可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。

第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日66第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日67檢出缺陷型逐個檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補給法第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日68逐個檢出法

（牙簽）第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日69影印檢出法

第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日70夾層培養(yǎng)法

第七十頁，共八十頁，2022年，8月28日71限量補給法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),篩選氨基酸缺陷型

大菌落為野生型，小菌落的為缺陷型。第七十一頁，共八十頁，2022年，8月28日72鑒定缺陷型生長譜法組合營養(yǎng)物法組合補充培養(yǎng)基法第七十二頁，共八十頁，2022年，8月28日73生長譜法

斜面菌種-----生理鹽水洗下細(xì)胞------洗滌-----涂布（105個/皿）方法簡便；回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片第七十三頁，共八十頁，2022年，8月28日74紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液

測定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進一步確定是哪種具體化合物的