發(fā)酵工程第二章 發(fā)酵菌種選育

第二章生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏

第一節(jié)菌種的分離篩選第二節(jié)培養(yǎng)分離第三節(jié)工業(yè)微生物育種第四節(jié)菌種的保藏及活化帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種

顯微觀察裝置

第一節(jié)菌種的分離簡介

一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟菌種篩選主要步驟調(diào)查研究及查閱充分的資料

↓

設計實驗方案

↓確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境

采樣

↓確定特定的增殖條件

增殖培養(yǎng)

↓確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的

↓定性或半定量快速檢出法

平板分離

↓

原種斜面

↓確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎條件

篩選

↓

初篩（1株1瓶）

↓

復篩（1株3～5瓶）

↓結合初步工藝條件摸索

再復篩（1株3～5瓶）

↓

3～5株

↓

單株純種分離

↓生產(chǎn)性能試驗

↓→毒性試驗

菌種鑒定（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二））增殖殖培養(yǎng)養(yǎng)為了容容易分分離到到所需需的菌菌種，，讓無無關的的微生生物至至少是是在數(shù)數(shù)量上上不要要增加加，可可以通通過配配制選選擇性性培養(yǎng)養(yǎng)基，，選擇擇一定定的培培養(yǎng)條條件來來控制制。例如碳碳源利利用的的控制制，可可選定定糖，，淀粉粉、纖纖維素素，或或者石石油等等，以以其中中的一一種為為唯一一碳源源，那那么只只有利利用這這一碳碳源的的微生生物才才能大大量正正常生生長，，而其其它微微生物物就可可能死死亡或或淘汰汰。這這樣對對下階階段的的純種種分離離就會會順利利得多多。（三））培養(yǎng)養(yǎng)分離離盡管通通過增增殖培培養(yǎng)效效果顯顯著，，但還還是處處于微微生物物的混混雜生生長狀狀態(tài)。。因此此還必必須分分離，，純化化。在在這——步，，增殖殖培養(yǎng)養(yǎng)的選選擇性性控制制條件件還應應進一一步應應用，，而且且控制制得細細一點點，好好一點點。純純種分分離的的方法法有劃劃線分分離法法、稀稀釋分分離法法。1.稀稀釋平平皿分分離法法1.稀稀釋平平皿分分離法法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋釋1.稀稀釋平平皿分分離法法b.涂涂布平平皿分分離法法a.傾傾注平平皿分分離法法2.平平皿劃劃線分分離法法a.連連續(xù)續(xù)劃線線分離離法b.分分區(qū)劃劃線分分離法法（四））篩選選這一步步是采采用與與生產(chǎn)產(chǎn)相近近的培培養(yǎng)基基和培培養(yǎng)條條件，，通過過三角角瓶的的容量量進行行小型型發(fā)酵酵試驗驗，以以求得得適合合于工工業(yè)生生產(chǎn)用用菌種種。（五））毒性性試驗驗自然界界的一一些微微生物物是在在一定定條件件下產(chǎn)產(chǎn)毒的的，將將其作作為生生產(chǎn)菌菌種應應當十十分當當心，，尤其其與食食品工工業(yè)有有關的的菌種種，更更應慎慎重。。據(jù)有有的國國家規(guī)規(guī)定，，微生生物中中除啤啤酒酵酵母、、脆壁壁酵母母、黑黑曲霉霉、米米曲霉霉和枯枯草桿桿菌作作為食食用無無須作作毒性性試驗驗外，，其他他微生生物作作為食食用，，均需需通過過兩年年以上上的毒毒性試試驗。。第二節(jié)節(jié)培培養(yǎng)養(yǎng)分離離從自然然界中中分離離培養(yǎng)養(yǎng)微生生物是是菌種種選育育的重重要和和基礎礎的步步驟。。到目前前為止止，還還沒有有一種種分離離培養(yǎng)養(yǎng)方法法能揭揭示一一個試試樣中中所包包含的的所有有微生生物總總數(shù)和和種類類。在任一一試樣樣中所所存在在的微微生物物僅為為極少少數(shù)特特定種種類的的菌株株；在在工業(yè)業(yè)微生生物篩篩選過過程中中，應應及時時調(diào)整整檢測測方法法，以以與各各種不不同類類型的的生長長和代代謝之之微生生物相相適應應。因此，，建立立一更更為科科學的的和針針對性性不強強的分分離方方法是是必要要的。。一、成成功的的分離離培養(yǎng)養(yǎng)方法法(1)認真真考它它所需需產(chǎn)品品的特特征和和生產(chǎn)產(chǎn)過程程；(2)制訂訂初步步的篩篩選標標準；；(3)將生生態(tài)學學方法法運用用到分分離和和篩選選過程程。三、將生生態(tài)學方方法用于于培養(yǎng)分分離的一一般思路路要點1．羅列列出所要要分離的的微生物物類群；；2．根據(jù)據(jù)所采集集樣本的的各種生生態(tài)參數(shù)數(shù)，描述述所要分分離的微微生物之之生態(tài)系系統(tǒng)或棲棲息地：：3．將若若干樣本本分成若若干類型型，如植植物和植植物各部部，土壤壤(類型型和土層層)、巖巖石、水水、昆蟲蟲和發(fā)酵酵食品等等；4．羅列列出所要要考察和和測量的的環(huán)境參參數(shù)，如如pH、、鹽分、、水分、、氧化還還原電勢勢及溫度度等；5．列出出生物系系統(tǒng)中有有用的自自然底物物，如森森林土壤壤中的幾幾丁質(zhì)、、葡萄表表皮的果果膠；6．根據(jù)據(jù)上述1-5項項中所獲獲得的數(shù)數(shù)據(jù)，設設計分離離方法，，即選擇擇適宜的的稀釋液液、底物物、試樣樣、天然然浸出汁汁和培養(yǎng)養(yǎng)條件；；7．用標標準方法法作對照照來評價價生態(tài)學學分離方方法；8．根據(jù)據(jù)待檢材材料的生生態(tài)參數(shù)數(shù)需要，，修改已已知的方方法；9．運用用特定的的富集方方法，富富集那些些可能具具有篩選選意義的的微生物物類群。。四、自然然界中細細菌的分分離(一)采采樣和采采集方法法為了從一一特定生生態(tài)系統(tǒng)統(tǒng)中分離離出具有有代表性性的細菌菌菌群，，特別是是分離那那些在唯唯一微環(huán)環(huán)境區(qū)域域中出現(xiàn)現(xiàn)的菌群群時，必必須十分分重視樣樣本的采采集。樣本采集集時所需需的工具具通常有有無菌刮刮鏟、土土樣采集集器、鑷鑷子、解解剖刀、、手套、、無菌小小塑料袋袋和塑料料瓶等。。采樣的注注意事項項1、采樣樣時應盡盡可能保保持相對對無菌；；2、所采采集的樣樣本必須須具有某某種代表表性；3、采好好的樣必必須完整整地標上上樣本的的種類及及采集日日期、地地點以及及采集地地點的地地理、生生態(tài)參數(shù)數(shù)等；4、應充充分考慮慮采樣的的季節(jié)性性和時間間因素，，因為真真正的原原地菌群群的出現(xiàn)現(xiàn)可能是是短暫的的；5、采好好的樣應應及時處處理，暫暫不能處處理的也也應貯存存于4℃℃下，但但貯存時時間不宜宜過長。。這是因因為一旦旦采樣結結束，試試樣中的的微生物物群體就就脫離了了原來的的生態(tài)環(huán)環(huán)境，其其內(nèi)部生生態(tài)環(huán)境境就會發(fā)發(fā)生變化化，微生生物群體體之間就就會出現(xiàn)現(xiàn)消長(二)生態(tài)學參參數(shù)及培培養(yǎng)基的的組成成原則1、加入入培養(yǎng)基基中的天天然提取取物種類類和用量量、環(huán)境境生物物物理學參參數(shù)以及及用于平平板涂布布分離樣樣本的溶溶劑都會會影響實實驗中所所要分離離的細菌菌的數(shù)量量和種類類。2、就分分離培養(yǎng)養(yǎng)基的組組成而言言，部分分培養(yǎng)基基中必須須含有10-50%的的天然提提取物。。加入培培養(yǎng)基中中的天然然提取物物，部分分培養(yǎng)基基中則應應含有多多種碳、、氮源，，如幾丁丁質(zhì)、纖纖維素或或果膠。。3、所有有分離培培養(yǎng)基中中都應含含有抗真真菌劑(如放線線菌酮和和制霉素素)，摻摻加濃度度一般為為50μμg／m1，以以抑抑制真菌菌的生長長。4、瓊脂脂平板在在使用前前應置于于37℃℃培養(yǎng)箱箱中孵育育l、2天。5、培養(yǎng)養(yǎng)基的生生物物理理學參數(shù)數(shù)，如pH及鹽鹽分也應應調(diào)節(jié)到到與試樣樣的生態(tài)態(tài)系統(tǒng)參參數(shù)值相相近。二、分離目的微生生物不純純，需分離純化。采采用簡便便迅速，，有一定定準確性性的檢出出方法，，提高篩篩選效率率。常用用平皿反反應法：：紙片培養(yǎng)養(yǎng)顯色法法：浸有有指示劑劑濾紙。。透明圈法：混濁濁底物被被分解后后形成透明圈。如可溶溶性淀粉粉、碳酸酸鈣等。。

