基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)的基本策略教材

1基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes分子生物學(xué)系22分子生物學(xué)的三大核心技術(shù)DNA序列分析—DNA測(cè)序，1977聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—DNA擴(kuò)增，1985DNA重組技術(shù)—基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子雜交三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)四、基因芯片和微陣列五、Western免疫印跡主要內(nèi)容4（一）雙脫氧末端終止法

(Sanger,1977)一、DNA序列分析（二）DNA自動(dòng)化序列分析（三）化學(xué)降解法(Gilbert,1977)5FrederickSanger1918～

WalterGilbert1932～

TheNobelPrizeinChemistry1980PaulBerg1926～6DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術(shù)，可分離差別僅1個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。

7(一）雙脫氧末端終止法

（dideoxychaintermination）8ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPAOHOHHHdATPddATPNTP:核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP的合稱；dNTP:脫氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP；ddNTP:ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP；9摻入N個(gè)核苷酸DNA合成反應(yīng)模式圖10DNA單鏈模板引物摻入ddNTP延伸的新合成鏈

末端終止111.雙脫氧末端終終止法原理DNA合成反應(yīng)中，，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能與下下一個(gè)核苷酸酸的5′-磷酸基團(tuán)形成3′，5′-磷酸二酯鍵，，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提提前終止于ddNTP。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT132.DNA測(cè)序主要步驟驟14A反應(yīng)管G反應(yīng)管G反應(yīng)管T反應(yīng)管C反應(yīng)管T反應(yīng)管1516GATC17●變性聚丙烯酰酰胺凝膠電泳泳●單鏈DNA模板的制備●DNA模板與測(cè)序引引物退火●摻入入法標(biāo)記反反應(yīng)●延伸伸-終止反應(yīng)●放射射自顯影●閱讀讀測(cè)序結(jié)果果測(cè)序步驟18（二）DNA測(cè)序自動(dòng)化化原理采用4種不同的熒熒光分別標(biāo)標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)產(chǎn)物，替代代放射性同同位素標(biāo)記記是實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序自動(dòng)化化的基礎(chǔ)。。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT2021表示一個(gè)SNP位點(diǎn)，該位位點(diǎn)出現(xiàn)了了雙峰，對(duì)對(duì)應(yīng)的核苷苷酸分別為為C和T,因此該位點(diǎn)點(diǎn)為CT雜合型，如如果該位點(diǎn)點(diǎn)只有一個(gè)個(gè)峰C或者T，則該位點(diǎn)點(diǎn)基因型為為CC或TT純合型22DNA自動(dòng)測(cè)序步步驟4種不同熒光光染料標(biāo)記記終止物ddNTPsSanger測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物同一泳道電泳分分離激光激發(fā)不不同大小DNA片段上的熒熒光分子，，發(fā)射出四四種不同波波長的熒光光熒光信號(hào)采采集、計(jì)算算機(jī)分析與與DNA自動(dòng)排序23DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries24

