腫瘤基因組學課件

第八章腫瘤基因組學河北省實驗動物重點實驗室第一節(jié)腫瘤基因組計劃

一、什么是“腫瘤基因組計劃”？

預計在未來13年里找出肺癌、腦癌、卵巢癌等所有困擾人類癌癥的致癌基因元兇，從而診斷、治療這一“絕癥”。

2005年12月13日，美國宣布啟動“腫瘤基因組計劃”。

美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯·柯林斯(FrancisCollins)樂觀地預計，2020年用基因給大眾治療疾病將成為可能。弗朗西斯·柯林斯

柯林斯參加杭州基因組學大會腫瘤基因組學議題的討論。在發(fā)言中，他為大家講了一個故事。故事的主人公名叫“Hua”。未來若干年基因技術應用的水平將直接影響到Hua的生活。一種可能是，Hua花1000美元進行了全面的基因測試，建立了自己的基因組圖。通過這一渠道，Hua知道了自己的健康狀況與家族遺傳缺陷，并可以據此對自己的個人生活進行健康規(guī)劃。故事的另一版是，Hua對自己的家族病史一無所知，也不知道自己是否比其他人更容易患上癌癥等疾病，對潛藏著的健康隱患一無所知。故事講到最后，柯林斯在屏幕上打出了“救救Hua”的字樣。

“Hua的故事”清晰地說明了包括“腫瘤基因組計劃”在內基因測序工程對人類生活的巨大作用。這些工程與“人類基因組計劃”一脈相承。測出人類基因組序列，讀出生命天書，只是我們認識自己的第一步，更要緊的是讀懂“天書”，從而開展基因組功能研究。DNA的語言即使再枯燥，可一旦與基因治療結合在一起，就格外親切了。隨后，柯林斯亮出了“腫瘤基因組計劃”。美國在2005年12月宣布啟動癌癥基因組計劃的“先遣計劃”，兩個多月前開始正式運作。美國準備投入1億美元，用3年時間在DNA序列上找出與某些癌癥相關的基因變異?？紤]到腦癌、肺癌和卵巢癌，是美國人健康的主要隱患。該計劃決定先完成這3種癌癥的基因圖譜?？铝炙箞孕?，這一計劃對提高人類健康水平發(fā)揮巨大作用。

三、人類“腫瘤基因組”的應用：

（1）找到引發(fā)腫瘤的基因，對癥下藥。

上個世紀末，科學家發(fā)現了一組基因。這組基因編碼的多種蛋白質能阻止細胞分裂，因此被稱作“腫瘤抑制基因”。

（2）用基因治療癌癥需要與其他醫(yī)療方法相互配合。

個體的特異性也是腫瘤基因組計劃考慮的重點。為每一個病人找到最合適的藥，是人類基因組對未來的藍圖規(guī)劃。這也就是柯林斯在杭州基因組學大會上展示給我們的前景。第二節(jié)腫瘤發(fā)生的影響因素一、環(huán)境因素—外源性因素

1、化學致癌直接致癌物:黃曲霉素，苯丙(A)芘

烷化劑、亞硝酰胺類間接致癌物促癌物糖精亞硝胺類油煎食品，酸菜

2、物理致癌如電磁波、放射性同位素、紫外線等電離輻射產生電離自由基破壞DNA分子結構染色體斷裂非原位重接3、病毒致癌DNA病毒RNA病毒—逆轉錄病毒慢性RNA致癌病毒急性RNA致癌病毒二、遺傳因素—內在因素（一）單基因傳遞方式的遺傳性腫瘤

1.癌家族(cancerfamily)2.遺傳性腫瘤

3.遺傳性癌前病變（AD）(二)惡性腫瘤的遺傳易感性1.染色體脆性部位與腫瘤2.染色體不穩(wěn)定綜合征與腫瘤3.免疫缺陷與腫瘤(三）染色體異常與腫瘤1.腫瘤染色體數目異常2.腫瘤染色體結構異常二、遺傳因素—內在因素（一）單基因傳遞方式的遺傳性腫瘤概念：是指一個家族有較多成員患一種或幾種解剖部位類似的癌。在這樣的家族中表現出惡性腫瘤的發(fā)病率高，患者的發(fā)病年齡較早，腫瘤的發(fā)生部位不局限于同一組織或器官，腫瘤在家族中呈常染色體顯性遺傳。

1、癌家族(cancerfamily)

曾有人報道過一個G家族，這是癌家族的一個最典型的例子。有人追蹤了該家族70多年，經過五次調查發(fā)現，G家族的10個支系中有842名后代，共有95名癌癥患者，其中結腸癌有48人，子宮內膜癌有18人，這兩種癌癥占多數。在95名患者中，有72人為雙親之一患癌，男患者為47人，女患者為48人，接近1︰1，符合常染色體顯性遺傳。2、遺傳性腫瘤1)視網膜母細胞瘤（retinoblstomaRB)是兒童中一種眼內的惡性腫瘤，1/21000-1/10000，4歲前發(fā)病

定位在：13q14.3

臨床癥狀：早期為眼底灰白色腫塊，多無自覺癥狀；以后腫瘤長入玻璃體，使瞳孔呈黃色光反射而被稱為“貓眼”。

遺傳性非遺傳性（散發(fā)型）

AD遺傳散發(fā)家族史無雙側單側(約90%）早發(fā)晚發(fā)