變色色圈法：：直接用用顯色劑劑或指示示劑。生生長圈圈法：利利用某些些具有特特殊營養(yǎng)養(yǎng)要求的的微生物物作為工工具菌，，要分離的微生物物能在一一般培養(yǎng)養(yǎng)條件下下生長而而合成該該營養(yǎng)物物而使工工具菌能能生長，，形成生生長圈。。

抑制制圈法：：瓊脂塊塊培養(yǎng)法法。用剛果紅紅染色法法鑒定篩篩選降解解纖維素素的菌株株羧甲基纖纖維素鈉鈉作培養(yǎng)養(yǎng)物抗生素篩篩選檢定菌培培養(yǎng)，加加上發(fā)酵酵液五、放線線菌的分分離培養(yǎng)養(yǎng)基的組組成原則則大多數(shù)放放線菌的的分離培培養(yǎng)是在在貧脊或或復雜底底物的瓊瓊脂平板板上進行行的。除除嗜溫性性放線菌菌外，其其他放線線菌一般般在培養(yǎng)養(yǎng)4-20天內(nèi)內(nèi)在分離離平板上上緩慢形形成菌落落。在放線菌菌分離瓊瓊脂中通通常都加加入抗真真菌劑制霉菌素素或放線線菌酮，以抑制制真菌的的繁殖。。選擇性地地添加抗抗生素。。分離瓊脂脂平板制制備好后后，一般般皆應在在37℃培培養(yǎng)箱中中存放3天。放線菌的的分離土樣中放放線菌的的非選擇擇性分離離：土樣樣風干，磨碎，，無菌海海綿壓印印土樣后后壓印平平板后培培養(yǎng)。植物體上上放線菌菌的分離離：無菌菌取植物物組織，，干燥以減少細細菌數(shù)量量，剪碎碎植物材材料后植植入平板板表層后后培養(yǎng)。。也可洗洗下微生生物后振振蕩培養(yǎng)養(yǎng)。水中放線線菌的分分離：為為使所所要分離離的放線線菌的數(shù)數(shù)量種類類增多，，一般將將水樣離離心或濾濾紙過濾濾，取離心沉積積或濾紙紙表面沉沉積進行系列列稀釋和和涂布。。次代培養(yǎng)養(yǎng)及純化化菌落形成成后可根根據(jù)肉眼眼可見的的菌落形形態(tài)上的的差異，，作初步步的鑒定定和區(qū)分分。通過高倍倍放大進進行鏡檢檢，可了了解氣生生和營養(yǎng)養(yǎng)孢子形形成情況況。成功地分分離出各各種不同同的放線線菌屬及及種的關關鍵是所所采集樣樣本的本本身及其其分離用用的瓊脂脂培養(yǎng)基基；而肉肉眼識別別不同的的生長形形態(tài)、從從而初步步地加以以鑒定，，在分離離放線菌菌時顯得得尤為重重要。將分離平平板上所所形成的的菌落用用經(jīng)火焰焰灼燒滅滅菌的鉤鉤形針或或無菌牙牙簽挑取取，點接接到瓊脂脂平板上上進行影影印培養(yǎng)養(yǎng)，以進進一步篩篩選和分分離。放線菌菌菌落形態(tài)態(tài)六、真菌分分離1、利用用低碳／／氮比的的培養(yǎng)基基可使真真菌生長長菌落分分散，利利于計數(shù)數(shù)，分離離和鑒定定。這里里主要是是利用營營養(yǎng)成分分的減少少而使生生長減慢慢，并由由此限制制真菌的的遷徙生生長。2、改變變培養(yǎng)溫溫度將有有利于不不同嗜溫溫區(qū)真菌菌的分離離。3、有時時，真菌菌子實體體形成必必須有光光線，這這在分離離培養(yǎng)時時應加以以考慮。。4、選擇擇性富集集：是通通過一定定的方式式使樣本本中一種種或一群群微生物物數(shù)量上上的增加加而利于于分離的的一種技技術。富集可以以是種水水平的，，如通過過營養(yǎng)要要求的改改變來富富集分離離鐮刀菌菌；也可可以是組組成群水水平的，，如以纖纖維素為為唯一碳碳源的選選擇性培培養(yǎng)基可可選擇性性富集所所有能降降解纖維維素的纖纖維素裂裂解微生生物。5、在分分離培養(yǎng)養(yǎng)基中加加入一定定的抗生生素即可可有效地地抑制細細菌生長長及菌落落形成。。真菌的分分離方法法土中真菌菌的分離離：稀釋釋法，混混入法，，壓貼法法，粘附附法，浮浮選法，，注射器器采集法法，土過過篩法，，庶糖密密度梯度度離心法法。植物材料料中真菌菌的分離離：植入入法，壓壓貼法，，洗滌法法，浸泡泡法。水中真菌菌的分離離：水樣樣稀釋后后涂布分分離。餌餌誘技術術常用于于水中真真菌的富富集。子實體直直接分離離培養(yǎng)擔擔子菌：：新采集集的子實實體組織織植入平平板內(nèi)或或在放于于液體培培養(yǎng)基表表面放一一小塊無無菌濾紙紙上培養(yǎng)養(yǎng)。七、生產(chǎn)產(chǎn)選種是在長年年累月的的生產(chǎn)實實踐中，，在培養(yǎng)養(yǎng)工藝條條件沒有有任何可可見變更更情況下下，突然然發(fā)現(xiàn)某某些批次次生產(chǎn)水水平提高高較大，，這就有有可能是是個別自自然變異異朝更好好的方向向變的細細胞，在在這種條條件下很很適應于于培養(yǎng)條條件，并并逐漸顯顯示出它它的生長長優(yōu)勢，，這種優(yōu)優(yōu)勢的發(fā)發(fā)展，促促使它優(yōu)優(yōu)良的生生產(chǎn)性能能表露。。第四節(jié)工工業(yè)業(yè)菌種的的育種方方針工業(yè)菌種種的育種種：是運用遺遺傳學原原理和技技術對某某個用于于特定生生物技術術目的的的菌株進進行的多多方位的的改造。。通過改改造，可可使現(xiàn)存存的優(yōu)良良性狀強強化，或或去除不不良性質(zhì)質(zhì)或增加加新的性性狀。工業(yè)菌種種育種的的方法誘變基因轉(zhuǎn)移移基因重組組育種過程程包括下列列3個步步驟：(1)在在不影響響菌種活活力的前前提下，，有益基基因型的的引入。。(2)希希望基因因型的選選出。(3)改改良菌種種的評價價(包括括實驗規(guī)規(guī)模和工工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)規(guī)模)。選擇育種種方法時時綜合考考慮的因因素(1)待改良良性狀的本質(zhì)質(zhì)及與發(fā)酵工工藝的關系(如批式或連連續(xù)發(fā)酵試驗驗)；(2)對這一一特定菌種的的遺傳和生物物化學萬面認認識的明了程程度；(3)經(jīng)濟費費用。如果對特定菌菌種的基本性性狀及其工藝藝知曉甚少，，則多半采用用隨機誘變、、篩選及選育育等技術：如果對其遺傳傳及生物化學學方面的性狀狀已有較深的的認識，則可可選擇基因重重組等手段進進行定向育種種。