武漢大學動物細胞工程復習題

1《動物細胞工程》的基本概念及主要研究內(nèi)容。動物細胞工程是通過細胞及其組分的人工操作，來研究生命活動規(guī)律，實現(xiàn)遺傳改造，結合非生物材料等手段，生產(chǎn)用于治療疾病的人工器官、代謝產(chǎn)物等或用于深入研究的材料。動物細胞工程所涉及的主要技術有細胞培養(yǎng)、細胞融合、染色體或染色體組轉移、基因轉移以及動物胚胎工程等，從細胞整體水平、核質水平、染色質水平和基因水平上對細胞進行遺傳操作。2人造細胞概念及技術。1從山羊身上取出支原體細菌體，再將該細菌體的內(nèi)部掏空，備用。2研究人員通過郵購目錄購買DNA片段，隨后用4個瓶子裝上含此DNA片段不同序列的物質。3含DNA片段不同序列的瓶裝物質被放入酵母液中，使其重新組合形成人造DNA。4人造DNA被植入備用的支原體細菌體中，隨后該細菌體會分裂成兩個子細胞，一個含人造DNA，一個具有天然DNA。5向培養(yǎng)皿中加入抗生素，導致具有天然DNA的細胞被殺死，而含人造DNA的細胞得以存活。6支原體細菌體中的原有天然DNA被徹底清除，最終由人工DNA支撐其恢復生命機能，自此“人造細胞”得以生成。能夠自我復制的人造細胞誕生2010年05月22日13:59科技日報本報訊據(jù)英國《泰晤士報》5月21日(北京時間)報道，有“科學怪人”之稱的美國生物學家克雷格·文特爾領導的研究小組宣稱，他們已經(jīng)在實驗室制造出了首個完全由人造基因指令控制的細菌，這標志著“人造生命”這個夢想已經(jīng)走進現(xiàn)實。文特爾研究小組將制造生命的研究分“三步走”，而整個過程從四瓶化學物質開始。第一步，研究人員制造出絲狀支原體(Mycoplasmamycoides)細菌的4個DNA堿基，合成出108萬個DNA片段。第二步，將這些片斷“組裝”成完整的基因組。第三步，將人造基因組注入另一種剔除了遺傳物質的近親細胞山羊支原體(Mycoplasmacapricolum)中，并且激活了該細胞，最終得到了一個新的、完全被人造基因組控制的人造細胞Synthia。到目前為止，新細胞已經(jīng)分裂了10億多次。文特爾指出，這個名為Synthia的人造細胞是能夠自我復制的生物，它的出現(xiàn)意味著，人類能夠制造出自然界從來不曾出現(xiàn)的、具有特定功能的生物有機體。研究人員希望使用這項技術制造生物燃料、海藻以及更好的疫苗等。文特爾的技術進展“一石激起千層浪”。有些科學家承認，在人工合成迄今為止最大的DNA方面，在足以替代細菌自己的DNA方面，文特爾都取得了巨大的進步。但也有人持不同的意見。據(jù)美國《紐約時報》20日報道，諾貝爾生理學與醫(yī)學獎獲得者大衛(wèi)·巴爾的摩教授認為，除了組裝出一塊大的DNA外，文特爾的實驗沒有取得新的突破，“他并沒有制造生命，僅僅模擬了生命。人類要制造出人造生命，還有很長的路要走”。另外，該項研究也引發(fā)了公眾有關倫理道德的憂慮。批評人士擔心這種技術會帶來“生物恐怖主義”，威脅環(huán)境和人類健康。他們希望政府出臺更加嚴格的管理政策。對此，據(jù)《紐約時報》報道，美國總統(tǒng)奧巴馬要求白宮生物倫理委員會于6個月內(nèi)提供一份有關合成生物學的詳盡研究報告。奧巴馬表示，新的技術進展提出了“真正的憂慮”。早在2002年9月，美國科學家艾克德·魏瑪領導的研究小組曾合成出脊髓灰質炎病毒的全基因組序列，該病毒基因組不僅可以指導合成出與天然病毒蛋白質同樣的蛋白質，而且同樣具有侵染宿主細胞的活力。文特爾的實驗原理上同魏瑪?shù)囊粯樱徊贿^，魏瑪?shù)牟《镜幕蚪M僅有7500個片段，而文特爾的細菌的基因組擁有的基因片段更多而已。加拿大生物倫理學組織ETC主任帕特·穆尼表示，文特爾的技術是一個潘多拉的魔盒，我們都必須面對其可能會引發(fā)的巨大震動。(劉霞)在生物學界被稱作“壞小子”，文特爾有時的確挺不招人待見，但巴爾的摩作為一位令人尊敬的諾獎得主，如此評價這項成果也嫌偏頗。較之近年來屢屢公布的相關進展，文特爾的人造細胞除基因片段顯著增加外，更實現(xiàn)了分裂，而細胞的分裂和進化才是生命體最重要的功能和特征。所以，我們與其討論它是不是新的突破，還不如心平氣和地關注其目標指向，特別是這個曾狂言“基因沒有好壞”的人，最終究竟是想造出一千個愛因斯坦，還是一千個希特勒。3顯微鏡的由來1604年荷蘭人詹森把兩塊磨好的透鏡同軸間隔一定距離裝在銅管子里，用它來看書本上的字，字被放得很大。詹森因此成為顯微鏡的奠基人。后來，伽利略通過兩個玻璃透鏡形成一個圓柱體工具，觀察到了昆蟲的眼睛，并繪制幾何圖，成為了第一個通過原始顯微鏡記錄生物的學者。1665年，英國人RobertHooke用自制顯微鏡觀察軟木栓，觀察到了“小室”結構，并定名為cell再后來，1674到1683年之間，荷蘭人安東尼·范·列文虎克用自制的所謂高倍顯微鏡觀察了許多物體，并發(fā)現(xiàn)了細菌，此后兩個世紀沒有人看到比細菌更小的細胞。隨著技術的進一步發(fā)展，現(xiàn)在又出現(xiàn)了熒光顯微鏡、電子顯微鏡等放大倍數(shù)更高的顯微鏡。4相差顯微鏡，熒光顯微鏡,透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡的特點和用途。相差顯微鏡：利用光的衍射和干涉原理，將光透過樣品后產(chǎn)生的光程差轉換成振幅差，從而產(chǎn)生明暗差異，立體感強，不需染色?？蛇M行活體觀察、連續(xù)觀察。熒光顯微鏡：染色簡便，彩色圖像，明亮，效果好，靈敏度高。