20～25%75～80%視網膜母細胞瘤（RB）2次打擊學說的證據：

1978年，Francke系統(tǒng)檢查一個視網膜母細胞瘤家族，發(fā)現全身細胞均有13q14缺失，證實存在“第一次打擊”患者腫瘤細胞也有此缺失，而且脂酶活性消失。說明一對等位基因已經全部失活。證實腫瘤細胞存在“第二次打擊”。

1981年應用定位克隆的方法，克隆了RB基因，這是首次成功應用定位克隆方法的實例之一。

Wilms瘤基因是一種抑癌基因，定位于11p13，全長345kb，含10個外顯子，其mRNA長3kb，產物可與早期生長反應基因EGR1的DNA結合區(qū)相結合而抑制其轉錄活性，從而抑制細胞的增殖。遺傳型者多為雙側發(fā)病且發(fā)病早，符合常染色體顯性遺傳，約占38%。患者腹部有無癥狀的腫塊，腫塊光滑、質堅硬。Wilms瘤常伴發(fā)一些先天畸形，如無虹膜、單側肥大等。（二）染色體的異常與腫瘤

大多數惡性腫瘤都可以觀察到染色體異常。不少腫瘤有非隨機性，甚至是特異性的染色體異常，增加了腫瘤染色體研究在臨床應用上的意義。一個腫瘤的細胞群體可以是由單克隆構成，也可能腫瘤在生長演進過程中出現異質性，演變成多克隆性。干系：占主導數目的克隆眾數：干系腫瘤細胞的染色體數目旁系：多克隆細胞的腫瘤中占非主導數目的克隆。干系和旁系的地位可以相互轉化。同一腫瘤的每個細胞具有共同的染色體特點（單克?。?/p>

經分裂、增殖而成的克隆同一突變細胞但由于各種因素影響，克隆癌細胞核型有不同變化。（出現異質性）

克隆演化（cloneevolution)

主導克隆---干系(stemline)--眾數(modalnumber)

非主導克隆---旁系(sideline)腫瘤染色體數目的異常：

腫瘤細胞則多為非整倍體或異倍體。一般惡性腫瘤的染色體數目多在二倍體到四倍體之間，并有集中在二倍體附近或在三倍體與四倍體之間的兩種傾向。個別細胞染色體數可高達100以上。

超二倍體（染色體>46條）非整倍體亞二倍體（染色體<46條）三倍體（3×23)

多倍體四倍體(4×23)

腫瘤染色體理論的提出

數目異常結構異常

染色體異常是癌細胞遺傳學的基本特征

細胞內染色體質量的不平衡是產生腫瘤的根本原因

——Boveri1941Boveri染色體的結構異常：在56種人類腫瘤中已發(fā)現3152種染色體的結構異常，包括易位、缺失、重復、環(huán)狀染色體和雙著絲粒染色體等。染色體結構異常——易位、缺失引起癌基因的激活和抑癌基因的失活，這是癌癥發(fā)生的重要分子基礎1、ph染色體的發(fā)現及其意義

1960年，Nowell在慢性粒細胞性白血?。–ML）中發(fā)現了一條比G組染色體還小的異常染色體，用顯帶技術證明該染色體是由t（9；22）（22pter-22q11::9q34-9qter）易位所形成，被稱為ph染色體。約95%的慢性粒細胞性白血病攜帶有ph染色體，可作為CML的診斷依據。

ph染色體發(fā)現的意義：

ph染色體的發(fā)現不僅為Boveri的假說提供了主要的實驗依據，而且首次證明了一種染色體畸變與一種特異性腫瘤之間的恒定關系，故被認為是腫瘤細胞遺傳學研究的里程碑。慢性粒細胞性白血病患者的核型t(9;22)(q34;q11)易位的結果而導致9q+和22q-95%慢性粒細胞白血?。╟hronicmyelocyticleukemia,CML）出現并可先于臨床癥狀而出現，所以在早期診斷上有特殊的意義，其他血液疾病也可出現但頻率很低慢性粒細胞白血病帶有t(9;22)(q34;q11)的易位。c-abl基因位于9q34；bcr基因位于22q11。易位后c-abl基因與bcr基因融合形成一個大約8kb的嵌合基因，其編碼產生的蛋白質為p210。由于p210具有酪氨酸激酶的活性，從而啟動了細胞的惡變。t（9；22）（q34；q11）9q+和22q-（Ph1）（95%）

Ph染色體有重要的臨床意義：

①Ph染色體對慢性粒細胞白血病有較強的特異性，大約95％的慢性粒細胞白血病患者Ph染色體為陽性。

②Ph染色體有早期診斷價值，它可見于慢性粒細胞白血病早期患者的骨髓細胞中，且可以先于臨床癥狀出現。

③可作為判定治療效果的一種指標?；瘜W治療后Ph染色體可減少、消失，因此可用于判斷療效。

腫瘤中其他特異性標記染色體的改變

除Ph染色體外，又發(fā)現了一些非隨機存在的特異性標記染色體。它們的特點是與特定的腫瘤相關，但檢出的頻率并不如Ph染色體高，其中包括Burkitt淋巴瘤中的t（8；14）（q24，q32）。14q+:Burkitt淋巴瘤（BL）患者的特異性標記