工業(yè)菌種改良良方法(1)解除或或繞過代謝途途徑中的限速速步驟：通過過增加特定基基因的拷貝數(shù)數(shù)或增加相應應基因的表達達能力來提高高限速酶的含含量；在代謝謝裔途徑中引引伸出新的代代謝步驟，由由此提供一個個旁路代謝途途徑。(2)增加前前體物的濃度度。(3)改變代代謝途徑，減減少無用副產(chǎn)產(chǎn)品的生成以以及提高菌種種對高濃度的的有潛在毒性性的底物、前前體或產(chǎn)品的的耐受力。(4)抑制或或消除產(chǎn)品分分解酶。(5)改進菌菌種外泌產(chǎn)品品的能力。(6)消除代代謝產(chǎn)品的反反饋抑制。如如誘導代謝產(chǎn)產(chǎn)品的結構類類似物抗性。。提高特定基因因的表達水平平(1)引入強強轉(zhuǎn)錄及翻譯譯信號，可通通過在一高效效表達載體上上克隆靶基因因；在靶基因因的上游引入入強啟動子；；修改現(xiàn)有表表達信號，提提高基因效力力等。(2)誘導解解除基因表達達抑制的突變變。改進菌種的生生長效率提高菌株對底底物的利用率率方法：a.通過過確定并改變變代謝中的耗耗能部分;b.由另一一菌株的高效效低能代謝途途徑代謝來實實現(xiàn)。c.賦予菌菌種對多種底底物，特別是是價廉而豐富富的底物的利利用能力，由由此可降低操操作費用。第四節(jié)誘誘變育種以微生物的自自然變異作為為基礎的生產(chǎn)產(chǎn)選種的機率率并不很高，，一個基因的的自然突變頻頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以以誘發(fā)突變?yōu)闉榛A的育種種，是迄今為為止國內(nèi)外提提高菌種產(chǎn)量量、性能的主主要手段。誘變物理、化學或或生物誘變方方法一、誘變劑和和誘變處理物理誘變劑：：射線如紫外外線、X—射射線、γ—射射線，快中子子；物理因素中目目前使用得最最方便而且十十分有效的是是紫外線。許許多高產(chǎn)菌株株的選育都用用過紫外線，，對于一般實實驗室、中小小型工廠都適適用，也很安安全。其他的幾種射射線都是電離離性質(zhì)的，有有一定的穿透透力，一般都都由專業(yè)人員員在專門的設設備中使用，，否則有一定定危險性。超凈工作臺小型X射線衍衍射儀Co60射線線機化學誘變劑：：化學因子如堿堿基類似物、、5—氟尿嘧嘧啶、烷化劑劑等?；瘜W誘變劑中中使用最多、、最有效的是是烷化劑。使用化學誘變變劑的優(yōu)缺點點：1、大多數(shù)情情況下，就突突變數(shù)量而言言，要比電離離輻射更有效效。2、化學誘變變劑是很經(jīng)濟濟的，因為只只需要少量的的合適的誘變變劑，設備是是實驗室的一一般玻璃器皿皿，一個蒸氣氣罩。而用電電離輻射±行行工作時，設設備費用大，，并要注意安安全性。3、大部分誘誘變劑是致癌癌劑，所以在在使用中必須須非常謹慎，，要避免化學學誘變劑與皮皮膚接觸，，，且切勿吸入入其蒸氣，有有人對某些誘誘變劑極其敏敏感，甚至未未直接接觸就就會過敏，這這就更要當心心。誘變劑的選擇擇1．堿基類似似物和羥胺具具有很高的特特異性，但很很少使用，回回復突變率高高，效果不大大。2．亞硝酸和和烷化劑應用用的范圍較廣廣，造成的遺遺傳損傷較多多。其中亞硝基胍和和甲基磺酸乙乙酯常被稱為“超超誘變劑”，，甲基磺酸乙乙酯是毒性最最小的誘變劑劑之一。3．吖啶類誘誘變劑可以造造成生化代謝謝途徑的完全全中斷。4．紫外線仍仍十分有效。。電離輻射是是造成染色體體巨大損傷的的最好誘變劑劑，它能造成成不可回復的的缺突變。但但它可能影響響鄰近基因的的性能。二、誘變育種種步驟出發(fā)菌株的選選擇處理菌懸液的的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選(一)出發(fā)菌菌株的選擇1．自然界新新分離的野生生型菌株，對對誘變處理較較敏感，容易易達到好的效效果。2．在生產(chǎn)中中經(jīng)生產(chǎn)選種種得到的菌株株與野生型較較相像，也是是良好的出發(fā)發(fā)菌株。3．每次誘變變處理都有一一定提高的菌菌株，往往多多次誘變能積積累較多的提提高。4．出發(fā)菌株株開始時可以以同時選2～～3株，在處處理比較后，，將更適合的的出發(fā)菌株留留作繼續(xù)誘變變。5．要盡量選選擇單倍體細細胞、單核或或核少的多細細胞體來作出出發(fā)誘變細胞胞，這是由于于變異性狀大大部分是隱性性的，特別是是高產(chǎn)基因。。6．根據(jù)采用用的誘變劑或或根據(jù)細胞生生理狀態(tài)或誘誘變譜選擇誘誘變劑，因為為同一誘變劑劑的重復處理理會使細胞產(chǎn)產(chǎn)生抗性，使使誘變效果下下降。有的誘誘變劑是作用用于營養(yǎng)細胞胞，就要選對對數(shù)期的細胞胞：有的作用用于休止期，，就可選用孢孢子。(二)處理菌菌懸液的制備備這一步驟的關關鍵是制備單單細胞和單孢孢子狀態(tài)的、、活力類似的的菌懸液，為為此要進行合合適培養(yǎng)基的的培養(yǎng)，并要要離心，洗滌滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水水(三)誘變處處理根據(jù)前面有關關誘變劑及誘誘變處理的介介紹，結合誘誘變對象的實實際，設計誘誘變處理方案案。(四)中間培培養(yǎng)由于在發(fā)生了了突變尚未表表現(xiàn)出來之前前，有一個表表現(xiàn)延遲的過過程，即細胞胞內(nèi)原有酶量量的稀釋過程程(生理延遲遲)，需3代代以上的繁殖殖才能將突變變性狀表現(xiàn)出出來。此過程程稱為中間培培養(yǎng)這個過程對今今后的篩選和和獲得穩(wěn)定菌菌株都是極為為重要的。方法：讓變異處理后后細胞在液體體培養(yǎng)基中培培養(yǎng)幾小時，，以讓細胞的的遺傳物質(zhì)復復制，讓細胞胞繁殖幾代，，以得到純的的變異細胞。。若不經(jīng)液體培培養(yǎng)基的中間間培養(yǎng)，直接接在平皿上分分離就會出現(xiàn)現(xiàn)變異和不變變異細胞同時時存在于一個個菌落內(nèi)的可可能，形成混混雜菌落，以以致造成篩選選結果的不穩(wěn)穩(wěn)定和將來的的菌株退化。。