用途：通過熒光素的標記觀察物體構造；用抗體熒光標記后，通過熒光的有無、色調(diào)比較進行物質判別；通過發(fā)熒光量的測定對物質定性、定量分析。透射電子顯微鏡：用波長很短的電子束作為光源，穿透樣品，需制作超薄切片，用來觀察樣品內(nèi)部結構，二維。掃描電子顯微鏡：收集電子束激發(fā)樣品產(chǎn)生的二次電子，用來觀察樣品表面結構，立體感強，三維。5什么時候需要使用顯微鏡的相差，熒光功能。6如何理解細胞形態(tài)由其功能所決定？細胞的形態(tài)結構與功能的相關性與一致性是很多細胞的共同特點,在分化程度較高的細胞更為明顯.這是生物漫長進化過程的產(chǎn)物,從進化觀點看有一定的合理性.如紅細胞，細胞體積小,呈扁圓形,非常有利于在血管內(nèi)快速運行,體積小則相對表面積大,有利于提高氣體交換效率.細胞內(nèi)主要是血紅蛋白,有助于結合更多的氧氣與二氧化碳.因此,紅細胞的形態(tài)和結構裝置與其運輸?shù)墓δ艿年P系是非常合理的.7GFP技術及其特點。GFP最早是從水母中分離出來的,當其受到紫外或藍光激發(fā)時，可以發(fā)出綠色熒光。而其基因可在異源組織中表達并產(chǎn)生熒光。由于其良好的物理特性及熒光特性而成為良好的報告基因和熒光標記分子,并在探索生命現(xiàn)象過程中得到了非常廣泛的應用。特點：(1)可用在活細胞中直接觀察蛋白質在細胞器中的運動.(2)既具有敏感的標記檢測率，又沒有放射性的危害.(3)易于構建載體且對活細胞無毒害，對目的基因的功能也沒有影響.(4)轉化后細胞可以繼續(xù)傳代。8報告基因的使用技巧。報告基因的選擇取決于特定的研究目的以及分析的可行性（敏感性、可信度、可檢測性以及動力學性質），報告基因的穩(wěn)定性將決定其是否適合轉錄的動態(tài)研究、高通量研究以及在轉基因實驗中全或無式的基因表達研究。例如，螢火蟲Luc和海洋腔腸Luc由于對蛋白質水解的敏感性，其半衰期較氯霉素乙酰轉移酶（CAT）要短,這樣的特性使其更適合轉染效率和動力學研究；再如，野生型GFP與Luc相比，熒光信號的線性范圍較窄，這就不大適合轉錄的定量研究；GFP由于缺乏酶促擴大效應，因此其靈敏性較Luc要差，這就使其局限于那些只有高表達的基因研究，而且GFP在細胞內(nèi)的累積使其更不適合高通量的篩選。目前已使用雙報告基因系統(tǒng)，例如：螢火蟲和海洋腔腸雙LUC9細胞組分的幾種分離技術。用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物:用低滲勻漿,超聲破碎或研磨等方法可使細胞膜破碎,形成細胞核,線粒體,葉綠體,內(nèi)質網(wǎng),高爾基體,溶酶體等細胞器和細胞組分的混合勻漿,再通過差速離心和密度梯度離心將各種亞細胞組分和各種顆粒分開.10細胞類型的分離技術及其特點。差異沉降differentialsedimentation:根據(jù)大小、密度差異附著differentialadhesion:免疫吸附，磁性分離抗體選擇antibodyselection流式細胞分離flowcytometry11FiberFISH技術。FiberFISH是近幾年發(fā)展起來的一項高分辨率和高靈敏度的熒光原位雜交技術,已被廣泛應用于人類及動植物基因組的研究。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization)將DNA用特殊修飾的核苷酸分子標記(如biotin-dUTP或dig-oxigenin-Dutp)作為探針分子特異結合來檢測該DNA染色體上的位置。具有不需放射性同位素、實驗周期短和檢測靈敏度高的優(yōu)點。已被廣泛應用于動植物基因組結構的研究,染色體結構的分析和DNA譜的構建等。12細胞周期。由一個細胞增殖分裂為兩個細胞的過程.在這個過程中染色體復制一次,隨后隨著細胞分裂平均分配到兩個子細胞中,這個周期分為G1;S;G2;M四個時期,G1,S,G2為細胞間期,M為分裂期.13細胞周期的關鍵調(diào)控點。G1--S(存在于G1之內(nèi),控制細胞進行復制的關鍵點)G2--M(存在于G2之內(nèi),控制細胞進行分裂關鍵點)14G0期細胞及其生物學意義。位于細胞周期中G1后段,而且存在G1--G0的轉化過程,G0細胞處于靜止狀態(tài),不進行分裂.在G1--S關鍵點,細胞要做出是否進入下一次分裂或處于靜止狀態(tài)G0的決策.如,部分肝臟細胞,一定時期乳腺細胞.另外有一部分細胞屬于終端分化細胞,如神經(jīng)細胞,肌肉細胞等總之,分裂細胞+終端分化細胞+G0細胞=機體和組織細胞活動多樣性.15細胞系及其特性。在體外培養(yǎng)條件下,可以永久進行繁殖的細胞,這種細胞可以無限傳代,稱為細胞系.特點:可以提供大量的同一類型的細胞,有利于研究工作可以大量分離細胞產(chǎn)物,用于企業(yè)化生產(chǎn)可以長期并存于液氮之中,需要時可以解凍復蘇細胞系細胞多數(shù)為非整倍染色體,個別為二倍體,如WI-38.16細胞操作的無菌技術的原則，含義及其內(nèi)容。原則:保證細胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)瓶內(nèi)部,吸管包裝層內(nèi)部,以及培養(yǎng)基的無菌狀態(tài),這一點十分重要,它包括:工作環(huán)境以及表面處理實驗者的操作技術細胞培養(yǎng)所用的玻璃以及塑料制品的處理培養(yǎng)基的無菌處理消毒與滅菌超凈工作臺:用75%乙醇擦洗,紫外燈滅菌30-50分鐘無菌間:用30W的紫外燈30-50分鐘玻璃器皿:新器皿用5%HCl泡12h