14q+染色體，在75%的BL患者中存在。

t（8；14）（q24；q32）8q-和14q+

8q24轉移至14q32myc與IgH結合

易位癌基因激活融合基因

染色體數目和結構的改變導致不同的分子事件發(fā)生，包括基因的激活、失活、轉錄調節(jié)異常、擴增、缺失，并導致基因及相關區(qū)域的結構改變。這些變化可能涉及癌基因或腫瘤抑制基因序列

從血液系統(tǒng)惡性腫瘤所獲研究結果來看，可以假定，在不同腫瘤中所見的潛在轉化序列（細胞的原癌基因）的結構和功能的改變可能是受染色體變化的影響。

c-myc基因是人類與腫瘤有密切關系的癌基因,在胃癌,肺癌,乳腺癌及白血病等腫瘤中均有顯著表達,該基因可能在很多癌腫的發(fā)生,發(fā)展及轉移過程中起重要作用;三、染色體不穩(wěn)定綜合癥與腫瘤（一）、染色體不穩(wěn)定綜合癥

概念：由于DNA修復缺陷而導致染色體不穩(wěn)定，常以體細胞染色體斷裂或重排為主要表現，并具有常染色體隱性、常染色體顯性和X連鎖隱性遺傳特性。

例如：Bloom’s綜合征，Fanconi貧血，毛細血管擴張性共濟失調。

共同特征：AR，DNA修復系統(tǒng)異常，所以染色體DNA不穩(wěn)定，易于發(fā)生斷裂或重排，易患白血病或其他惡性腫瘤。

Bloom綜合癥

1、Bloom綜合癥的臨床特征

遺傳方式：常染色體隱性遺傳有明顯的種族差異性，多見于東歐猶太人后裔。

臨床表現：身材矮小，慢性感染，免疫功能缺陷，日光敏感性面部紅斑和輕度顏面部畸形，患者有免疫功能缺陷，常伴發(fā)白血病和其他惡性腫瘤。BS，MIM210900臨床特征身材矮小慢性感染免疫功能缺陷日光敏感性面部紅斑輕度顏面畸形Bloom綜合征Bloom綜合征臨床特征

2、Bloom綜合癥患者的細胞遺傳學改變

主要表現：

(1)體外培養(yǎng)的細胞株的染色體易發(fā)生斷裂并易形成結構畸變。

(2)染色體易于斷裂，且姐妹染色單體交換（SCE）率高于正常人者10倍。主要是由于DNA修復酶系統(tǒng)有缺陷：DNA復制過程中出現異常結構，導致染色體斷裂和SCE。

(3)細胞中常見的四射體結構，尤其常見于短期培養(yǎng)的淋巴細胞中。

Bloom綜合征細胞遺傳學改變Bloom綜合征細胞遺傳學改變姊妹染色單體：

一條染色體(或DNA)經復制形成的兩個分子，仍由一個著絲粒相連的兩條染色單體。同源染色體（Homologouschromosome）：

指形態(tài)、結構和功能相似的一對染色體，它們一條來自父本，一條來自母本。姊妹染色單體互換：

一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換,稱為姊妹染色單體互換。

3、Bloom綜合癥基因的定位和表達

1992年McDanel等利用微細胞介導的染色體轉移技術將Bloom綜合癥的編碼基因（BLM）定位在15號染色體長臂。

German等利用純合性定位技術進一步將BLM基因定位于15q26.1。

Ellis等克隆了BLM基因的全長cDNA，并發(fā)現該基因的突變是Bloom綜合癥患者發(fā)病的分子遺傳學基礎。

4、BLM基因及其蛋白質的生物學功能

Ellis等指出，Bloom綜合癥細胞中，由于BLM基因的突變導致BLM蛋白缺乏RecQ解鏈酶活性，從而不能修復在DNA復制過程中出現的各種異常的DNA結構，導致染色體斷裂，易位和姐妹染色單體交換等染色體不穩(wěn)定綜合癥的細胞遺傳學特征。5、Bloom綜合癥患者BLM基因的突變

目前已發(fā)現了7種不同的BLM基因突變，其中：

4個為單個堿基代替型突變，

1種為缺失型突變，

1種為插入型突變，

1種則為缺失插入型突變，結果導致BLM基因的：

2種無義突變，

3種錯義突變和

2種移碼突變。

6、Bloom綜合癥的遺傳學診斷

在分子遺傳學診斷方面，目前通過的分析技術是利用Bloom綜合癥患者的體外培養(yǎng)細胞獲得BLM基因的cDNA片段，再用相關引物擴增BLM基因的全長cDNA,SSCP(單鏈構象多態(tài)性）技術篩選所獲得的PCR擴增片段，對出現SSCP改變的PCR片段加以序列分析，從而鑒定BLM基因編碼序列上存在的各種突變。(二）Fanconi貧血（Fanconianemia,FA）

罕見的兒童骨髓疾病，又稱為先天性全血細胞減少癥（congenitalpancytopenia），AR。

特征：患者全血細胞減少，白血病的發(fā)病率比一般人高20倍。

病因：FA細胞中普遍存在染色體斷裂等染色體不穩(wěn)定現象。缺少核酸外切酶，非同源染色體之間常交聯、易位。非同源染色體之間的交聯Fanconi貧血的臨床癥狀:

表現為全血細胞減少，又稱先天性全血細胞減少癥?；颊弑憩F貧血、易疲乏、易出血和感染等癥狀，還伴發(fā)侏儒、小眼球、心腎畸形、拇指骨和橈骨發(fā)育不良，皮膚有色素沉著等。患者白血病的發(fā)病率比一般人群高20倍，染色體自發(fā)斷裂率明顯增高，單體斷裂和裂隙、雙著絲粒染色體等也很常見。（三）共濟失調毛細血管擴張癥（AT）