(五)分離和和篩選篩選分初篩和和復篩。初篩篩以迅速篩出出大量的達到到初步要求的的分離菌落為為目的，以量量為主。復篩則是精選選，以質(zhì)為主主，也就是以以精確度為主主。因此在具具體方法上就就有差異.初篩可以在平平皿上直接以以菌落的代謝謝產(chǎn)物與某些些染料或基質(zhì)質(zhì)的作用形成成的變色圈或或透明圈的大大小來挑取參參加復篩者，，而將90%的菌落淘汰汰。在數(shù)量減少后后就要仔細比比較參加復篩篩和再復篩的的菌株，最后后才能選得優(yōu)優(yōu)秀菌株。在在以后的復篩篩階段，還應應不斷結合自自然分離，純純化菌株。搖床復篩降解纖維素產(chǎn)產(chǎn)生產(chǎn)透明圈圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空空斑紫外線的誘變變育種紫外線誘變一一般采用15W紫外線殺殺菌燈，波長長為2537A．燈與處處理物的距離離為15～30cm，照照射時間依菌菌種而異，一一般為幾秒至至幾十分鐘。。一般我們常常以細胞的死死亡率表示，，希望照射的的劑量死亡率率控制在70～80%為為宜。被照射的菌懸懸液細胞數(shù)，，細菌為106個/ml左右，霉菌孢孢子和酵母細細胞為106～107個/ml。由于于紫外線穿透透力不強，要要求照射液不不要太深，約約0.5～1.0cm厚厚，同時要用用電磁攪拌器器或手工進行行攪拌，使照照射均勻。由于紫外線照照射后有光復復活效應，所所以照射時和和照射后的處處理應在紅燈燈下進行。(二)操作步步驟1．將細菌培培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾傾去上清液，，將菌體打散散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。。2．將菌懸液液放入一已滅滅菌的，裝有有玻璃珠的三三角瓶內(nèi)用手手搖動，以打散菌體。將菌液倒入入有定性濾紙紙的漏斗內(nèi)過過濾，單細胞胞濾液裝入試試管內(nèi)，一般般處于渾濁態(tài)態(tài)的細胞液含含細胞數(shù)可達達108個／ml左右右，作為待處處理菌懸液。。3．取2～4m1制備的的菌液加到直直徑9cm培培養(yǎng)皿內(nèi)，放放入一無菌磁磁力攪拌子，，然后置磁力力攪拌器上、、15W紫外外線下30cm處。在正正式照射前，，應先開紫外外線10min，讓紫外外燈預熱，然然后開啟皿蓋蓋正式在攪拌拌下照射10～50s。。操作均應在在紅燈下進行行，或用黑紙紙包住，避免免白熾光。4．取未照射射的制備菌液液和照射菌液液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細細胞數(shù)。5．取照射菌菌液2ml于于液體培養(yǎng)基基中(300ml三角瓶瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振振蕩培養(yǎng)4～～6h。6．取中間培培養(yǎng)液稀釋分分離、培養(yǎng)。。7．挑取菌落落進行篩選。。亞硝基胍誘變變曲霉菌N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基基胍(NGN，MNNG或TG)對對真核或原核核微生物都有有強烈的誘變變作用。其精精確的作用機機制尚不很清清楚，據(jù)認為為是伴隨著重重氮甲烷的生生成及在酸性性條件下生成成亞硝酸，直直接作用于細細胞內(nèi)的DNA復制系統(tǒng)統(tǒng)，從而誘發(fā)發(fā)了變異。MNNG的誘誘變作用隨pH的升高而而增強。(二)操作步步驟1．單孢子懸懸液制備取取斜面，加加入6ml0.1mol／LpH6.o的的磷酸緩沖液液，用接種環(huán)環(huán)刮下孢子，，振蕩試管，，立即通過帶帶濾紙漏斗過過濾，由此制制得單孢子懸懸液，若孢子子液渾濁狀，，其孢子濃度度可達l06個／ml，，此為待處理理孢子懸液。。2．MNNG溶液的制備備用分析析天平稱取2mg，加入入2ml0.1mol／LpH6.0磷磷酸緩沖液，，于暗處振蕩蕩溶解。3．誘變處理理吸取MNNG溶液液lml，加加入到1m1孢子懸液中中，30℃振振蕩30min，立即稀稀釋1000倍停止作用用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分分離培養(yǎng)，30℃3天天后計數(shù)。4．死亡率計算將未處理的孢孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液液中，同上逐逐級稀釋分離離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處處理前后的活活孢子數(shù)可計計算出死亡率率。5．挑取菌落落進行糖化酶酶及蛋白酶產(chǎn)產(chǎn)量篩選．第五節(jié)營營養(yǎng)缺陷型的的選育營養(yǎng)缺陷型是是指通過誘變變而產(chǎn)生的缺缺乏合成某些些營養(yǎng)物質(zhì)如如氨基酸、維維生素和堿基基等的能力，，必須在其基基本培養(yǎng)基中中加入相應的的營養(yǎng)成分才才能正常生長長的變異株。。與營養(yǎng)缺陷型型對應的是野野生型。與篩選營養(yǎng)缺陷型有關的三類培培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基基（M．M．，minimalmedium）——能滿足足某一菌種的的野生型或原原養(yǎng)型菌株營營養(yǎng)要求的最最低成分的合合成培養(yǎng)基。。②補充培養(yǎng)基基（S．M．，supplementalmedium）——在基本本培養(yǎng)基中有有針對性地補補加某一種或或幾種營養(yǎng)成成分，以滿足足相應的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要要（其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長））的培養(yǎng)基。。