用過的器皿用酸劑浸泡,煮沸,清洗,浸泡,清洗,晾干,滅菌其它器皿:橡膠,塑料器皿用專用洗滌劑清洗以后,2%NaOH浸泡過夜,5%HCl泡30分鐘,清洗晾干,滅菌.

金屬器皿洗凈后,用酒精棉球擦,滅菌.滅菌方法:物理方法:干熱,濕熱,過濾化學方法:消毒劑,抗菌素17細胞凍存與復蘇技術要點。細胞凍存要點：細胞分裝入凍存管中。凍存管具有螺旋口，可以防止液氮漏入管中，提高凍存效率。應采用分步的方式達到臨界點，使內(nèi)部冰晶無法形成，同時不影響水的外流，1攝氏度|分為降溫標準，可以采用程序方式的細胞凍存儀。降溫支架，可以使凍存管保持在氣象上方，凍存管下降到液氮罐中的不同溫度，可以調(diào)節(jié)凍存速率。懸重離心收集的細胞，1ml凍存液，成分為：培養(yǎng)基7ml，PBS2ml，甘油或DSMO為1ml（5-20%），在配置時注意比例。加入1ml細胞，標明細胞系名稱，日期培養(yǎng)基。-80攝氏度過夜或用程序細胞儀。次日，直接將其轉入液氮中。細胞凍存的復蘇將燒杯中水溫調(diào)至40攝氏度。從液氮中取出凍存管。將凍存管放在燒杯中至完全融化，一旦冰塊消失，立即將凍存管取出。這一重要操作的目的是使細胞溫度不升至37攝氏度以上。用75%乙醇擦洗凍存管外部，減少污染。取出細胞加入培養(yǎng)瓶中，緩緩加入少許培養(yǎng)基，混勻。37攝氏度培養(yǎng)，24h更換培養(yǎng)基。18影響動物細胞生長的環(huán)境因素。營養(yǎng)成分的要求

根據(jù)各種細胞具體要求準備培養(yǎng)基,一般要求有:合成培養(yǎng)基(營養(yǎng)基本);血清對pH的要求

pH因素是細胞生長環(huán)境的重要因素,一般大多數(shù)要求為pH7.2-7.4

a.培養(yǎng)基中應有緩沖液,如Hepes,H+緩沖液,對細胞沒有副作用,可以在較長時間控制pH的波動.

b.CO2濃度的要求,多數(shù)細胞要求5%CO2,95%空氣,常CO2培養(yǎng)箱對溫度的要求

一般溫度T為37℃左右,不同的細胞對溫度有不同的要求對滲透壓的需要

一般260-320mosm/kg,培養(yǎng)基的滲透壓指用以阻止水分經(jīng)過半透膜進入培養(yǎng)基的壓力5>對抗生素的要求

雙抗(青霉素:100單位/ml培養(yǎng)基+鏈霉素:100ug/ml培養(yǎng)基)