多見于兒童期的染色體隱性遺傳病。1歲起進行性小腦共濟失調。眼球不能隨意運動。6歲后眼和面、頸部出現瘤樣小血管擴張。多發(fā)淋巴瘤、白血病等，尤其對X線敏感。

AT基因的產物參與DNA修復、P53誘導和細胞周期調控。AT病的主要臨床癥狀：進行性小腦共濟失調，肺部反復感染，以及眼和面部皮膚的毛細血管擴張。對射線的殺傷異常敏感；染色體不穩(wěn)定性增加以及免疫缺陷等；AT病人容易患有各種腫瘤。基因定位：

（1）在AT病人中，都有一個相同的基因發(fā)生突變，該基因被命名為ATM。（2）此基因定位于11q22.3，全長約150kb，編碼序列約為12kb，共有66個外顯子。該基因的可讀框有9168個核苷酸組成，編碼一個由3056個氨基酸殘基構成、分子量為350kD的蛋白質。（3）迄今為止，在AT病人中已發(fā)現了ATM基因的100多種突變，這些突變分布于整個編碼序列，其中絕大多數突變造成AT肽鏈的截短或大片段缺失，從而導致AT蛋白失活。三、癌細胞的生物學特性：

1、生長的自主性：癌細胞可以逃避控制正常細胞增殖因素的調控作用，無限制的增長。

2、侵襲性和轉移性：癌細胞可以侵襲臨近組織或向宿主遠處器官或全身擴散。

3、去分化特性：癌細胞往往喪失對正常細胞分化調節(jié)機制的反應，且缺乏成熟的形態(tài)與功能，處于去分化狀態(tài)。

4、可移植性：

將腫瘤細胞移植于同種動物或免疫缺陷動物體內，它能夠再次生長、發(fā)展為和原發(fā)瘤完全相同的腫瘤組織。

5、細胞接觸抑制特性的喪失：

正常細胞在培養(yǎng)基中生長時，彼此接觸后即停止生長，只能形成單層細胞，而腫瘤細胞則不受此限制，相互接觸時生長也不被抑制，可以在培養(yǎng)基內繼續(xù)生長而形成多層細胞。

6、貼壁依賴性生長特性喪失第三節(jié)癌基因Oncogenes

一、

癌基因：

1、概念：細胞內控制細胞生長和分化的基因，它的結構異?；虮磉_異常，可以引起細胞癌變。2、癌基因的命名：癌基因的名稱一般用三個斜體小寫字母表示:myc、ras、src等。

癌基因所編碼的產物與細胞的腫瘤性轉化相關。它以顯性的方式對細胞生長起陽性作用，并促進細胞增殖、轉化。癌基因、抑癌基因與生長因子的關系癌基因抑癌基因細胞生長因子正調控負調控產物

3、癌基因的分類：癌基因可以分成兩大類

（1）一類是病毒癌基因（viraloncogene,v-onc）；（2）另一類是細胞癌基因（protooncogene，pro-onc）

4、病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)（1）概念：存在于病毒基因組中的癌基因，它不編碼病毒的結構成分，對病毒復制也沒有作用，但可以使細胞持續(xù)增殖。

調節(jié)和啟動轉錄

LTR

gag

pol

env

src

LTR

長末端重復序列癌基因正常的病毒基因產生病毒核心蛋白產生逆轉錄酶和整合酶

產生病毒外膜蛋白產生酪氨酸激酶（2）病毒基因組結構（3）病毒癌基因的發(fā)現：

1910年，D.Rous用雞肉瘤的無細胞提取液接種到健康雞身上，結果誘發(fā)了新的肉瘤，他證明轉移因子是一種逆轉錄病毒，命名為RousSarcomavirus(RSV)。

實驗證實病毒可以致癌。病毒癌基因致癌的機制（二）細胞癌基因（cellularoncogene,c-onc)1、概念：存在于動物細胞中的癌基因稱為細胞癌基因。它們在正常情況下，主要在胚胎期表達，而在出生后的個體內不表達或限量表達，主要功能是促進細胞的正常增殖和分化，此時又被稱為原癌基因（proto-oncogene,pro-onc)。當pro-onc被致癌因素激活時，可誘導細胞癌變。

2、細胞癌基因的發(fā)現和命名

1976年Bishop證明正常細胞中存在與v-oncogene同源序列——細胞癌基因(cellularoncogene,c-onc)。與v-src對應者名為c-src。

80年代初Weinberg等幾個實驗室通過轉染實驗證明人體細胞中的癌基因H-ras?，F已發(fā)現100多種的oncs。

另外也有實驗證實了人體細胞中存在的癌基因

人體細胞中的癌基因是通過轉染實驗發(fā)現的。例如，由人膀胱癌細胞系EJ分離出DNA，轉染處于癌前狀態(tài)的小鼠NIH3T3細胞系。轉染后，NIH3T3細胞系即發(fā)生惡性轉化灶。將轉化的細胞移植到有免疫缺陷的裸鼠體內，就會誘發(fā)出惡性腫瘤，