③完全培養(yǎng)基基（C．M．，completemedium）——可滿足足該菌各種營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要要的天然或半半合成培養(yǎng)基基。營養(yǎng)缺陷型的的用途營養(yǎng)缺陷型在在生產(chǎn)上和科科學研究上用用途很大。目目前生產(chǎn)氨基基酸、核苷酸酸的菌種都是是各種類型的的缺陷型。要要研究代謝途途徑，育種技技術都必須有有營養(yǎng)缺陷型型的菌株為材材料。篩選營養(yǎng)缺陷陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜一、誘變方法法物理誘變化學誘變二、淘汰野生生型抗生素法：野野生型能在MM中生長，，而缺陷型不不能，于是將將誘變處理液液在MM中培培養(yǎng)短時讓野野生型生長，，處于活化階階段，而缺陷型無法法生長，仍處處于休眠狀態(tài)態(tài)。由于細菌或或酵母對一些些抗生素敏感感，于是就相相應加入一定定量的抗生素素，結果活化化狀態(tài)的野生生型就被殺死死，保存了缺缺陷型。一般般細菌可以采采用青霉素，，酵母可采用用制霉菌素。。菌絲過濾法：：對于霉菌，，因孢子生長長后會長出菌菌絲體，就可可用濾紙過濾濾法將菌絲濾濾去，而缺陷陷型孢子卻因因未發(fā)芽而不不能濾過。三、檢出缺陷陷型原理：在固體體基本培養(yǎng)基基和完全培養(yǎng)養(yǎng)基上，生長長情況完全不不同，缺陷型型在CM上生生長良好，而而在MM上則則不生長，野野生型都能生生長。具體方法：影影印法、點種種法、夾層法法1．將一較平平皿直徑小1cm的金屬屬圓筒蒙上一一層滅菌的絲絲絨，用金屬屬夾夾住，滅滅菌。2．將完全培培養(yǎng)基上長出出的全部菌落落在絲絨上輕輕輕一壓，使使之成為印模模，標記方位位。3．將基本培培養(yǎng)基平皿和和完全培養(yǎng)基基平皿在標記記的同一方位位上先后輕輕輕一壓，此菌菌印模即復印印于上。(一)影印法法4．將CM和MM在恒恒溫箱中培養(yǎng)養(yǎng)。5．二平皿相相同方位進行行比較，即即可發(fā)現(xiàn)在在MM平皿上上長出的菌落落少于GM平平板上的。MM上未長而而相應于CM上長出的那那幾個菌落就就可能是缺陷陷型。此法要求平皿皿上菌落不能能太多，菌落落之間應有一一定間隔。(二)點種法法也就是任意法法。用接種針或牙牙簽將CM上上長出的菌落落在MM和CM兩副平板板上接種，依依次在相應位位置點種，然然后一起培養(yǎng)養(yǎng)，觀察其生生長情況。此法結果明確確，但工作量量大。(三)夾層法法先在培養(yǎng)皿上上倒一層基本本瓊脂培養(yǎng)基基，凝固后涂涂上一層含菌菌的MM，凝凝固后再倒一一薄層MM瓊瓊脂培養(yǎng)基，，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的的菌落標記，，然后倒上一一層CM瓊脂脂培養(yǎng)基，再再培養(yǎng)。這時時第二批長出出的菌落就可可能是缺陷型型。此法缺點是，，結果有時不不明確，而且且將缺陷型菌菌落從夾層中中挑出并不很很容易。四、營養(yǎng)缺陷陷型生長譜的的確定驗證確定是缺缺陷型后，就就需確定其缺缺陷的因子，，即生長譜測測定。生長譜測定的的方法將缺陷型菌株株培養(yǎng)后，收收集菌體，制制備成細胞懸懸液，與MM培養(yǎng)基(融融化并涼至50℃)混合合并傾注平皿皿。待凝固后后，分別在平平皿的5～6個區(qū)間放上上不同的營養(yǎng)養(yǎng)組合的混合合物或吸飽此此組合營養(yǎng)物物的濾紙圓片片。培養(yǎng)后會會在某組合區(qū)區(qū)長出，就可可測得所需營營養(yǎng)。—個平平皿測一個菌菌。以不同組合的的營養(yǎng)混合物物與融化涼至至50℃的MM培養(yǎng)基混混合鋪成平皿皿，然后在這這些平皿上劃劃線接種各個個缺陷型菌株株于各相應位位置，培養(yǎng)后后根據(jù)在這些些組合長出可可推知其營養(yǎng)養(yǎng)因子。在5～6個平皿皿上可測20株菌以上。。第六節(jié)基基因育種基因重組育種種：是運用體體外DNA各各種操作或修修改手法獲得得目的基因，，再借助于病病毒、細菌質(zhì)質(zhì)粒或其他載載體，將目的的基因轉(zhuǎn)移至至新的宿主細細胞并使其在在新的宿主細細胞系統(tǒng)內(nèi)進進行復制和表表達，或者通通過細胞間的的相互作用，，使一個細胞胞的優(yōu)秀性狀狀經(jīng)其間遺傳傳物質(zhì)的交換換而轉(zhuǎn)移給另另—個細胞的的方法。一個完整的基基因克隆過程程包括以下步步驟１、獲得待克克隆的DNA片段（基因因）；２、目的基因因與載體在體體外連接；３、重組DNA分子導入入宿主細胞；；４、篩選、鑒鑒定陽性重組組子；５、重組子的的擴增與／或或表達。2.2基因重組一、質(zhì)粒的特特點1、質(zhì)粒的存存在并非微生生物生命活動動必需。2、每個細胞胞中存在的質(zhì)質(zhì)粒數(shù)稱為該該質(zhì)粒的拷貝貝數(shù)。不同類類型的質(zhì)粒其其拷貝數(shù)各異異，同一質(zhì)粒粒在不同條件件下，拷貝數(shù)數(shù)也可能差異異很大，有嚴嚴緊型和松弛弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈呈現(xiàn)三種形態(tài)態(tài)；常見的一一種是共價、、閉環(huán)狀DNA(CCCDNA)；其次是由由于—條鏈有有缺口而產(chǎn)生生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第第三種是由雙雙環(huán)分子兩段段均斷裂而產(chǎn)產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒粒所賦予宿主主細胞的不同同表現(xiàn)型抗生素抗性：：抗生素的產(chǎn)產(chǎn)生；大腸桿桿菌素的產(chǎn)生生；腸毒素的的產(chǎn)生；復雜雜有機化合物物的降解；限限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶和修飾飾酶的產(chǎn)生；；殺傷性能。。