與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化學(xué)降解過程基礎(chǔ)上。

（三）化學(xué)降解法25

將待測(cè)DNA片段3′或5′端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA片段分成五個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種（類）堿基處斷裂。電泳分離5組DNA混合物，放射自顯影檢測(cè)末端標(biāo)記的DNA鏈的電泳區(qū)帶位置?；瘜W(xué)降解法原理26化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新測(cè)序技技術(shù)454技術(shù)(Roche)焦磷酸測(cè)序序（Pyrosequencing）Solexa測(cè)序技術(shù)(Illumina)SOLiD技術(shù)(ABI)連接法測(cè)序28舉例：Solexa測(cè)序HiSeq200029Solexa測(cè)序：在一個(gè)個(gè)反應(yīng)中同時(shí)時(shí)加入4種核苷的標(biāo)簽簽，采用邊合合成邊測(cè)序（（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人類基因因組草圖不同同測(cè)序儀的比比較圖30二、核酸分子雜交交（NucleicAcidHybridization）（一）Southern印跡雜交：檢檢測(cè)DNA(Southernblothybridization)SouthernEM,1975（二）Northern印跡雜交：檢檢測(cè)RNA(Northernblothybridization)StarkGR，197731核酸分子雜交交原理標(biāo)記的單鏈核酸探針針與待檢測(cè)的靶靶單鏈DNA或RNA局部互補(bǔ)結(jié)合合形成雜交雙雙鏈。應(yīng)用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與與定量分析。。323333印跡技術(shù)利用各種物理理方法使電泳泳膠中的生物物大分子轉(zhuǎn)移移到NC等各種膜上，，使之成為固固相化分子。。這一技術(shù)類似似于用吸墨紙紙吸收紙張上上的墨跡，因因此稱之為“blotting”,譯為印跡技術(shù)術(shù)。3434探針技術(shù)用放射性核素素、生物素或或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或或全鏈的已知知序列的多聚聚核苷酸鏈被被稱為“探針”。探針可以與固固定在NC膜上的核苷酸酸結(jié)合，判斷斷是否有同源源的核酸分子子存在。35Southern印跡雜交原理理將電泳分離的的待測(cè)DNA片段結(jié)合到一一定的固相支支持物上，然然后與存在于于液相中標(biāo)記記的核酸探針針進(jìn)行雜交的的過程。（一）Southern印跡雜交應(yīng)用：DNA（基因組DNA）分子的定性性或定量分析。361.制備基因組DNA2.用限制性內(nèi)切切核酸酶消化化基因組DNA3.瓊脂糖凝膠電電泳分離DNA酶切片段4.凝膠預(yù)處理（如強(qiáng)堿，DNA雙鏈變?yōu)閱捂滄湥?.Southern印跡轉(zhuǎn)移6.標(biāo)記核酸探針針、探針與DNA片段雜交7.雜交結(jié)果顯示示Southern印跡雜交基本本過程37Southern印跡雜交示意意圖38將電泳分離的的待測(cè)DNA片段結(jié)合到一一定的固相支支持物上，然然后與存在于于液相中標(biāo)記記的核酸探針針進(jìn)行雜交的的過程。3940地中海貧血的的Southernblot基因診斷（1）僅一條染色色體上的一個(gè)個(gè)α基因缺失或缺缺陷，則α鏈的合成部分分受抑制，稱稱為α+地貧；（2）每條染色體體上的2個(gè)α基因均缺失或或缺陷，稱為為α0地貧；(3)αα1、α2序列基本一致致；基因不同程程度的缺失可可引起不同類類型的地中海貧血。。α1α2αααα+α+α+αα0α+α0α0α041BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe地中海貧血的的直接基因診診斷42αα/ααααα/α-ααα/--αα-/-/--正常缺缺1缺2缺3缺414kb10kb43（二）Northern印跡雜交(Northernblothybridization)指將RNA變性及電泳分分離后，并轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到固相支支持物上，用用雜交反應(yīng)來來鑒定其中特特定mRNA分子的含量及及其大小。用于mRNA進(jìn)行定性和定定量分析。44RNA瓊脂糖凝膠電電泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S應(yīng)用舉例45GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot雜交分析析mRNA的表達(dá)靶mRNA3-磷酸甘油油醛脫氫氫酶4646三、其他他雜交技技術(shù)1.斑點(diǎn)雜交交(dotblothybridization）將RNA或DNA變性后直直接點(diǎn)樣樣于硝酸酸纖維素素膜或尼尼龍膜上上，用于于基因組組中特定定基因及及其表達(dá)達(dá)的定性性及定量量研究。。47472.原位雜交交

（insituhybridization）用標(biāo)記的的核酸探探針與組組織切片片或細(xì)胞胞中的待待測(cè)核酸酸互補(bǔ)序序列雜交交，可對(duì)對(duì)核酸進(jìn)進(jìn)行定性性、定位位和相對(duì)對(duì)定量分分析。483．核酸酶酶S1保護(hù)分析析法(nucleaseS1protectionassay）單鏈DNA探針與待測(cè)RNA形成DNA/RNA雜交雙鏈鏈，加入入核酸酶酶S1專一性地地降解未未形成雜雜交體的的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈鏈則受到到保護(hù)而而不被降降解。494．RNA酶保護(hù)分分析法（RNaseprotectionassay，RPA）50RPA基本程序：：●待測(cè)RNA的分離●體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)標(biāo)記RNA探針●待測(cè)RNA與探針RNA進(jìn)行液相雜雜交●RNA酶消化●不同大小雜雜交片段凝凝膠電泳分分離51三、聚合酶酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技術(shù)原理（二）耐熱熱DNA聚合酶（三）PCR引物及設(shè)計(jì)計(jì)原則（四）PCR條件的優(yōu)化化（五）PCR改進(jìn)技術(shù)（六）其它它PCR技術(shù)52聚合酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)(PCR):（一）PCR技術(shù)原理

Mullis

K.

