微生物細(xì)胞的破碎

關(guān)于微生物細(xì)胞的破碎第一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物代謝產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物大多數(shù)小分子代謝物細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶霉菌產(chǎn)生的糖化酶大多數(shù)酶蛋白類脂部分抗生素第二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日分離提取胞內(nèi)產(chǎn)物時(shí)，首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步分離、純化，因此細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵步驟。第四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞破碎是指選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來(lái)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)的方法。細(xì)胞壁的破碎最為關(guān)鍵，這是因?yàn)椋?）細(xì)胞壁是具有一定剛性和堅(jiān)韌的物質(zhì)，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。2）細(xì)胞壁具有抗機(jī)械撞擊的作用。第五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.1細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成細(xì)胞壁的化學(xué)組成是非常復(fù)雜的，它不僅取決于微生物的類型，而且還取決于細(xì)胞的年齡和生長(zhǎng)生理學(xué)。第六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1．細(xì)菌細(xì)菌的細(xì)胞壁經(jīng)酸性水解后，可得到如下產(chǎn)物：(1)肽聚糖肽聚糖是細(xì)胞的主要成分，由下列化學(xué)物質(zhì)組成：①N-乙酰葡萄糖胺（NAG）；②N-乙酰胞壁酸（NAM）；③半乳糖胺(僅在某些細(xì)菌中)。(2)氨基酸(3)磷壁質(zhì)僅在革蘭氏陽(yáng)性菌中存在。(4)糖(5)脂質(zhì)脂質(zhì)主要存在于革蘭氏陰性菌中。第七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖，在壁中呈厚度為20～80nm的均相層。第八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁較薄(10～25nm)，但更加復(fù)雜，包括細(xì)胞質(zhì)膜在內(nèi)共有三層：一個(gè)剛性的肽聚糖內(nèi)層和一個(gè)雙層(中間是脂蛋白，外層是脂多糖)。第九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2．真菌和酵母酵母和真菌的細(xì)胞壁，在電子顯微鏡下觀察呈纖絲狀，約60nm厚，細(xì)胞壁的厚度取決于生長(zhǎng)條件特別是碳源的類別。第十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞壁水解后的產(chǎn)物：①糖及其氨基衍生物(主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖胺)葡聚糖是酵母細(xì)胞壁的主要成分(約30％)；甘露糖(約30％)也是重要的成分；幾丁質(zhì)雖然量較少(約1％～2％)，但是幾乎在所有的酵母細(xì)胞中都存在。②氨基酸主要是谷氨酸和天門(mén)冬氨酸，存在于蛋白質(zhì)中，占細(xì)胞壁成分的5％～7％。③脂質(zhì)占細(xì)胞壁成分的1％～13.5％，其含量取決于菌種類型、培養(yǎng)基組成及其他一些因素。第十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日第十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.2細(xì)胞破碎的方法破碎細(xì)胞的方法很多，但選擇何種方法則取決于破碎的目的和待破碎生物體的類型。第十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

依據(jù)細(xì)胞的破碎是否外加作用力可分為機(jī)械法與非機(jī)械法兩大類：第十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日機(jī)械法中高壓勻漿器和珠磨機(jī)不僅在實(shí)驗(yàn)室而且在工業(yè)上得到應(yīng)用，超聲波法和非機(jī)械法大多處在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用階段。激光破碎法高速相向流撞擊法冷凍-噴射法新的破碎方法第十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.2.1機(jī)械方法為了破碎微生物細(xì)胞，常常選擇機(jī)械的方法，因?yàn)樗鼈兊奶幚砹看?，破碎速度較快。采用機(jī)械方法，在大多數(shù)情況下要采取冷卻措施，以便除去由于消耗機(jī)械能而產(chǎn)生的過(guò)多熱量，防止生化物質(zhì)破壞。第十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日一．固體剪切方法(珠磨法Beadmill)將細(xì)胞在珠磨機(jī)中破碎被認(rèn)為是最有效的一種細(xì)胞物理破碎法。第十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。珠磨機(jī)的工作原理第十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日破碎作用符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，破碎的程度常用細(xì)胞破碎率(％)來(lái)表示：對(duì)于間歇操作：ln[1/(1-R)]=Kt（3-1）對(duì)于連續(xù)操作：1n[1/(1-R)]=Kτ（3-2）其中τ=V/qv式中R-破碎率(％)；K-反應(yīng)速率常數(shù)(1/s)；

t-破碎時(shí)間(s)；τ-平均停留時(shí)間(s)；

V-破碎室懸浮液體積(L)；qv-進(jìn)料速率(L/s)。第十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如珠體直徑、珠體的裝量、細(xì)胞濃度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型、操作溫度等等。這些參數(shù)不僅影響破碎程度，也影響破碎所需的能量。第二十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日影響破碎率的因素：珠體的大小珠體的裝量攪拌轉(zhuǎn)速操作溫度延長(zhǎng)研磨時(shí)間、增加珠體裝量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和操作溫度等可有效提高細(xì)胞破碎率，但能耗將大大增加。第二十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日二．高壓勻漿法