3、病毒癌基因與細胞癌基因的關系：（1）序列上高度同源；（2）c-onc有內含子，v-onc無內含子；（3）v-onc有致癌能力，而c-onc無，但突變后可能致癌；（4）v-onc來源于c-onc。4、細胞癌基因的特點（1）廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細胞普遍存在；（2）基因序列高度保守；（3）作用通過其產物蛋白質來體現；（4）某些物理、化學及感染性因素等能使原癌基因激活。5、細胞原癌基因的分類及其產物①生長因子，如sis，②生長因子受體，如fms、erbB，③蛋白激酶及其它信號轉導組分，如src、ras、raf，④與細胞周期調控相關的蛋白，如RB、P53、bcl-1⑤轉錄因子，如myc、fos、jun等。癌基因表達產物在細胞內的分布6、堿基缺失或單堿基突變基因擴增染色體重排蛋白質活性大大提高蛋白質未變化，但總量大大提高增強子功能使癌基因高效表達與強啟動子基因相融合，提高癌基因表達效率

原癌基因（細胞癌基因）7、細胞原癌基因的激活機制(1)原癌基因點突變原癌基因的表達產物多具有促進細胞增殖的功能，當點突變發(fā)生后，（1）該蛋白質的活性可能大大增強，對細胞增殖的刺激作用也增強；（2）可能使該蛋白質的穩(wěn)定性增加，導致其在胞內的濃度增加，對增殖刺激的時間和強度也隨之增加；（3）可能會引起RNA的錯誤剪接（splicingsite）而改變蛋白質的結構和功能。正常細胞H-ras基因堿基序列ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGGTGTG腫瘤H-ras堿基序列ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTG正常細胞p21蛋白的氨基酸序列MetThrGluTyrLysLeuValValValGlyAlaGlyAlaVal腫瘤H-ras編碼p21MetThrGluTyrLysLeuValValValGlyAlaValAlaVal蛋白氨基酸序列

圖16-1.H-ras基因的點突變原癌基因點突變：如正常細胞H-ras與腫瘤細胞的H-ras基因僅有一個堿基不同（GGC→GTC，甘→纈），導致功能改變（2）LTR（longterminalrepeat)插入強啟動子當一個很強的啟動子插入到一個沒有轉化活性的原癌基因附近時，可使原癌基因表達增強，出現強烈的致癌活性，

如：將鳥類白細胞增生病毒接種到雞體內，雖然這種病毒本身不含癌基因，但具有一個長末端重復序列，是一個很強的啟動子，可激活體內的原癌基因，導致B細胞淋巴瘤。（3）基因重排（rearrange)

例如：

Burkitt淋巴瘤中

75%有染色體易位t（8；14)16%有t（8；22）（q24；11）

9%有t（2；8）（p12，q24）。

這三種易位均涉及8q24.1，此處有細胞癌基因C-MYC。易位后，C-MYC受IGL或IGK增強子的影響而過表達，從而被激活而導致Burkitt淋巴瘤。Ph1染色體（費城染色體）t(9;22)(q34;q11)易位的結果而導致9q+和22q-95%慢性粒細胞白血?。╟hronicmyelocyticleukemia,CML）慢性粒細胞白血病帶有t(9;22)(q34;q11)的易位。c-abl基因位于9q34；bcr基因位于22q11。易位后c-abl基因與bcr基因融合形成一個大約8kb的嵌合基因，其編碼產生的蛋白質為p210。由于p210具有酪氨酸激酶的活性，從而啟動了細胞的惡變。

由于染色體斷裂與重排導致細胞癌基因在染色體上的位置發(fā)生改變，使原來無活性或低表達的癌基因易位至一個強大的啟動子、增強子或轉錄調節(jié)元件附近。

（4）缺失（Deletion）oncogene(-)cancer一些原癌基因5’上游存在負調控序列，該序列的缺失或突變，則喪失抑制癌基因表達的能力。

原癌基因可因某種原因自身擴增而過度表達。在正?；蚪M中原癌基因只有單個拷貝，轉錄的產物有限，所以不會使細胞癌變。在受某種因素影響后，原癌基因增加了在基因組的拷貝數，由原來的一份增加到幾十份甚至幾百份，這被稱為癌基因的擴增。當癌基因數量增多后就會導致基因產物的數量也隨之增加，從而導致細胞癌變。

（5）基因擴增

蛋白質結構未變化，但總量大大提高基因擴增

原癌基因

正常細胞中，細胞癌基因只有一對，其DNA不斷復制可使其拷貝數大量增加，稱為基因擴增?？梢詫е掳┗虻鞍椎倪^表達并引起細胞的惡性轉化?；驍U增的細胞學特征：

均質染色區(qū)（HSR）—染色體某個節(jié)段、相對解旋、淺染區(qū),染色體增長。雙微體（DM）—擴增的DNA脫離染色體、分散、成雙的染色質小體

分子水平：基因拷貝倍增。雙微體（DM）均質染色區(qū)（HSR）

癌基因擴增的拷貝數往往與預后密切相關，擴增越多預后越差。例如，小細胞肺癌中，細胞癌基因C-MYC基因的擴增可高達正常的細胞的20-76倍。神經母細胞瘤中，細胞癌基因N-MYC的擴增可高達正常細胞的140-250倍。(三）細胞癌基因與癌基因關系

第三節(jié)