另有,青霉素G,Na+鹽,硫酸鏈霉素,用緩沖液如Hanks液配制.19大規(guī)模細胞培養(yǎng)的類型。①懸浮培養(yǎng):少數(shù)動物細胞需懸浮培養(yǎng).②微載體培養(yǎng):增加細胞生長貼壁面積,生長條件已控制且易放大，兼貼壁與懸浮培養(yǎng)，取樣方便，易于分離。③多孔載體培養(yǎng):多空載體是大規(guī)模高密度培養(yǎng)支持物.細胞在小孔內(nèi)生長.④微囊化培養(yǎng):微囊是人工半透膜制成的多孔微球體，小分子可自由通過，該培養(yǎng)借助于固定化技術將細胞包裹在微囊中在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng).⑤中空纖維培養(yǎng):模擬細胞在體內(nèi)的生長三維狀態(tài)，利用中空纖維給細胞生長提供營養(yǎng)等。20設計一個細胞追蹤技術路線。21干細胞的概念，種類,分布。概念：干細胞是一種具有自我更新的能力;高度增殖;多向分化潛能，可再生各種組織的細胞。種類：依來源可分為胚胎干細胞、胚胎性生殖干細胞、成體組織來源干細胞；依能力可分為全能干細胞、多能干細胞、單能干細胞分布：普遍存在于各種器官，但數(shù)量很少。22干細胞的生物學特征,分化潛能。生物學特征：1）細胞形態(tài)結構及核型：體積小核大，常染色質，核型正常，克隆狀生長，迅速增殖，可在體外選擇、操作、凍存2）高度分化潛能：一旦脫離飼養(yǎng)層則自發(fā)分化，單層培養(yǎng)時自發(fā)分化成多種細胞。用胚胎干細胞注射于同源動物皮下可形成組織瘤，其細胞組成可代表三個胚層。3）堿性磷酸酶的表達：快綠染色法4）細胞表面有特異抗原的表達：比如人的干細胞表達SSEAS-4，而小鼠不表達分化潛能：1）全能干細胞：具有形成完整個體的分化潛能2）多能干細胞：具有形成多種組織的分化潛能，但不能形成個體3）單能干細胞：只能向一種或密切相關的幾種細胞分化23胚胎干細胞的鑒定技術。根據(jù)胚胎干細胞的生物學特征來鑒定24胚胎干細胞面臨的難題和挑戰(zhàn)。如何維持題外擴增時不分化分化細胞的增殖是一個瓶頸問題如何定向誘導干細胞分化胚胎干細胞真正用于器官克隆與移植需有技術上的突破克服移植排斥問題安全性問題，如致癌、致畸倫理問題，如來源25成體干細胞。主要包括6種：1、骨髓造血干細胞HSC(MarrowHematopoieticStemCells)；2、外周血干細胞PBSC(PeripheralBloodStemCells)；3、胎肝干細胞(FetalLiverStemCell)；4、臍帶血干細胞(UmbilicalCordBloodStemCell)；5、神經(jīng)干細胞（NeuralStemCells）；6、皮膚干細胞（SkinStemCell）。26腫瘤干細胞、它與正常干細胞的異同。概念：腫瘤內(nèi)具有自我更新，能產(chǎn)生表型多樣的腫瘤細胞群體，并驅動腫瘤發(fā)生的一類干細胞。同：都具有自我更新能力，數(shù)量少，子代細胞與親代不同異：腫瘤干細胞分布于腫瘤細胞中，使腫瘤細胞群體產(chǎn)生多種表型，可以誘導腫瘤發(fā)生正常干細胞分布于各組織器官中，具有多向分化潛能，但不會誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生27干細胞應用。研究人類發(fā)育和細胞分化的機制；研究疾病機制；用于疾病治療28干細胞的法律、倫理道德問題。如干細胞的取材問題29對干細胞的新認識,干細胞與分化細胞的關系。新認識：干細胞是可以進行復制、具有自我更新能力和多向分化能力的未成熟細胞。干細胞通過基因的突變和重組產(chǎn)生各種類型的細胞，同時這些改變也可能會造成腫瘤。干細胞很難殺死，因為它在人的一生中十分重要，進化出了保護機制，這也就解釋了腫瘤干細胞很難被抗癌藥物殺死的原因。關系：干細胞是機體中保有的未分化的原始細胞，一旦需要則發(fā)育成分化細胞分化細胞在一定條件的誘導下，可成為多能干細胞，重新編程30誘導型干細胞及其技術，它的生物學意義。誘導多功能干細胞是通過基因重新編排方法，“誘導”普通細胞回到最原始的胚胎發(fā)育狀態(tài)，能夠像胚胎干細胞一樣進行分化。將4個Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4對維持ES多能性有重要作用的因子，經(jīng)逆轉錄病毒連續(xù)轉染入小鼠胚胎或成體的成纖維細胞中，誘導形成iPS細胞.生物學意義：1、獲得人的iPS細胞，運用ips技術進行疾病治療，特別是患者特異的移植治療。2、細胞治療3、正常胚胎發(fā)育4、研究疾病機制5、檢測藥物的作用6、畸形學研究31組織工程概念，目標。概念：組織工程是應用工程學和生命科學的原理來研究開發(fā)生物替代物，用于恢復、維持或者改進組織的生物學功能。目標：完成生物性機械作用（骨、軟骨）代替生理功能（肝臟、神經(jīng)）輸送分泌物（胰島）上述目標的綜合32組織工程基本過程，主要途徑及要素主要途徑：細胞囊封化（體外）：a）把需要的細胞密封在半透膜中b）植入密封裝置或與體內(nèi)連接c）細胞分泌物用于治療d）治療完成時裝置取出或斷開連接體外合成：a）體外細胞接種在支架裝置上b）細胞培養(yǎng)、擴增群體并進行組織工程c）在被植入的裝置上建立起細胞群d）裝置降解，支架被重塑組織取代體內(nèi)合成：a）植入多孔支架裝置b）細胞體內(nèi)生長c）支架被重塑組織取代要素：種子細胞，支架，微環(huán)境種子細胞種子細胞的條件： 1）容易在體外大量培養(yǎng)，粘附力強 2）培養(yǎng)出的細胞具有正常的分化能力 3）進入體內(nèi)不會傳染病菌也不會產(chǎn)生腫瘤 4）其分子結構和功能與正常血管細胞相似 5）臨床上易取得，具有實用性種子細胞的來源同種異體：已分化的細胞，不易在體外培養(yǎng)復制自體組織：首選，但是數(shù)量上有局限性，長期傳代后細胞功能會老化干細胞：近年來熱門領域胚胎干細胞：具有分化潛能成體干細胞：直接利用待解決的問題：增加細胞的增殖能力延長細胞的生命期提高細胞的分泌能力優(yōu)選不同組織來源的同一功能的最佳細胞建立標準細胞系，使研究工作有更好的可比性和科學性同種異體與異種移植的免疫學細胞與人工細胞外基質的相互作用與影響因素支架 組織工程支架是細胞附著的基本框架和代謝場所，作為組織工程的平臺，不僅提供了細胞生長的框架，使之形成特定的組織或器官形狀，而且作為細胞外基質（ECM）成分之一，是細胞間信號傳導和相互作用的媒介，同時也是細胞生長所需的生物活性劑，其形態(tài)和功能直接影響所構成的組織形態(tài)和功能。 理想的三維支架的構建是組織工程化人工器官研究成功的前提條件，其類型分： 天然支架 人工支架 復合支架細胞微環(huán)境 組織細胞生長的最佳環(huán)境，給細胞提供一個能夠生長、增殖、分化的良好環(huán)境 其基本要素包括： 1）免疫分子：球蛋白家族 主要作用是表達細胞的免疫和炎性應答，識別抗原和負責細胞間的傳遞 2）整合素家族 主要作用是對細胞之間及細胞與胞外機制進行連接整合素大多為特異性細胞粘附分子，其作用依賴于鈣離子。介導細胞與細胞間的相互作用及細胞與細胞外基質間的相互作用。 3）選擇蛋白選擇蛋白是膜整合糖蛋白的一個家族，他能夠識別從另外一個細胞表面伸展出來的特異性的糖基因，并與之特異性結合，因此它也是細胞表面受體。作用是使淋巴、血小板和白細胞與內(nèi)皮細胞之間的相互作用，負責血細胞與內(nèi)皮細胞的連接。 4）生長因子 功能：能誘導或直接作用于基因表達，因而作用于細胞的增殖和分化。ProcessDonortissueEnzymeEnzymeCellsCellsDegradablepolymerscaffoldFixImplantOrCultureFunctional3Dtissue33哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的特點、優(yōu)勢。在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中，可進行多肽鏈的修飾從而產(chǎn)生有功能的蛋白質糖基化問題：糖基化的蛋白質才能在人體中發(fā)揮應有的生物活性免疫原性問題：非糖基化蛋白質易聚集，使抗原性增強或改變，引發(fā)抗體識別，而糖基化了的蛋白質由于寡糖鏈的存在，易溶解，不聚集寡糖鏈結構問題：其他真核細胞表達系統(tǒng)由于糖基化酶不同，寡糖鏈末端多為甘露糖、半乳糖、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸等，易被肝細胞、巨噬細胞表面的受體識別從而清除，具有免疫原性。34穿梭質粒及其基本組成元件。常作為質粒載體,是在細菌和哺乳動物細胞內(nèi)部可以擴增的質粒。元件：一個真核表達載體首先必須含有三個基因的轉錄元件：

a.一個真核表達啟動子和增強子

b.一個真核表達終止信號和poly(A)信號(真核生物都有poly(A)信號)

c.一個真核表達剪切信號(切出內(nèi)含子)允許載體在細菌體內(nèi)擴增的質粒序列,多數(shù)含有質粒PBR322的序列.如在細菌內(nèi)復制的起始位置ori,抗基性標記基因amp.能用于篩選出外源基因已經(jīng)整合的選擇標記選擇性增加外源基因拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng).