在自然條件下下，許多質(zhì)粒?？山?jīng)細菌接接合或相似方方式在宿主間間相互轉(zhuǎn)移。。在實驗室條條件下，質(zhì)粒粒也可經(jīng)人工工手段將其轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化入宿主細細胞內(nèi)。載體－宿主系系統(tǒng)載體(vector)是是攜帶外源DNA進入宿宿主細胞進行行擴增和表達達的DNA；；一般是通過改改造質(zhì)粒、噬噬菌體或病毒毒等構建的。。載體應具備以以下條件：１、能在適當當?shù)乃拗骷毎袕椭?；２、具有多種種限制酶的單單一切點（即即所謂多克隆隆位點）以便便外源DNA插入；３、具有篩選選標志以區(qū)別別陽性與陰性性重組分子；；４、載體分子子較小，以便便體外基因操操作，同時載載體DNA與與宿主DNA便于分離；；５、對于表達達型載體還應應具有與宿主主細胞相適應應的啟動子、、增強子、加加尾信號等基基因表達元件件。宿主細胞必須須符合以下條條件１、對載體的的復制和擴增增沒有嚴格的的限制；２、不存在特特異的內(nèi)切酶酶體系降解外外源DNA；；３、在重組DNA增殖過過程中，不會會對它進行修修飾；４、重組缺陷陷型，不會產(chǎn)產(chǎn)生體內(nèi)重組組；５、容易導入入重組DNA分子；６、符合重組組DNA操作作的安全標準準。目的基因的獲獲取一、通過建立立基因文庫分分離靶基因基因文庫包括括兩類：基因因組文庫：利利用限制性內(nèi)內(nèi)切酶。cDNA：用用mRNA反反轉(zhuǎn)錄成單鏈鏈DNA，再再經(jīng)DNA聚聚合酶的作用用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇トコ婧松镂锘蛑胁槐肀磉_的內(nèi)含子子。二、化學合成成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈鏈的氨基酸順順序可以知道道它的遺傳密密碼，再依照照密碼合成基基因。三、聚合酶鏈鏈反應法擴增增基因片段對于已知全部部或部分核苷苷酸序列的基基因，可以通通過聚合酶鏈鏈反應（ＰＣＣＲ），以基基因組DNA或cDNA模板擴增得得到目的基因因片段。PCR技術根據(jù)需擴增片片段的兩端設設計引物。使DNA解鏈鏈（高溫），，引物結合于于基因的兩端端（低溫），，在合適溫度度下開始合成成（鏈延長））反應。特點：需要很很少的DNA模板，且能能直接從基因因組中得到目目的基因。DNA擴增PCR反應DNA片斷的的克隆隆載體的的條件件：a復制起起點b適適宜的的限制制酶切切點c選選擇標標記DNA分子子的體體外連連接DNA片段段的體體外連連接是是重組組DNA技技術的的關鍵鍵。DNA連接接是由由DNA連連接酶酶催化化完成成的。。一、DNA連接接酶DNA連接接酶催催化兩兩條雙雙鏈DNA片段段相鄰鄰的5’-磷酸酸和3’-羥基基間形形成磷磷酸二二酯鍵鍵。在分子子克隆隆中最最有用用的的的DNA連連接酶酶是來來自ＴＴ４噬噬菌體體的DNA連連接酶酶。T4DNA連連接酶酶在分分子克克隆中中主要要用于于：１、連連接具具有同同源互互補粘粘性末末端的的ＤＮＮＡ片片段；；２、連連接雙雙鏈DNA分子子間的的平端端；３、在在雙鏈鏈平端端的DNA分子子上添添加合合成的的人工工接頭頭或適適配子子。重組DNA導入入宿主主菌體外連連接的的重組組DNA分分子必必須導導入適適當?shù)牡氖荏w體細胞胞中才才能大大量的的復制制、增增殖和和表達達。根根據(jù)所所采用用的載載體的的性質(zhì)質(zhì)，將將重組組DNA分分子導導入受受體可可有不不同的的方法法。一、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化指以細細菌質(zhì)質(zhì)粒為為載體體，將將外源源基因因?qū)肴胧荏w體細胞胞的過過程。。轉(zhuǎn)化化時，，細菌菌必須須經(jīng)過過適當當?shù)奶幪幚硎故怪幪幱诟懈惺軕B(tài)態(tài)－即即容易易接受受外源源DNA的的狀態(tài)態(tài)，然然后利利用短短暫熱熱休克克使DNA導入入細菌菌宿主主中。。此外還還可用用電穿穿孔法法轉(zhuǎn)化化細菌菌，它它的優(yōu)優(yōu)點是是操作作簡便便、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效效率高高、適適用于于任何何菌株株。二、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染和和感染染利用噬噬菌體體DNA作作為載載體時時可經(jīng)經(jīng)兩種種方式式導入入受體體菌。。一種種是感感染，，即在在體外外將噬噬菌體體DNA包包裝成成病毒毒顆粒粒，然然后使使其感感染受受體菌菌。另另一種種方式式是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染，，即在在DNA連連接酶酶作用用下使使噬菌菌體DNA環(huán)化化，再再象重重組質(zhì)質(zhì)粒一一樣地地轉(zhuǎn)化化進受受體菌菌。但但習慣慣上常常把以以噬菌菌體DNA為載載體構構建成成的重重組子子導入入細胞胞的過過程統(tǒng)統(tǒng)稱為為轉(zhuǎn)染染。重組克克隆的的篩選選與鑒鑒定基因克克隆的的最后后一步步是從從轉(zhuǎn)化化細菌菌菌落落中篩篩選出出含有有陽性性重組組子的的菌落落，并并鑒定定重組組子的的正確確性。。通過細菌菌培養(yǎng)以以及重組組子的擴擴增，獲獲得所需需的基因因片段的的大量拷拷貝。進進一步研研究該基基因的結結構、功功能，或或表達該該基因的的產(chǎn)物。。