1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。

TheNobelPrizeinChemistry199353ThereplicationofDNA54原理：PCR是模擬天然然DNA復(fù)制過程，，利用DNA聚合酶催化化一對(duì)引物物間特異DNA片段合成的的體外擴(kuò)增增技術(shù)。其其主要熱熱循環(huán)過程程為：變性性、退火、、延伸三個(gè)個(gè)步驟。551.PCR循環(huán)由三步步組成：①變性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高溫合適溫度合適溫度5657582.PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物物大小:介于兩條退退火引物5′末端之間的的雙鏈DNA片段。循環(huán)一59循環(huán)二60循環(huán)三61一對(duì)引物：：正向和反反向

限制制了PCR擴(kuò)增的片段段的范圍5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—625′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT3.引物設(shè)計(jì)計(jì)實(shí)例63Y=A（1+E）nY:擴(kuò)增產(chǎn)物物的量A:最初靶DNA分子數(shù)E:PCR擴(kuò)增效率率n:循環(huán)次數(shù)數(shù)3.PCR產(chǎn)量當(dāng)E＝100％,A=1時(shí)Y=2n>>2n(引物延伸產(chǎn)物物的量）64（二）平臺(tái)期期與平臺(tái)效應(yīng)應(yīng)1.平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：PCR經(jīng)過一定數(shù)量量的循環(huán)后，，DNA片段不再呈指指數(shù)累積，而而是進(jìn)入線性性增長期或靜靜止期，即平臺(tái)效應(yīng)。影響因素：①引物及及dNTP底物濃度降低低。②酶與模模板比例下降降。65PCR平臺(tái)效應(yīng)66（二）耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（實(shí)現(xiàn)了PCR自動(dòng)化）從嗜熱水生菌菌thermusaquaticsYT-1株中直接分離離出來。●95℃的半衰期:40min●最適溫度:72℃℃～80℃●催化反應(yīng)速率:150～300核苷酸/秒/酶分子6768TaqDNA聚合酶特性：：●5′→3′聚合酶活性；；●5′→3′外切酶活性；；●較弱的的非模板依賴賴性；●缺乏3′→5′外切酶活性。。69PCRthermalcycler70PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR產(chǎn)物71無機(jī)離子及抑抑制劑的影響響TaqDNA聚合酶的活性性對(duì)Mg2+濃度和單價(jià)離離子（K+或NH4+）的性質(zhì)和濃濃度較敏感。。最適Mg2+濃度：2mmol/LK+濃度：50mmol/L72幾種高保真的的耐熱DNA聚合酶1.TthDNA聚合合酶酶2.VentDNA聚合合酶酶3.PfuDNA聚合合酶酶73（三三））PCR引物物設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)原原則則引物物的的化化學(xué)學(xué)本本質(zhì)質(zhì)是是什什么么？？單鏈鏈寡寡核核苷苷酸酸DNA或RNA片段段。。DNA復(fù)制制引引物物：：?jiǎn)螁捂滄淩NA片段段PCR引物物：：?jiǎn)螁捂滄淒NA片段段74PCR引物物設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)原原則則：1.引物物與與模模板板的的序序列列要要完完全全互互補(bǔ)補(bǔ)2.引物物與與引引物物之之間間避避免免形形成成穩(wěn)穩(wěn)定定的的二二聚聚體體或或發(fā)發(fā)夾夾結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)3.