抑癌基因

Anti-oncogenes一、抑癌基因的概念

1、概念：抑癌基因，又稱腫瘤抑制基因，大多編碼與細胞周期調控有關的抑制蛋白，可調控正常細胞的生長。

在70年代廣泛研究癌基因之前，通過體細胞雜交、流行病統(tǒng)計學及細胞遺傳學分析已指出，存在能抑制細胞轉化的基因表型。2、常見的抑癌基因

當抑癌基因發(fā)生缺失或突變時，細胞不能表達或表達無活性的抑制蛋白，細胞增殖失控而導致腫瘤的發(fā)生。與癌基因相比，它們的數量有限，說明比多樣化的癌基因具有更普遍的作用，在人類癌癥發(fā)生過程中具有至關重要的作用。抑癌基因通常用2或3個字母來表示，有時也介入蛋白質產物的大小?；虻牡鞍踪|產物可用其分子量大小(kDa)來表示，前面加p或與基因相同的代碼。如p53基因的命名是因其編碼序列所翻譯的蛋白的分子量約為53kDa，其基因產生p53蛋白。3、抑癌基因的命名4、抑癌基因必須具備兩個條件：

1、該基因在與腫瘤相應的正常組織中表達，但在該腫瘤中缺陷。2、如果導入該基因，惡性腫瘤細胞的部分或全部惡性表型受到抑制。迄今為止已經發(fā)現并確認了十幾種腫瘤抑制基因，許多人類的遺傳性腫瘤綜合癥常常伴有腫瘤抑制基因的缺失或失活。二常見抑癌基因的一些生物學特性基因染色體 基因產物及作用 主要相關腫瘤APC 5q21 可能編碼G蛋白 結腸癌BRCA1 17q21 含鋅指蛋白的轉錄因子 乳腺癌、卵巢癌DCC 18q21 p192,細胞粘附分子 結腸瘤erbA 17q21 T3受體，含鋅指結構 急性非淋巴細胞白血病 的轉錄因子NF-1 17p12 GTP酶激活劑 神經纖維瘤、嗜鉻細胞瘤、 雪旺氏細胞瘤、神經纖維肉瘤P16 9p21 p16蛋白(CDK4、6抑制劑) 黑色素瘤等多種腫瘤P15 9q21 p16蛋白(CDK4、6抑制劑) 膠質母細胞瘤P21 6q21 p21蛋白(CDK4、6抑制劑) 前列腺癌P53 17p13 p53（轉錄因子） 星狀細胞瘤、膠質母細胞瘤、 結腸癌、小細胞肺癌、胃癌PTEN 10q23 細胞骨架蛋白和磷酸酯酶 膠質母細胞瘤RB 13q14 p105（轉錄因子）視網膜母細胞瘤、成骨肉瘤、胃癌、 小細胞肺癌、乳癌、結腸癌WT-1 11p13 含鋅指蛋白的轉錄因子 WT、橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母細胞瘤腫瘤抑制基因又稱為隱性癌基因原癌基因是顯性基因，一個等位基因突變即可顯示致癌效應；腫瘤抑制基因的突變，則是隱性的，即只有一個腫瘤抑制等位基因發(fā)生突變，不會發(fā)生致癌效應。細胞周期的調控：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白

(cyclin-dependentkinaseinhibitor,CKI)CKI多種成員，其中P21、P27、P57屬廣譜的CDK抑制，而P15、P16、P18、P19是CDK4/CDK6的特異性抑制物。它們在細胞周期調控及腫瘤發(fā)生中的作用已引起廣泛的關注。Cyclin細胞周期蛋白CDKs細胞周期蛋白依賴性激酶三、抑癌基因的作用機制（一）、P53基因

P53基因是迄今為止發(fā)現的與人類腫瘤相關性最高的基因，在50%左右的人類惡性腫瘤中存在變異。

P53基因定位于17p13.1,長20kb，含有11個外顯子，編碼393個氨基酸組成的分子量為53kD的蛋白質，含有5個主要功能區(qū)。1、P53基因的生理學作用：（1）野生型P53蛋白是一種磷酸化蛋白質，是一種轉錄因子，可與特異的DNA序列結合，可激活RB、KIP（P27）等基因，以競爭抑制細胞周期蛋白E與細胞周期依賴性激酶2的結合和抑制細胞內轉錄因子E2F的活性，使細胞不能由G1期進入S期，從而阻止細胞增殖。2、P53突變的致癌機理：

P53的突變或缺失將使細胞受到輻射損傷或致癌物刺激時無法阻斷細胞周期，細胞失去了對G1期的監(jiān)控功能，使細胞帶著受損傷的DNA繼續(xù)分裂，加速了基因組的不穩(wěn)定性，導致一系列突變的積累，最終轉化成逃避監(jiān)控的惡性細胞。在約50％的腫瘤細胞中，可以檢測到P53發(fā)生了突變。猴空泡病毒SV40大T抗原、腺病毒E1B抗原和乳頭瘤病毒與P53結合后，均可使P53的轉錄激活作用喪失，從而失去對細胞周期的調節(jié)，促進細胞的惡性轉化。

3、P53基因功能失活機制主要有以下幾種：

（1）、P53基因自身突變

導致P53蛋白喪失與其靶DNA結合的能力，這是P53基因失活的最重要的機制。（2）、mdm2癌基因的負調節(jié)：

mdm2基因是P53蛋白的靶基因，P53蛋白刺激mdm2基因的表達，而mdm2蛋白可與P53蛋白（野生型和突變型）結合，抑制P53蛋白介導的反式激活、增殖抑制和誘導凋亡的功能，同時mdm2蛋白可以催化P53蛋白的泛素化降解，從而形成一個反饋調節(jié)環(huán)，負調節(jié)P53蛋白的活性。