(High-pressurehomogenization)高壓勻漿法是大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，所用設(shè)備是高壓勻漿器，它由高壓泵和勻漿閥組成。第二十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日在高壓勻漿器中，高壓室的壓力高達(dá)幾十個(gè)MPa，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度可達(dá)幾百米。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。高壓勻漿法的原理是利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破裂。第二十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的或高濃度的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。第二十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日破碎的動(dòng)力學(xué)方程可表示為：

1n[1/(1-R)]=Ktnpα(3-3)式中R-細(xì)胞破碎率；

Kt-與溫度等有關(guān)的破碎常數(shù)；

n-懸浮液通過(guò)勻漿器的次數(shù)；

p-操作壓力；

α-與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。第二十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日由破碎的動(dòng)力學(xué)方程可知，影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過(guò)勻漿器的次數(shù)。一般說(shuō)來(lái)，增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎率，但當(dāng)壓力增大到一定程度后對(duì)勻漿器的磨損較大。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55~70MPa。第二十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁，不同種類的微生物細(xì)胞及同種細(xì)胞在不同的環(huán)境下，其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同。一般說(shuō)來(lái)，酵母菌較細(xì)菌難破碎，處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。第二十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日不宜采用高壓勻漿法破碎的微生物細(xì)胞易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌含有包涵體的基因工程菌（包涵體質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）第二十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日高壓勻漿法與珠磨法的比較1）高壓勻漿法操作參數(shù)少，易于確定，適合于大規(guī)模操作；珠磨法操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)。珠磨機(jī)連續(xù)操作時(shí)兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性，而高壓勻漿需配備換熱器進(jìn)行級(jí)間冷卻；第二十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日高壓勻漿法與珠磨法的比較2）珠磨法破碎在適當(dāng)條件下一次操作即可達(dá)到較高的破碎率，而高壓勻漿往往需循環(huán)2～4次才行；3）珠磨機(jī)適合于各種微生物細(xì)胞的破碎，而高壓勻漿不適合于絲狀真菌及含有包涵體的基因工程菌。第三十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日三．超聲破碎法(Ultrasonication)超聲破碎也是應(yīng)用較多的一種細(xì)胞破碎法，通常采用的超聲破碎機(jī)的工作頻率為15~25kHz。第三十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日超聲破碎機(jī)理---超聲波引起空穴現(xiàn)象在相當(dāng)高的輸入聲能下，液體各個(gè)成核部位會(huì)形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會(huì)增大，而在壓縮相中氣泡會(huì)被壓縮，直到不能再壓縮時(shí)，氣泡破裂，釋放出猛烈的震波。于是，大量聲能被轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。第三十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日在用于細(xì)胞破碎的容器中，流體動(dòng)力學(xué)按照完全混合方式，則蛋白質(zhì)釋放動(dòng)力學(xué)遵循一級(jí)反應(yīng)定律：

1–x=exp（-kt）(3-4)式中x為釋放蛋白質(zhì)的分率；

k為蛋白質(zhì)釋放常數(shù)，min-1；

t為超聲波發(fā)射時(shí)間，min。第三十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。對(duì)不同菌種的發(fā)酵液，超聲破碎的效果差別較大。一般地，桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞較易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。第三十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日采用超聲破碎法處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少，因而在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較為普遍。超聲破碎法的優(yōu)點(diǎn)第三十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在細(xì)胞懸浮液中加入冰塊或在夾套中通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。但在大規(guī)模操作中，聲能傳遞和散熱均比較困難。此外，超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活，因而有一定的局限性。超聲破碎法的缺點(diǎn)第三十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日四．X-press法X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，具有適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但該法不適用于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。第三十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.2.2非機(jī)械法許多非機(jī)械方法都適用于微生物細(xì)胞的破碎，包括酶解、滲透壓沖擊、凍結(jié)和融化、熱處理、化學(xué)法溶胞等，其中有些方法的應(yīng)用是有限制的。第三十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日一．酶溶法(Enzymaticlysis)酶溶法是利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的。酶溶法可分為外加酶法和自溶法兩種。第三十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1．外加酶法常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等，而細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物。第四十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。實(shí)例：

對(duì)酵母細(xì)胞采用酶溶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)物質(zhì)。

第四十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日外加酶法主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，如利用酶溶法可從細(xì)胞內(nèi)不同位置選擇性地釋放目的產(chǎn)物和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等。此外，酶溶法大量用來(lái)剝離細(xì)胞壁，將原生質(zhì)體進(jìn)行融合，這是細(xì)胞工程常用的方法。第四十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)第四十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1）溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用；2）酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件；3）產(chǎn)物抑制的存在，在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，這是導(dǎo)致酶溶法胞內(nèi)物質(zhì)釋放低的一個(gè)重要因素。酶溶法的不足第四十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2．自溶法自溶法是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的?？刂埔欢l件，可以誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。第四十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH、激活劑等。微生物細(xì)胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。實(shí)例：

對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pHl0的緩沖液，再配3％的細(xì)胞懸浮液，加熱至70℃，保溫?cái)嚢?0min，菌體即自溶。

第四十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1）對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性；2）自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速率下降。自溶法的缺點(diǎn)第四十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日二．化學(xué)滲透法(Chemicalpermeation)某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性(滲透性)，從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)，這種處理方式稱為化學(xué)滲透法。第四十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1.