引物不能在模模板的非目的的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)應(yīng)(錯(cuò)配)755′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特異擴(kuò)增增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′錯(cuò)誤引發(fā)發(fā)1.引物與模模板的序序列要緊緊密互補(bǔ)補(bǔ)2.引物不能能在模板板的非目目的位點(diǎn)點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)應(yīng)(錯(cuò)配)76引物之間間應(yīng)避免免3′端互補(bǔ)3.引物與引引物之間間避免形形成穩(wěn)定定的二聚聚體或發(fā)發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)77引物自身身不應(yīng)形形成發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)784.其它原則則:①引物長度度:10～30nt②堿基分布布:A、T、G、C隨機(jī)分布布③G+C含量：40～60%Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物3′末端堿基基：最好選選T、C、G，不選A避免出現(xiàn)現(xiàn)3個(gè)以上的的連續(xù)堿堿基，如如GGG或CCC⑤引物5′末端堿基基可不與與模板DNA互補(bǔ)791A260oligoDNA≈33μgN:引物堿基數(shù)X：合成的的oligoDNAA260單位Y：引物物的pmol數(shù)106Y（pmol）=X·33××───330.NX=───××105N2.引物用用量計(jì)計(jì)算80模板引物TaqDNA聚合酶酶dNTPMg2+退火變性延伸PCR反應(yīng)81（四））PCR條件的的優(yōu)化化1.TaqDNA聚合酶酶濃度度：1.0～2.5U/100μμl反應(yīng)液液2.dNTP濃度：：20～200μμmol/L3.Mg2+濃度：：0.5～2.5mmol/L4.引物濃濃度：：0.1～0.5μμmol/L82（五））PCR改進(jìn)技技術(shù)1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA為模板板逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄合合成cDNA，再以以此cDNA為模板板進(jìn)行行PCR反應(yīng)。83RT-PCR原理84逆轉(zhuǎn)錄錄酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性性最適適溫度度42℃℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最最適溫溫度37℃℃852.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量量RT-PCR以樣本本mRNA為模板板逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄合合成cDNA，在不不同引引物對(duì)對(duì)引導(dǎo)導(dǎo)下共共同PCR擴(kuò)增“看家家”基基因和目的基因cDNA。86①選擇內(nèi)對(duì)照照基因組織中普遍遍表達(dá)、表表達(dá)量比較較恒定的““看家”基基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。②半定量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)計(jì)算PCR產(chǎn)物：靶cDNA/GAPDHcDNA87③KPNA2在正常生生理狀態(tài)東東方田鼠和和小鼠體內(nèi)內(nèi)表達(dá)分析析88893.實(shí)時(shí)熒光定定量RT-PCR