（3）、P53蛋白與癌蛋白之間的相互作用可能是其失活的另一重要原因（顯性負性效應）。

DNA腫瘤病毒蛋白如SV40大T抗原、腺病毒E1B轉化蛋白、人乳頭瘤病毒E6蛋白等，均可以和P53蛋白結合，抑制其功能活性并促使其降解。

P53基因的突變或缺失在許多腫瘤，包括肺癌、腦癌、肝癌、乳腺癌等中，均是主要的致癌基因，且均為隱性純合子或半合子致癌。但在一些腫瘤中還發(fā)現，突變型P53對野生型P53具有抑制效應，稱為顯性負性效應，從而產生類似純合突變的效應，引起細胞癌變。二RB基因

視網膜母細胞瘤基因（RB）

RB基因位于13q14.1，轉錄生產長4.7kb的mRNA。RB基因共有27個外顯子，其啟動子結構復雜，含有多種轉錄因子如E2F、A1F、RBF1等的結合位點。各種類型的突變導致RB基因功能的丟失。30%的視網膜母細胞瘤中有涉及RB基因的大片段缺失。但不同的患者缺失的13號染色體片段大小是不同的，他們之間共同的最小重疊區(qū)是13q14，這就揭示RB基因位于13q14。

RB蛋白質去磷酸化時，和轉錄因子E2F結合在一起。

Cyclins與相應CDKs結合形成激酶復合物使RB磷酸化，RB蛋白質在磷酸化時，釋放轉錄因子E2F，E2F脫離pRB后恢復活性。

E2F促進基因的轉錄，促使細胞由G1期越過控制點而進入S期，細胞進行增殖。

Rb蛋白質去磷酸化時，與細胞內轉錄因子E2F相結合，使細胞停止轉錄，細胞不能越過G1期控制點，所以不能進入S期，不能進行增殖。

Rb蛋白質磷酸化時，就與E2F分離，E2F就促進細胞的轉錄，促使細胞由G1期越過控制點而進入S期，細胞進行增殖。

三、MTS1基因

腫瘤抑制基因（MTS1），或稱為細胞周期依賴性激酶4抑制因子，定位于9p21，全長8.5kb,含有3個外顯子,編碼148個氨基酸組成的分子量為16kD的蛋白質產物,因此又被稱為p16基因。P16andpRB對細胞周期的調節(jié)

P16基因主要調節(jié)細胞周期來抑制腫瘤發(fā)生，此調節(jié)機制是通過RB基因依賴性途徑實現的。P16蛋白與CDK4/CDK6介導的pRB磷酸化。低磷酸化的pRB蛋白可以與轉錄因子E2F結合而抑制其功能活性。因此阻止細胞從G1期向S的滑動。從而抑制細胞增殖。

P16基因蛋白產物的功能喪失主要與p16基因本身的缺失、點突變及重組有關，其中p16基因的純合性缺失是主要原因，在乳腺癌、食管癌、骨癌、卵巢癌等腫瘤細胞均有純合性缺失；在胰腺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤等腫瘤中均可檢出p16基因啟動子區(qū)域的突變；轉錄與翻譯水平的調控機制異常以及p16基因5’端的高甲基化均可導致p16基因的失活。四、P27基因

P27基因是1994年被克隆的，定位于12p13，cDNA長度為594bp，編碼198個氨基酸組成的耐熱性細胞周期抑制蛋白，分子量為27kD。作為一種特異性CDK（細胞周期依賴性激酶）抑制因子，p27蛋白能與cyclinD-CDK4、cyclinD-CDK6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2等復合物結合，抑制其活性，使細胞停滯于G1期，從而實現其細胞周期調控功能。正常情況下，p27蛋白在G0/G1期進入S期。此外，p27還參與細胞分裂的停止和細胞分化的發(fā)生，并有啟動凋亡的作用。P27對細胞周期的調節(jié)五、BRCA1基因

BRCA1基因是一個應用定位克隆分析發(fā)現的腫瘤抑制因子，定位于17q21，長81kb，含有22個外顯子，包含高達41.5%的Alu重復序列和4.8%的其它重復序列。其表達序列長7.8kb，編碼由1863個氨基酸組成、分子量為220kD的蛋白質。

BRCA1基因是乳腺癌和卵巢癌中的組織特異性腫瘤抑制基因。例如在家族性乳腺癌中，BRCA1基因在生殖細胞中已經發(fā)生了一次突變，當乳腺組織細胞中該基因再次發(fā)生突變時，形成雜合子缺失，導致癌癥的發(fā)生。

在乳腺癌信息中心BCI的BRCA1突變數據庫中，已經有1000多種序列變異的記錄，包括散布于整個基因編碼區(qū)的突變（缺失、插入、移碼突變、錯義突變、無義突變、剪切變異體）、多態(tài)及尚未確定的變異。此外研究發(fā)現在乳腺癌中，BRCA1啟動子區(qū)CpG島的高甲基化、Alu序列對轉錄的影響，剪切方式的異常均可導致mRNA表達水平的下降。一些重要的腫瘤抑制基因（TSG）