3>,4>多用在一個系統(tǒng)中起作用,DHFR(二氫葉酸還原酶)特定的限制性內(nèi)切酶位點,有利于插入目的基因.35哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中的各種宿主細胞。至今批準的由動物細胞表達的產(chǎn)品宿主細胞幾乎都是CHO（中國倉鼠卵巢細胞），但是1>.需要微載體，因為懸浮培養(yǎng)時產(chǎn)量會降低2>.某些產(chǎn)物會聚集化：如單鏈尿激酶原變成雙鏈，尿激酶失去活性。已開發(fā)的其它一引起細胞系，如：1>.CHO-k11957年，從中國倉鼠卵巢中分離的一株上皮樣細胞，目前用于構建工程的細胞是dhfr-營養(yǎng)突變株，可以在MTX（氨甲喋呤）壓力下使外源基因的拷貝數(shù)擴增，使用權外源蛋白質水平表達。目前是主流細胞株。2>.BHK-211961年，取自aone-dayoldmice’s腎，必須貼壁生長。1963采用單細胞分離技術經(jīng)13次克隆的細胞，經(jīng)多次傳代，可以懸浮生長。廣泛用于表達重組蛋白，病毒增殖。3>.C127來自RIII小mice乳腺腫瘤細胞。特別用于：帶有牛乳頭瘤病毒的載體的轉染。當BPV-1病毒載體轉染以后，細胞的生長形態(tài)發(fā)生改變，因此轉染成功的細胞可通過特有形態(tài)來識別。4>.MDCK由MadinDarby在1958年從雌性西班牙長耳狗腎臟中分離。它是一種貼壁生長的上皮樣細胞，已成功在微載體上培養(yǎng)。它可以支持多種病毒的增殖，用于生產(chǎn)獸用疫苗。5>.Namalwa以Burkitt淋巴瘤的同名病人獲得的一株類淋巴母細胞含有許多EB病毒的基因，但不產(chǎn)生EB病毒。目前已被批準用于大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素。6>.vero從非洲綠猴腎分離而得到，它是貼壁生長的成纖維細胞支持多種病毒的增殖。已被用于生產(chǎn)多種疫苗。如狂犬疫苗、乙腦疫苗、脊髓灰質炎病毒疫苗。7>.cos1981年，Gluzman用復制起點缺失；sv40基因組，DNA轉化非洲綠猴腎細胞，cv-1得到3個細胞素，cos-1,-3,-7廣泛用于基因瞬時表達系統(tǒng)，基因的表達調(diào)控的研究等。cos細胞易培養(yǎng)，易轉染；同時,cos細胞能組成性表達sv40大T搞原，能使大多數(shù)哺乳動物細胞攜帶有sv40ori復制子的質粒，以附加體形式高拷貝數(shù)擴增，擴增的mRNA和蛋白質易回收利用分析8>.鼠骨瘤細胞它是非常好的分泌細胞，培養(yǎng)上清中可生產(chǎn)高達成1mg/L的蛋白，可以在無血清下高度懸浮生長。36逆轉錄病毒介導基因轉移技術的特點及其基本步驟。逆轉錄病毒介導基因轉移技術具有可大量感染細胞、單拷貝整合和高轉化頻率（可達100%）等優(yōu)點。該技術大致包括以下步驟：構建病毒載體，將外源基因替換病毒的與致病或致癌有關的基因，使該病毒成為缺陷病毒。選擇和培養(yǎng)組裝細胞系，該細胞系含有所需輔助病毒，重組病毒載體在該細胞中能組裝成重組病毒。用此重組病毒載體感染靶細胞，使靶細胞轉化，并表達外源基因。該技術在人體內(nèi)有潛在的危險。逆轉錄病毒載體構建技術路線LTR逆轉錄病毒載體構建技術路線LTRLTREgagpolenv逆轉錄病毒基因組+gagpolenv+外源基因引入病毒蛋白編碼區(qū)缺失病毒蛋白和調(diào)控區(qū)插入外源基因gagpolenv病毒蛋白ELTRLTRELTRLTR載體結構輔助細胞gagpolenv病毒蛋白收集病毒載體載體病毒感染目的細胞D17細胞37線粒體移植技術。線粒體移植技術大體上可以分為兩種途徑，卵母細胞時期移植和受精卵時期移植。 1、卵母細胞時期移植：用正常第三者細胞質替換 2、受精卵時期移植：保留核，去除病變線粒體38幾種細胞基因轉染技術?；蜣D染是將具生物功能的核酸轉移或轉運到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能的技術，廣泛應用于基因組功能研究和基因治療研究。 根據(jù)轉染的機制不同可將轉染法分為化學轉染法，物理轉染法，病毒感染法。 化學轉染法： ①DEAE-葡聚糖 是最早應用于哺乳細胞轉染的試劑之一，它是陽離子多聚體，與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取。成功應用于瞬時開始，但用于穩(wěn)定轉染卻不可靠。 ②磷酸鈣共沉淀法 試劑易得，價格便宜，廣泛應用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染的研究。先將DNA與氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上，通過包膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。 ③人工脂質體法 可以介導DNA和RNA轉動物和人體內(nèi)，用于基因治療。人工合成的陽離子脂質體與帶負電荷的核酸結合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進入細胞質，隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內(nèi)。 物理轉染法 ①電穿孔法 利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔?？捎糜谒矔r轉染和穩(wěn)定轉染，可方便地用于懸浮細胞，重現(xiàn)性好，但需要較多細胞。影響轉染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最佳平衡點。 ②顯微注射法 費力但有效。常用來制備轉基因動物，但不適用于需要大量轉染細胞的研究。 ③基因槍法 依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內(nèi)，適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞。 病毒感染法 病毒顆粒是一類非常有效的基因釋放系統(tǒng)，是將外源基因導入大量細胞的最有效的方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源的細胞及操作簡單等優(yōu)點。