表面活性物質(zhì)表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。TritonX-100是一種非離子型表面活性劑，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。第四十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2.EDTA螯合劑EDTA螯合劑對(duì)革蘭氏陰性菌細(xì)胞外層膜有破壞作用。革蘭氏陰性菌的外層膜結(jié)構(gòu)通常靠二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴，細(xì)胞通透性增強(qiáng)。第五十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.有機(jī)溶劑能分解細(xì)胞壁中的類脂。把相當(dāng)于細(xì)胞量10％的甲苯加到細(xì)胞懸浮液中，由于甲苯被吸收進(jìn)細(xì)胞壁的類脂中，使胞壁膜溶脹，進(jìn)而使細(xì)胞破碎，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。除甲苯外，苯對(duì)類脂的分解作用也十分強(qiáng)，但由于較易揮發(fā)和較大的毒性而很少應(yīng)用。第五十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)各種試劑的不同作用機(jī)理，將幾種試劑合理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。第五十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)滲透法的優(yōu)點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。控制條件可以有選擇地釋放出位于細(xì)胞內(nèi)不同部位的產(chǎn)物。細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。第五十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50％。有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過(guò)程中，需設(shè)法分離除去?；瘜W(xué)滲透法的缺點(diǎn)第五十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日三．滲透壓法(Osmoticpressure)

滲透壓法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中，達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破碎。于是，細(xì)胞內(nèi)容物就釋放出來(lái)。第五十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑(如抗生素等)，使細(xì)胞壁有缺陷滲透壓法適用范圍第五十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日四．反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。第五十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日反復(fù)凍結(jié)-融化法只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復(fù)多次。此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。第五十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日五．干燥法常用的使細(xì)胞干燥的方法有：氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過(guò)干燥使細(xì)胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就被抽提出來(lái)。第五十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25~30℃下的氣流中吹干，然后用緩沖液抽提。

真空干燥多用于細(xì)菌。

冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后的菌體在冷凍條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。第六十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)變性。提取不穩(wěn)定生化物質(zhì)時(shí)，常加某些試劑進(jìn)行保護(hù)，如半胱氨酸、巰基乙醇和亞硫酸鈉等還原劑。第六十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日第六十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日若提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，需用機(jī)械破碎法；若在細(xì)胞膜附近則可用較溫和的非機(jī)械法；若提取的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或壁相結(jié)合時(shí)，可采用機(jī)械法和化學(xué)法相結(jié)合的方法，以促進(jìn)產(chǎn)物溶解度的提高或緩和操作條件，但保持產(chǎn)物的釋放率不變。選擇破碎方法的一般原則第六十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞破碎方法的研究方向①多種破碎方法相結(jié)合；②與下游過(guò)程相結(jié)合，必須從后分離過(guò)程的整體來(lái)考慮破碎操作，即破碎過(guò)程要易于細(xì)胞碎片的除凈；③與上游過(guò)程相結(jié)合，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程及其環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及破碎難易有很大影響。第六十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.3破碎率的評(píng)價(jià)

破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

Y(％)＝[(N0-N)/N0]×100

N0：原始細(xì)胞數(shù)量

N：經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來(lái)的未損害完整細(xì)胞數(shù)量。第六十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

直接計(jì)數(shù)法直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以通過(guò)平板計(jì)數(shù)技術(shù)或在血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)最終染色細(xì)胞的計(jì)數(shù)。第六十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日(2)間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量(可溶性蛋白、酶等)。破碎率可通過(guò)被釋放出來(lái)化合物的量R與所有細(xì)胞的理論最大釋放量Rm之比進(jìn)行計(jì)算。間接計(jì)數(shù)法最常用的細(xì)胞內(nèi)含物是蛋白質(zhì)，特別是酶活性釋放到基質(zhì)中，是破碎程度很好的指示參數(shù)。第六十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.4包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素-6、人γ-干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外，而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒(méi)有生物活性的固體顆?！w。第六十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日包涵體顆粒直徑約0.1～3.0μm，隨表達(dá)產(chǎn)物而異。較大的包涵體可在相差顯微鏡下觀察到，呈現(xiàn)深色的點(diǎn)，所以包涵體又稱光折射體。包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，