一、抗藥藥性標志志的篩選選如果克隆隆載體帶帶有某種種抗藥性性標志基基因如ampr或tetrr，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化后只只有含這這種抗藥藥基因的的轉(zhuǎn)化子子細菌才才能在含含該抗菌菌素的平平板上幸幸存并形形成菌落落，這樣樣就可將將轉(zhuǎn)化菌菌與非轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌區(qū)區(qū)別開來來。如果果重組DNA時時將外源源基因插插入標志志基因內(nèi)內(nèi)，該標標志基因因失活，，通過有有無抗菌菌素培養(yǎng)養(yǎng)基對比比培養(yǎng)，，還可區(qū)區(qū)分單純純載體或或重組載載體（含含外源基基因）的的轉(zhuǎn)化菌菌落。二、β－－半乳糖糖苷酶系系統(tǒng)篩選選很多載體體都攜帶帶一段細細菌的lacZ基因，，它編碼碼β－半半乳糖苷苷酶N-端的146個個氨基酸酸，稱為為α－肽肽，它表表達β－－半乳糖糖苷酶的的C-端端肽鏈。。當載體與與宿主細細胞同時時表達兩兩個片段段時，宿宿主細胞胞才有ββ－半乳乳糖苷酶酶活性，，使特異異的底物物X-gal變變?yōu)樘m蘭色化合合物，這這就是所所謂的αα－互補補。而重組子子由于基基因插入入使α－－肽基因因失活，，不能形形成α－－互補，，在含X-gal的平平板上，，含陽性性重組子子的細菌菌為無色色菌落或或噬菌斑斑。三、菌落落快速裂裂解鑒定定法從平板上上直接挑挑選菌落落裂解后后，直接接電泳檢檢測載體體質(zhì)粒大大小，判判斷有無無插入片片段存在在，該法法適于插插入片段段較大的的重組子子初篩。。四、內(nèi)切切酶圖譜譜鑒定經(jīng)初篩鑒鑒定有重重組子的的菌落，，小量培培養(yǎng)后，，再分離離出重組組質(zhì)?；蚧蛑亟M噬噬菌體DNA，，用相應應的內(nèi)切切酶切割割，釋放放出插入入片斷；；對于可可能存在在雙向插插入的重重組子，，還要用用內(nèi)切酶酶消化鑒鑒定插入入的方向向。重組DNA的鑒定遺傳學方方法第七節(jié)原原生生質(zhì)體育育種原生質(zhì)體體育種技技術主要要有原生生質(zhì)體融融合、原原生質(zhì)體體轉(zhuǎn)化技技術，此此外尚有有原生質(zhì)質(zhì)體誘變變育種等等。原生質(zhì)休休融合育育種是基基因重組組的一種種重要方方法。原生質(zhì)體體融合作作為一種種新的基基因重組組手段是是1978年第第三屆國國際工業(yè)業(yè)微生物物遺傳學學討論會會上提出出來的。。一、原生生質(zhì)體融融合育種種的特點點(一)雜雜交頻率率較高：：細胞壁壁去除后后在高滲滲條件下下形成類類似于球球形的原原生質(zhì)體體。(二)受受接合型型或致育育型的限限制較小小：二親親株中任任何一株株都可能能起受體體或供體體的作用用，因此此有利于于不同種種屬間微微生物的的雜交。。(三)遺遺傳物質(zhì)質(zhì)傳遞更更為完整整：原生生質(zhì)體融融合是二二親株的的細胞質(zhì)質(zhì)和細胞胞核進行行類似的的合二為為一的過過程。(四)存存在著兩兩株以上上親株同同時參與與融合形形成融合合子的可可能性。。（五有可可能采用用產(chǎn)量性性狀較高高的菌株株作融合合親株。。(六)提提高菌株株產(chǎn)量的的潛力較較大。(七)有有助于建建立工業(yè)業(yè)微生物物轉(zhuǎn)化體體系。二、原生生質(zhì)體融融合育種種步驟1．標記記菌株的的篩選和和穩(wěn)定性性驗證。。2．原生生質(zhì)體制制備。3．等量量原生質(zhì)質(zhì)體加聚聚乙二醇醇促進融融合。4．涂布布于再生生培養(yǎng)基基，再生生出菌落落。5．選擇擇性培養(yǎng)養(yǎng)基上劃劃線生長長，分離離驗證，，挑取融融合子進進一步試試驗、保保藏。6．生產(chǎn)產(chǎn)性能篩篩選。三、原生生質(zhì)體融融合育種種的要點點（一）標標記菌種種的選擇擇獲得標記記菌種的的方法是是采用常常規(guī)誘變變育種，，篩選出出營養(yǎng)缺缺陷型或或／和抗抗藥性菌菌株。這這里最重重要的是是標記必必須穩(wěn)定定。采用抗藥藥性菌株株除可作作標記外外，在實實驗室中中還可排排除雜菌菌污染的的干擾。。為的是是確證融融合的成成功，可可以采用用多標記記菌種。。(二)原生質(zhì)質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制制備主要是在在高滲壓溶液液中加入細胞胞壁分解酶，，將細胞壁分分離剝離，結結果剩下由原原生質(zhì)膜包住住的類似球狀狀的細胞，它它保持原細胞胞的一切活性性。在放線菌和細細菌中，制備備原生質(zhì)體主主要采用溶菌菌酶；酵母和和霉菌一般可可用蝸牛酶或或纖維素酶等等。影響原生質(zhì)體體制備的因素素1．菌體的前前處理為了使酶作用用的效果好一一些，可將菌菌作一些前處處理。如細菌菌加入亞抑制制劑量的青霉霉素。2．菌體的培培養(yǎng)時間為了使細胞易易于原生質(zhì)體體化，一般選選擇增殖期的的菌體。3．酶濃度度對于不同種屬屬的微生物，，不僅對酶的的種類要求不不同，就是對對酶的濃度也也有差異。另另外，最佳酶酶濃度還隨不不同的生長期期的菌體而變變化。4．酶處理溫溫度5．破壁時的的pH值6．滲透壓穩(wěn)穩(wěn)定劑等滲透壓在原原生質(zhì)體制備備中，不僅起起到保護原生生質(zhì)體免于膨膨裂，而且還還有助于酶和和底物的結合合，滲透壓穩(wěn)穩(wěn)定劑多采用用甘露醇，山山梨醇，蔗糖糖等有機物和和KCl和NaCl等無無機物。第八節(jié)篩選選新的代謝產(chǎn)產(chǎn)物一、開發(fā)新的的代謝產(chǎn)物的的途徑(1)從自然然界分離新的的微生物菌株株，或采用新新的檢閱方法法篩選新的代代謝產(chǎn)物。(2)對已知知微生物的代代謝產(chǎn)物進行行化學修飾。。(3)利用微微生物轉(zhuǎn)化改改造代謝產(chǎn)物物的結構。(4)通過原生質(zhì)質(zhì)體融合獲得得新的代謝產(chǎn)產(chǎn)物。(5)DNA重組技術。。二、篩選微生生物新的代謝謝產(chǎn)物