但多數(shù)病毒有其潛在的危險性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗和良好的設施。 逆轉錄病毒接介導技術 特點：可以大量感染細胞，單拷貝整合，高轉化頻率 步驟：構建病毒載體，將外源基因替換病毒的與致病或致癌有關的基因，使該病毒成為缺陷病毒；選擇和培養(yǎng)組裝細胞系，該細胞含有所需的輔助病毒，重組病毒載體在該細胞中能組裝成重組病毒；用此重組病毒載體感染靶細胞，使靶細胞轉化，并表達外源基因。39雜交細胞的染色體丟失現(xiàn)象。當兩種動物細胞如人和小鼠的細胞融合為一個雜交細胞以后，在最初幾代都可以完整地保留兩種親代的染色體，沒有染色體丟失的現(xiàn)象。但是，在隨后的增殖中，人類的染色體會丟失，最后只剩下少數(shù)幾條或1條人類的染色體的雜交細胞。染色體的丟失是隨機的，所以可獲得各種不同的含有少數(shù)人類染色體的細胞克隆。種間雜種細胞所顯示的優(yōu)先排除一個物種染色體核保留另一種物種染色體的現(xiàn)象叫染色體分離。染色體丟失的快慢與親本細胞種間的遺傳距離有關。較近的距離，染色體丟失的速度很慢；較遠的距離，染色體的丟失很快。雜交時，多數(shù)細胞是不會發(fā)生染色體丟失的。40HAT選擇系統(tǒng)的原理。親本細胞由于酶的缺陷不能利用培養(yǎng)基中的核酸原料來合成核酸而死亡，雜種細胞能通過互相補償這些缺陷而繼續(xù)生長繁殖。細胞1：含有TK酶，但缺乏HGPRT酶，即TK+/HGPRT-細胞2：含有HGPRT酶，缺乏TK酶，即TK-/HGPRT+正常培養(yǎng)時：這兩種細胞雖然不能通過補充途徑合成DNA，但均能生長，因為他們可以通過主要途徑來合成DNA.HAT培養(yǎng)基中含有氨基喋呤（阻止主要途徑——抗核酸合成藥物），次黃嘌呤，胸腺嘧啶核苷，當這兩種細胞融合后，放在HAT中培養(yǎng)。親本細胞由于核酸合成的主要途徑被抗核酸合成藥物——氨基喋呤所阻斷，補充途徑因自身TK或HGPRT缺陷，不能合成DNA，所以兩個親本細胞1和2均會死亡。而雜種細胞利用細胞1的TK，細胞2的HGPRT，通過補充途徑生存下來。TK：胸苷激酶HGPRT：次黃嘌呤鳥嘌呤核酸轉移酶。HAT選擇培養(yǎng)系統(tǒng)利用了細胞的酶的互補性，親本必須是TK-或HGPRT-氨基喋呤阻斷核苷酸補充：核酸的合成途徑氨基喋呤阻斷核苷酸多種酶作用DNA主要途徑：氨基酸，糖多種酶作用DNATK和HGPRTTK和HGPRT核苷酸補充途徑：核苷，次黃嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷41PEG的特性及其誘導細胞融合的機制。特性：親水性，有毒性機制：PEG因其親水性可能與鄰近細胞膜的大分子結合，使細胞之間只有幾個埃的空間的水分被取代，由此降低細胞表面的極性，導致脂質雙分子層不穩(wěn)定，引起膜的融合。42細胞電融合的特點及其誘導細胞融合的機制。特點：融合效率高，不存在殘留毒性，操作簡便，重復性好，操作過程可控，需要昂貴的細胞融合儀機制：1）細胞在電場中呈串排列，細胞位于電融室合適的溶液之中，該溶液是一種電介質，對融合施加正弦交變電場，由于在融合之間形成均勻的電場，這使細胞在電場中沿電力線呈串排列。2）細胞膜局部區(qū)域的雙分子層結構發(fā)生紊亂，緊密地呈串排列的細胞在高頻電脈沖作用下，導致細胞膜局部區(qū)域紊亂，出現(xiàn)了許多小孔。3）細胞膜的通透性增強，橋膜形成。相鄰細胞緊密接觸的部位的微孔形成物質交流的橋膜，繼而發(fā)生細胞的融合。43細胞融合技術的應用。1.細胞融合技術可以用于基因定位。由于種間的細胞雜交其中一個物種細胞染色體丟失，利用基因丟失導致細胞表型的變化，也可以確定基因在哪一條染色體上。2.細胞融化技術可以用于制備單克隆抗體。經(jīng)過B細胞和骨髓瘤細胞的融合，可以產(chǎn)生單克隆抗體，B細胞可以產(chǎn)生基因組合，以致產(chǎn)生多類抗體，故需要用多種方法選擇雜交瘤細胞。3制作克隆動物，轉基因動物44單克隆抗體技術。a.定義及基本原理單克隆抗體技術:將產(chǎn)生單一特異性抗體的B淋巴細胞同小鼠骨髓瘤細胞融合在一起,培養(yǎng)成既能產(chǎn)生單一抗體,又能在體外快速生長的雜交瘤細胞.此種雜交瘤細胞群持續(xù)分泌成分單一的有特異性的抗體,即單克隆抗體.b.過程(參考筆記P41的圖,太復雜沒畫)（1）免疫動物（2）融合細胞的制備（3）兩種細胞雜交融合（4）分裝培養(yǎng)（5）抗體檢測（6）雜交瘤細胞的克隆c.應用（1）臨床診斷及治療（2）免疫學研究（3）大分子蛋白的提純45小鼠作實驗材料的優(yōu)點。1.小鼠的遺傳比較深入，可供使用的純系較多，如昆明白鼠、C57、裸鼠。2.一次超排卵處理，可以獲取許多卵子（30-50枚）3.卵子和胚胎培養(yǎng)體系成熟。4.小鼠體型小，容易飼養(yǎng)，成本低。5.小鼠是小型的哺乳動物，可以作為大量動物和人類的模型。世代間隔短。小鼠基因組測序基本完成，易于遺傳工程操作。46通過超排卵途徑獲取小鼠卵的技術方法。1.注射性激素誘導排卵，促進卵子發(fā)育和成熟a.PMSG（孕馬血清促性腺激素）腹腔注射5-10U；2.促進成熟卵泡的排卵b.35-48小時以后，再注射5-10UHCG（人絨毛膜促性腺激素）；3.雌雄小鼠交配，使其受精，以獲取正常胚胎；4.人工收集小鼠胚胎。47液體石蠟油下培養(yǎng)小滴的優(yōu)點。a.防止培養(yǎng)基蒸發(fā)b.防止空氣中雜物混入c.便于觀察（透明）48試管嬰兒技術的核心技術，該技術應用的意義。①試管嬰兒技術的核心技術是：IVF-ET，體外受精加上胚胎移植。其中體外受精也叫試管內(nèi)受精（invitrofertilization）;胚胎移植（embryotransfer）。②產(chǎn)生過程：體外受精產(chǎn)生受精卵或早期胚胎（invitrofertilization）受精卵或早期胚胎移到代孕母體子宮內(nèi)，讓其繼續(xù)發(fā)育，直到出生（Embryotransfer）③意義與作用：為不育者帶來了福音，幾萬名試管嬰兒已經(jīng)誕生。加速動物遺傳育種。