Real-timefluorescentquantitative–PCR，F(xiàn)Q-PCRPCR擴(kuò)增指數(shù)期期內(nèi)極小的的擴(kuò)增效率率改變會(huì)極極大地影響響產(chǎn)量。應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分分析。90①熒光染料9192每形成一個(gè)個(gè)DNA雙鏈，就有有一定數(shù)量量的染料結(jié)結(jié)合上去，，染料一結(jié)結(jié)合就產(chǎn)生生熒光信號(hào)號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與與DNA分子總數(shù)目目成正比。93②TaqManProbe一種水解式式熒光標(biāo)記記探針。寡寡核苷酸探探針的5′端標(biāo)記一個(gè)個(gè)熒光報(bào)告告基團(tuán)（reporter），3′端標(biāo)記一個(gè)個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（quencher）。94每產(chǎn)生一條條DNA鏈，就切斷斷一條探針針，每切斷斷一條探針針，就產(chǎn)生生一個(gè)單位位信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與與結(jié)合探針針的DNA分子數(shù)成正正比。95。③分子信標(biāo)探探針（MolecularBeaconProbe）該探針具有有發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)，5′端標(biāo)記熒光光報(bào)告基團(tuán)團(tuán)，3′端標(biāo)記淬滅滅基團(tuán)。96探針與靶序序列雜交結(jié)結(jié)合，報(bào)告告熒光染料料與淬滅染染料分離，，發(fā)出熒光光。97④實(shí)時(shí)熒光光定量PCR計(jì)算原理PCR擴(kuò)增效率的的差異使相相同的樣品品最終產(chǎn)量量有很大差差異9899CT或Tc或Ct值：臨界點(diǎn)循環(huán)環(huán)（Thresholdcycle），即從基基線到指數(shù)數(shù)增長的拐拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)應(yīng)的循環(huán)數(shù)數(shù)100101●傳染病診斷斷、監(jiān)測(cè)與與療效預(yù)后后評(píng)估：●揭示疾病發(fā)發(fā)病機(jī)制102⑤熒光定量PCR儀帶有激發(fā)光光源和熒光光信號(hào)檢測(cè)測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，配有電電腦系統(tǒng)及及分析軟件件。103（六）其它它PCR技術(shù)1.反向PCR（inversePCR）原理1042.Alu-PCR1053.原位PCR(in-situPCR)4.巢式PCR（nestedPCR）5.不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）106DNAChipandMicroarray四、基因芯片和和微陣列●基因芯片上上的陣列是是由有規(guī)則則排列的cDNA或寡核苷酸酸等樣本所所組成的。。107宏陣列(Macroarray)高密度微陣列(Microarray)舉例：HPV診斷芯片108DNA微陣列：●寡核苷苷酸微陣列列（oligomicroarray）●cDNA微陣列（cDNAmicroarray）在一微小的的基片（硅硅片等）表表面集成了了大量分子子識(shí)別探針針，能夠平平行分析大大量基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，，因此又被被稱為cDNA芯片。109DNA芯片（cDNA芯片）主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記及芯片制備雜交反應(yīng)及過程控制雜交信號(hào)檢測(cè)信號(hào)分析與解讀110CBACy5-標(biāo)記cDNACy3-標(biāo)記cDNACBACBACBACBACBACBA樣品1樣品2Cy5/Cy3熒光標(biāo)標(biāo)記RNA提取競(jìng)爭(zhēng)性性雜交交顯示示基因表表達(dá)量量差異異二種樣品競(jìng)爭(zhēng)性雜交示意圖基因表達(dá)譜芯片的原理111DNA芯片技技術(shù)的的主要要應(yīng)用用基因組組分析析及發(fā)發(fā)現(xiàn)新新的基基因基因表表達(dá)的的研究究DNA序列分分析基因診診斷和和基因因藥物物設(shè)計(jì)計(jì)112五、Western免疫印印跡Westernblotting原理與與核酸酸分子子雜交交相似似，只只是以以偶聯(lián)聯(lián)標(biāo)記記物的的抗體分子作作為探探針，，檢測(cè)測(cè)轉(zhuǎn)移移到固固相支支持物物上的的蛋白質(zhì)質(zhì)分子。。113Western免疫印印跡信信號(hào)檢檢測(cè)原原理114蛋白質(zhì)質(zhì)樣品品制備備SDS分離蛋白質(zhì)質(zhì)轉(zhuǎn)膜膜Westernblot程序115抗體與與抗原原雜交交信號(hào)檢檢測(cè)分分析116謝謝大大家??！9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。06:10:0806:10:0806:1012/23/20226:10:08AM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。12月月-2206:10:0806:10Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。06:10:0806:10:0806:10Friday,December23,202213、乍見翻疑夢(mèng)夢(mèng)，相悲各問問年。。12月-2212月-2206:10:0806:10:08December23,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。23十二二月20226:10:08上上午06:10:0812月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:10上上午12月-2206:10December23,202216、行動(dòng)出成果果，工作出財(cái)財(cái)富。。2022/12/236:10:0806:10:0823December202217、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時(shí)，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。6:10:08上午6:10上上午06:10:0812月-229、沒有失敗，，只有暫時(shí)停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有結(jié)果，但是是不努力卻什什么改變也沒沒有。。06:10:0806:10:0806:1012/23/20226:10:08AM11、成功就是是日復(fù)一日日那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努力力的積累。。。12月-2206:10:0806:10Dec-2223-Dec-2212、世間成事事，不求其其絕對(duì)圓滿滿，留一份份不足，可可得無限完完美。。06:10:0806:10:0806:10Friday,December23,202213、不不知知香香積積寺寺，，數(shù)數(shù)里里入入云云峰峰。。。。12月月-2212月月-2206:10:0806:10:08December23,202214、意意志志堅(jiān)堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥塊塊一一樣樣任任意意揉揉捏捏