微生物實(shí)驗(yàn)五 酵母菌的形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)五酵母菌的形態(tài)觀察13生物基地201300140059劉洋2014-11-08同組者：呂贊劉沛余馬華崢實(shí)驗(yàn)器材菌種釀酒酵母2d麥芽汁斜面培養(yǎng)物、釀酒酵母麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基產(chǎn)孢培養(yǎng)斜面培養(yǎng)物。溶液和試劑0.01%美藍(lán)水溶液、5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液、95%乙醇儀器和其他用品酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，小試管，燒杯，試管架，載玻片夾，滴管，無菌水等培養(yǎng)基麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基、酵母合成培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握酵母菌一般形態(tài)和與細(xì)菌的區(qū)別。觀察酵母菌的出芽生殖，區(qū)分死活細(xì)胞。學(xué)習(xí)酵母菌子囊孢子觀察方法。鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理1.美藍(lán)染液水浸片法單細(xì)胞的酵母菌個(gè)體是常見細(xì)菌的幾倍甚至幾十倍，大多數(shù)采取出芽方式進(jìn)行無性繁殖，液可以通過接合產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)行有性繁殖。由于細(xì)胞個(gè)體大，采取涂片的方法制片有可能損傷細(xì)胞，一般通過美蘭染液水浸片法或水—碘液浸片法來觀察酵母菌形態(tài)及出芽生殖方式。同時(shí)，采用美蘭染液水浸片法還可以對酵母菌的死、活細(xì)胞進(jìn)行鑒定。美蘭對細(xì)胞無毒，其氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。由于新陳代謝，活細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)還原能力，使美蘭由藍(lán)色氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的還原型，染色后活細(xì)胞呈無色。死細(xì)胞或代謝能力微弱的衰老的細(xì)胞內(nèi)還原能力弱，染色后細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。2.出芽生殖酵母菌在出芽繁殖時(shí)會(huì)在母體上長出一個(gè)芽，芽體與母體相連，但從個(gè)體大小上講一般比母體要小一些。酵母菌的芽殖過程開始于母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和壁向外突出，進(jìn)而細(xì)胞核以有絲分裂方式分成兩個(gè)子核，一個(gè)子核留在母細(xì)胞內(nèi)，另一個(gè)子核轉(zhuǎn)移到突出部分，然后細(xì)胞在突出部分縊縮而生出芽體。芽體與母細(xì)胞暫時(shí)相連，并可以重復(fù)上述過程形成一個(gè)許多芽體彼此相連的群體。當(dāng)芽體長到與母細(xì)胞大小相近時(shí)，從母體上脫落下來，成為完整的新個(gè)體。3.子囊和子囊孢子染色酵母菌是以形成子囊和子囊孢子進(jìn)行有性繁殖的。兩個(gè)臨近的酵母細(xì)胞各自伸出一根管狀的原生質(zhì)突起，隨即相互接觸、融合，并形成一個(gè)通道，兩個(gè)細(xì)胞核在此通道內(nèi)結(jié)合，形成雙倍體細(xì)胞核，然后進(jìn)行減數(shù)分裂，形成4個(gè)或8個(gè)細(xì)胞核。每一子核與其周圍的原生質(zhì)形成孢子，即為子囊孢子，形成子囊孢子的細(xì)胞稱為子囊。經(jīng)染色后子囊孢子呈綠色、菌體和子囊呈粉紅色。實(shí)驗(yàn)步驟美藍(lán)染液水浸片法滴加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液于載玻片中央，無菌操作用接種環(huán)由釀酒酵母麥芽汁斜面培養(yǎng)物挑取少許菌體置于染液中，混合均勻。用鑷子取一塊蓋玻片，將蓋玻片一邊與菌液接觸，緩慢將蓋玻片傾斜并覆蓋在菌液上。將制片放置3min后，用低倍鏡及高倍鏡觀察酵母菌形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)細(xì)胞顏色區(qū)分死活細(xì)胞。染色后每隔一段時(shí)間再次觀察，注意死活細(xì)胞比例是否發(fā)生變化。子囊孢子染色取一塊載玻片，滴一小滴生理鹽水于兩個(gè)區(qū)域中央；用接種環(huán)無菌操作分別由枯草芽胞桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面和金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面挑取適量菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)置于載玻片上的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜。涂菌面朝上，通過酒精燈火焰，直至形成一層肉眼可見的干燥菌膜。在用酒精燈烘干時(shí)，應(yīng)隨時(shí)用手背接觸載玻片，以控制其溫度適中。滴加孔雀綠染液覆蓋1-2min，之后水洗。滴加95%乙醇覆蓋30sec，之后水洗。滴加番紅染液覆蓋1min，之后水洗。自然干燥并鏡檢。注意事項(xiàng)用接種環(huán)將菌體與染液混合時(shí)不要?jiǎng)×彝磕ǎ悦馄茐募?xì)胞。滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時(shí)，染液過多會(huì)溢出，過少會(huì)產(chǎn)生大量氣泡。蓋玻片要緩慢傾斜覆蓋，以免產(chǎn)生氣泡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果美藍(lán)染色后的酵母菌活體，其中藍(lán)色的為已死亡酵母菌，可觀察到出芽生殖。出芽生殖出芽生殖酵母菌子囊孢子染色，紅色的為菌體，綠色的為子囊孢子結(jié)果分析1.酵母菌為單細(xì)胞微生物，其出芽生殖一次可生出多個(gè)芽體。2.通過實(shí)驗(yàn)觀察，時(shí)間越長酵母菌死活細(xì)胞的比例越大。3.酵母菌子囊孢子的數(shù)目是偶數(shù)個(gè)。思考題根據(jù)你的觀察結(jié)果，呂氏堿性美藍(lán)染液濃度及作用時(shí)間與釀酒酵母死活細(xì)胞比例變化是否有關(guān)系？試分析原因。雖然美藍(lán)染液無毒，但是如果美藍(lán)染色液作用時(shí)間過長或濃度過高，會(huì)造成酵母細(xì)胞脫水死亡，使得死活比升高。釀酒酵母除了通過出芽方式進(jìn)行無性生殖外，還可以形成子囊孢子進(jìn)行有性生殖，你在實(shí)驗(yàn)中是否觀察到釀酒酵母的子囊孢子？若未觀察到，試分析原因。觀察到了，如果為觀察到，可能是培養(yǎng)基條件不適宜。附錄麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基配方（113℃滅菌30min）葡萄糖1.