有利于瀕危動物保護研究受精機理產(chǎn)生大量動物個體遺傳檢查：利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測形態(tài)不正常精子其染色體是否正常49嵌合體小鼠及其制作技術。①將一不同品系小鼠的胚胎干細胞（ES細胞）注入另一品系的胚胎囊胚腔內(nèi)，它可嵌入囊胚內(nèi)細胞團中，并參與胚胎發(fā)育，由此可產(chǎn)生嵌合體小鼠。②制作技術：雌雄小鼠自然交配（供體）另一品系雌雄小鼠自然交配（受體）收集胚胎，收集胚胎，液體石蠟油下培養(yǎng)液體石蠟油下培養(yǎng)獲得胚胎干細胞發(fā)育到囊胚階段利用顯微注射技術將ES細胞注入到囊胚中將聚合成功的胚胎移植到一代孕母親子宮內(nèi)嵌合體小鼠出生后從皮毛顏色或其他方面進行分析、鑒定。50精子體外獲能，影響精子體外獲能的因素。包括：雌性生殖道自然獲能，體外人工獲能有能力到達卵細胞并穿過透明帶有能力進行頂體反應成熟過程中獲得的結合蛋白結合位點適時暴露給卵細胞以結合透明帶可與卵細胞融合并進入卵質中方法：添加誘導精子獲能的有效成分，提供適宜環(huán)境影響因素：溫度：對精子膜脂的物理狀態(tài)有影響物種：某些物種的精子只需在基本的平衡鹽溶液即可，加上適當?shù)哪茉春偷鞍踪|另一些物種的精子則需要添加特殊成分，即牛黃酸氨基乙黃酸或亞牛黃酸（氨乙基亞牛黃酸）。不同物種中，獲能所需時間也不同，這與質膜穩(wěn)定性有關，小鼠、貓、人類大約為1個小時，豬為3.5小時。精子的收集部位：附睪尾部精子具有較高的受精能力。培養(yǎng)基的組成：正常離子強度，正常的滲透壓，290mosm’,對家兔和?？赡苄枰^高的鹽濃度，如180mmol/LNaCl。Ca2+，獲能必須成分，細胞內(nèi)外流對獲能十分重要，它可以引起頂體反應，并激活頂體酶。肝素促進Ca2+的吸收，從而誘發(fā)頂體反應。牛血清白蛋白（BSA）可改變精子膜通透性，促進精子獲能。51顯微受精的概念，技術種類，及其意義。①概念：借助于顯微鏡操作儀將精子或生精細胞直接注入到卵母細胞質內(nèi)（ICSI）或卵間隙，即透明帶下，實現(xiàn)受精的過程。②意義：（1）揭示了動物雌雄配子相互作用的機制即受精的本質。（2）可以提高優(yōu)良種畜利用率，加速動物育種進程。（3）可以用來拯救和保護瀕危動物。（4）可以治療男性不育。52轉基因，轉基因動物的概念。①轉基因是用現(xiàn)代分子生物學的方法將某一基因轉到某一載體或其他基因的特定位置的過程。②轉基因動物是一種遺傳工程化動物，在其基因組中整合了一個或多個拷貝的外源基因，或者變異基因，這使該動物具有新的遺傳特性和表現(xiàn)型。53產(chǎn)生轉基因動物幾種技術。(1)基因顯微注射技術①基因顯微注射技術:即用顯微注射的方法將外源目的基因導入受精卵.②基本步驟:(2)胚胎干細胞技術①胚胎干細胞(ES):是從早期胚胎內(nèi)細胞團(ICM)分離出來的,能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能細胞.②胚胎干細胞技術:就是對ES細胞進行基因操作,將外源目的基因導入ES細胞,把ES細胞移入胚泡期的胚胎,再把這樣的胚胎移植到假孕的代孕子宮內(nèi),這樣產(chǎn)生的子代其部分生殖細胞就是由轉基因的ES細胞形成.然后在得到的轉基因鼠間進行雜交,子代再配對雜交,就獲得了純合的轉基因動物.(3)基因定位導入技術基因定位導入技術:基于外源DNA合內(nèi)源基因在核苷酸序列上的一致性,他們可以相互通過堿基配對,并發(fā)生交換,產(chǎn)生重組的DNA.通過同源配對穩(wěn)定的整合到預定的內(nèi)源基因位點上,在預期的位點上改變成設計的外源基因,從而改變細胞的特異基因,使其特異地表達,從而產(chǎn)生轉基因動物.(4)精子載體法精子載體法:即讓基因在獲能過程中獲取外源DNA,通過體外受精,胚胎移植等途徑,可以實現(xiàn)轉基因的目的.（5）逆轉錄病毒技術：用逆轉錄病毒感染供體卵細胞的8細胞胚54顯微注射技術產(chǎn)生轉基因動物技術的基本過程，遺傳特性。構建外源基因結構,具有啟動子等表達調(diào)控元件,可以調(diào)控表達.制備受精卵.借助顯微操作系統(tǒng),把外源基因注入到受精卵雄性原核中.胚胎移植.轉基因的整合和表達分析.遺傳特性：①轉基因隨機整合到基因組的某位點.②大多數(shù)呈頭尾相連,串聯(lián)多拷貝整合.③轉基因動物當代是一個半合子.④轉基因按孟德爾方式遺傳.轉基因是顯形或加性的.55對顯微注射技術的認識。顯微注射法是利用管尖極細的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。這種顯微注射術的程序，需有相當精密的顯微操作設備，制造長管尖時，需用微量吸管拉長器，注射時需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內(nèi)。此法已成功運用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉殖動物。 顯微注射技術用于轉基因動物的基本步驟：構建外源基因結構，具有啟動子等表達調(diào)控元件，可調(diào)控表達；制備受精卵，1-細胞期（可見原核）；借助顯微操作技術，把外源基因注入到受精卵，雄原核中；胚胎移植；轉基因的整合、遺傳和表達分析（PCR、GFP等）顯微注射技術產(chǎn)生的轉基因動物的遺傳特性：轉基因隨機整合到基因組的某位點；大多數(shù)是頭尾相連，串聯(lián)多拷貝整合；轉基因動物當代是一個半合子轉基因按孟德爾方式遺傳轉基因是顯性或加性物56胚胎干細胞的獲得途徑，特性。(1)獲得途徑①直接由動物體中獲取囊配在分離ICM.但由于得到的囊胚數(shù)量比較少,質量不高,因此會影響分離ESC的效率.②由卵細胞去核培養(yǎng),轉入體細胞核,體外培養(yǎng)得到去透明帶的囊胚,由這些囊胚進一步分離得到ESC.(2)特性①體積小,但核比較大,有一個或幾個核仁.②細胞中多為常染色質,胞質結構簡單,散布著許多核糖體和線粒體.③在體外分化抑制培養(yǎng)基中呈克隆狀生長,細胞緊密結合在一起.④增值迅速,18-24小時分裂一次.⑤可在體外進行選擇,操作,凍存.⑥具有高度分化的潛能.⑦AKP(堿性磷酸酶)可作為鑒定ESC或ESC分化與否的標志之一.ssEA也可作為ESC的鑒定標志.57利用干細胞設計一項細胞工程方案。1．揭示人及動物的發(fā)育機制及影響因素