TSG染色體定位TSG染色體定位

p5317p13.1RB13q14.1WT111p13p169q21P159q21NF117q1.2P216p21.1p2712p13BRCA117q12DCC8q21.2FAP5q21p731p36.33NM2317q21.3細胞周期的失控與腫瘤發(fā)生：

癌癥已不僅僅是一些癌基因被激活和抑癌基因丟失或失活使細胞獲得了一種增殖優(yōu)勢，而最主要的是癌癥多階段漸積累突變的過程中，細胞的控點(checkpoint)調控因子喪失作用，使在腫瘤細胞中抑制信號無法再對細胞周期蛋白(cyclin-CDK)起任何調控作用。第四節(jié)腫瘤發(fā)生的遺傳學說腫瘤的單克隆起源假說

腫瘤細胞是由單個突變增殖而成的，也就是說腫瘤是突變細胞的單克隆增殖細胞群。

二、二次突變學說

20世紀70年代AlfredKnudson提出了腫瘤抑制基因模型，以解釋遺傳性視網膜母細胞瘤的發(fā)病機制。假設兩種類型視網膜細胞瘤都是由兩個獨立并連續(xù)的基因突變產生的，即二次突變事件引起的。

在遺傳性腫瘤病例中，第一次突變發(fā)生于生殖細胞或由父母遺傳而來，所以該個體的所有體細胞實質都是潛在的前癌細胞。任何體細胞如果發(fā)生第二次突變就會轉化為腫瘤細胞，因此這種腫瘤發(fā)生具有家族性、多發(fā)性、雙側性和早發(fā)性的特點。

非遺傳性腫瘤則是由于第一次突變發(fā)生在某個成體的體細胞中，只影響到來自這個體細胞增殖的細胞克隆，成為前癌細胞，如果在這個體細胞及其克隆發(fā)生第二次突變即可形成腫瘤。因此，非遺傳性腫瘤發(fā)病遲，并且具有散發(fā)性、單發(fā)性和單側性等特點。相比之下，非遺傳視網膜母細胞瘤必須是同一個體細胞發(fā)生兩次獨立的突變，因而在雙側視網膜都發(fā)生兩次突變的可能性較小。二次突變學說

該學說認為：一個腫瘤是由一個惡性細胞增殖而成(即一個克隆)，而一個正常細胞需經過兩次突變才能變?yōu)閻盒阅[瘤細胞。

第一次突變可能發(fā)生在生殖細胞或由父母遺傳而來，為合子前突變，也可能發(fā)生在體細胞；第二次突變則均發(fā)生在體細胞本身。

三、腫瘤的多步驟損傷學說

多步驟致癌假說：

大多數腫瘤的發(fā)生與癌基因的活化和腫瘤抑制基因的失活有關。細胞的癌變至少需要兩種致癌基因的聯合作用，每一個基因的改變只完成其中的一個步驟，另一些基因的變異最終完成癌變過程。正是各種原癌基因發(fā)生了量變和質變，導致表達異常，造成細胞分裂與分化失控，通過多階段演變而轉化為腫瘤細胞，這就是多步驟致癌學說的基本觀點。癌癥的多階段發(fā)生學說(multi-stage)總之：腫瘤的發(fā)生涉及遺傳因素和環(huán)境因素，多基因參與、多步驟遺傳損傷的復雜過程，使正常細胞逐漸惡變成腫瘤細胞，經增殖優(yōu)勢形成腫瘤實體，進一步向體內其它部位播散。

癌變過程：在惡性腫瘤的起始階段，原癌基因激活的方式主要表現為逆轉錄病毒的插入和原癌基因點突變。演進階段：染色體重排、基因重組和基因擴增等（激活方式）腫瘤的多步驟遺傳損傷學說

腫瘤發(fā)生的多步驟學說認為，一個正常細胞要經過多次遺傳損傷打擊后才能轉變成惡性細胞。這種打擊可以是原癌基因的激活，或是腫瘤抑制基因的突變或失活，以及環(huán)境因素促發(fā)某種遺傳損傷等。一種腫瘤會有多種基因的變化，每一個基因的改變只完成其中的一個步驟，細胞癌變往往需要多個腫瘤相關基因的協同作用，要經過多階段的演變，其中不同階段涉及不同的腫瘤相關基因的激活與失活，腫瘤表型的最終形成是這些被激活與失活的相關基因共同作用的結果。

另外，研究發(fā)現，在惡性腫瘤的轉移過程中還存在著促進轉移基因和抑制轉移的轉移抑制基因。

第五節(jié)腫瘤的侵襲與轉移侵襲：指惡性腫瘤向臨近組織擴展性的生長和破壞。轉移：指惡性腫瘤自原發(fā)瘤部位脫離，經過多階段、多步驟的侵襲，到達遠隔部位并生存發(fā)展成與原發(fā)瘤相似結構的繼發(fā)瘤。

侵襲與轉移是腫瘤細胞與宿主細胞、細胞外基質之間的一個復雜的相互作用的動態(tài)過程，包括腫瘤細胞首先脫離原發(fā)瘤灶并向周圍組織侵襲，進而侵入血管或淋巴管；若其能在血液循環(huán)或淋巴循環(huán)中逃逸免疫監(jiān)視機制的殺傷作用而存活，并具有較強的黏附性而能夠與內皮細胞黏附，同時又具有較強的運動性和穿過血管基底膜的能力，才可穿出管壁進入實質器官，并生長、擴展而形成轉移灶。總之，侵襲與轉移發(fā)生與否