生命最大的奧秘便是人是如何從一個細胞發(fā)展為復雜得不可思議的生物體的。人胚胎細胞系的建立及人胚胎干細胞研究，可以幫助我們理解人類發(fā)育過程中的復雜事件，使人深刻認識數(shù)十年來困擾著胚胎學家的一些基本問題，促進對人胚胎發(fā)育細節(jié)的基礎研究。人胚胎干細胞的體外可操作性，可以一種倫理上可接受的方式，提供在細胞和分子水平上研究人體發(fā)育過程中極早期事件的方法。這種研究不會引起與胎兒實驗相關聯(lián)的倫理問題，因為僅靠自身胚胎干細胞是無法形成胚胎的。

2.藥學研究方面

胚胎干細胞系可分化為多種細胞類型，又是能在培養(yǎng)基中不斷自我更新的細胞來源。它發(fā)展為胚體后的生物系統(tǒng)，可模擬體內(nèi)細胞與組織間復雜的相互作用，這在藥物研究領域具有廣泛的用途。胚胎干細胞有望在短期內(nèi)就能體現(xiàn)的優(yōu)勢在于藥物篩選中。目前用于藥物篩選的細胞都來源于動物或癌細胞這樣非正常的人體細胞，而胚胎干細胞可以經(jīng)體外定向誘導，為人類提供各種組織類型的人體細胞，這使得更多類型的細胞實驗成為可能。雖不會完全取代在整個動物和人體上的實驗，但會使藥品研制的過程更為有效。當細胞系實驗表明藥品是安全的且效果良好，才有資格在實驗室進行動物和人體的進一步實驗。

在候選藥物對各種細胞的藥理作用和毒性試驗中，胚胎干細胞提供了對新藥的藥理、藥效、毒理及藥代等研究的細胞水平的研究手段，大大減少了藥物檢測所需動物的數(shù)量，降低了成本。另外，由于胚胎干細胞類似于早期胚胎的細胞，它們有可能用來揭示哪些藥物干擾胎兒發(fā)育和引起出生缺陷。人胚胎干細胞還可以用于其它用途。由于這類細胞本質上可以無限量地產(chǎn)生人體細胞，它們對于旨在發(fā)現(xiàn)稀有人蛋白的研究計劃理應有用。國際上許多制藥公司、學者都瞄準了這一重要的研究領域。

3.細胞替代治療和基因治療的載體

胚胎干細胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細胞，用于“細胞療法”，為細胞移植提供無免疫原性的材料。任何涉及喪失正常細胞的疾病，都可以通過移植由胚胎干細胞分化而來的特異組織細胞來治療。如用神經(jīng)細胞治療神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病等)，用胰島細胞治療糖尿病，用心肌細胞修復壞死的心肌等。

胚胎干細胞還是基因治療最理想的靶細胞。這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細胞直接移植或輸入病人體內(nèi)，達到控制和治愈疾病的目的。這種遺傳改造包括糾正病人體內(nèi)存在的基因突變，或使所需基因信息傳遞到某些特定類型細胞。

當然，干細胞技術的最理想階段是希望在體外進行“器官克隆”以供病人移植。如果這一設想能夠實現(xiàn)，將是人類醫(yī)學中一項劃時代的成就，它將使器官培養(yǎng)工業(yè)化，解決供體器官來源不足的問題；使器官供應專一化，提供病人特異性器官。人體中的任何器官和組織一旦出現(xiàn)問題，可像更換損壞的零件一樣隨意更換和修理。58基因打靶（同源重組，genetargeting)的原理。基因定位導入技術:基于外源DNA合內(nèi)源基因在核苷酸序列上的一致性,他們可以相互通過堿基配對,并發(fā)生交換,產(chǎn)生重組的DNA.通過同源配對穩(wěn)定的整合到預定的內(nèi)源基因位點上,在預期的位點上改變成設計的外源基因,從而改變細胞的特異基因,使其特異地表達,從而產(chǎn)生轉基因動物.59利用胚胎干細胞定位導入技術，制作轉基因動物的技術路線，特點。①技術路線：胚胎干細胞系的建立與維持將外源目的基因導入胚胎干細胞同源重組的篩選,篩選出轉染過的胚胎干細胞。（其中，2、3步運用基因定位導入技術：a.設計合適的外源載體基因，b.利用正負選擇的方法定位篩選出目的基因.Neor基因為正向選擇，Tk基因為負向選擇。）把胚胎干細胞移入胚泡期的胚胎。再把以上胚胎移植到假孕的代孕子宮內(nèi)。產(chǎn)生嵌合體小鼠。嵌合體小鼠間雜交，篩選，得到具外源基因表象的子代雜合體小鼠。子代雜合體小鼠間雜交，得到純合的轉基因動物。②特點：1.可以定點導入外源基因到確定位置，而不是隨機整合。2.可以任意讓某一基因突變，使其失去活性。60轉基因動物的應用，特別是該技術在基因功能分析上的應用。1.促進基礎生命科學研究?？梢酝ㄟ^轉基因動物技術，在體內(nèi)研究基因的功能。2.促進醫(yī)學研究建立人類疾病模型。3.器官來源解決器官短缺的有效方法。4.動物遺傳性質的改良。轉基因觀賞動物，轉基因生物反應器等61轉基因動物與生物反應器。①轉基因動物:是一種遺傳工程化動物，在起基因組中整合了一個或多個拷貝的外源基因或突變的內(nèi)源基因，這使該動物具有新的遺傳特性和表現(xiàn)型。②生物反應器：以產(chǎn)生商品蛋白為目標，直接將target-gene導入動物體內(nèi)，使其在動物體內(nèi)穩(wěn)定的表達.62對轉基因動物食品的安全認識。1.正確客觀對待2.不