的程程序突變型菌株的的篩選一、產(chǎn)量性狀狀突變株的篩篩選三、篩選微生生物代謝產(chǎn)物物的目標篩選克服抗生生素抗性菌株株的活性物質(zhì)質(zhì)；篩選抗腫瘤、、抗病毒的活活性物質(zhì)；研究有藥理活活性的酶抑制制劑及免疫調(diào)調(diào)節(jié)劑；尋找食品工業(yè)業(yè)最好的酵母母培養(yǎng)物；篩選降解有害害物質(zhì)的微生生物以及治療療上具有低毒毒、長效的化化學藥物等。四、篩選微生生物代謝產(chǎn)物物的方法(一)直接方方法為了盡快確定定微生物代謝謝產(chǎn)物的利用用前途，在體體外試驗測得得活性后，可可以將培養(yǎng)液液的有效成分分直接作用于于機體，觀察察被測樣品的的療效。這種直接確定定代謝產(chǎn)物用用途的方法亦亦稱動物體內(nèi)內(nèi)治療試驗。。(二)間接方方法篩選醫(yī)用抗生生素，可用細細茵、真菌、、病毒或腫瘤瘤模型，尋找找抗細菌、抗抗真菌、抗病病毒、抗腫瘤瘤抗生素、酶酶抑制劑、免免疫制劑等有有效物質(zhì)。在預篩選時，，多用瓊脂平平扳擴散抑菌菌法。通過預預篩選，直接接測定最初分分離物的生物物活性，能加加速篩選過程程。五、檢測系統(tǒng)統(tǒng)篩選過程的成成功依賴于排排除那些已知知的或并非需需要的代謝產(chǎn)產(chǎn)物的檢驗方方法，這樣才才能識別出人人們需要的化化合物。性能簽別性能鑒別是分分離和篩選微微生物代謝產(chǎn)產(chǎn)物中最基礎礎的工作。鑒別可分為兩兩方面：一是對微生物物方面進行形形態(tài)、培養(yǎng)、、生化功能答答試驗觀察，，并確定微生生物產(chǎn)生菌的的類群；二是從化學的的早期鑒別來來鑒別微生物物的代謝產(chǎn)物物?；瘜W的早早期鑒別一般般對產(chǎn)生菌所所產(chǎn)生的代謝謝產(chǎn)物進行紙紙上層析、薄薄板層析、紙紙上電泳、抗抗菌譜、高壓壓電泳、紫外外分光光度法法、液相和氣氣相色譜等試試驗，井獲得得各種圖譜，，與已知圖譜譜進行比較鑒鑒別。薄板層析結果果如果認為是有有實用前途的的代謝產(chǎn)物，，則要進一步步大量培養(yǎng)，，并進行動物物試驗、毒性性考查、藥物物代謝等實驗驗，并進行提提高發(fā)酵水平平和改善提取取工藝的工作作，以備投入入生產(chǎn)。如果是新的代代謝產(chǎn)物．一一般要進一步步確定其化學學結構，井在在此基礎上進進行合成法的的研究或進行行化學改造，，研究結構與與生物活性的的相互關系，，并對作用機機制、生物合合成過程作進進一步的研究究。菌種篩選方法法誘變處理后，，突變細胞只只占存活細胞胞的百分之幾幾，而能使生生產(chǎn)狀況提高高的細胞又只只是突變細胞胞中的少數(shù)。。為了花費最少少的工作量，，在最短的時時間內(nèi)取得最最大的篩選成成效，就要求求采用效率較較高的科學篩篩選方案和手手段。菌種篩選方案案初篩：目的是是刪去明確不不符合要求的的大部分菌株株，把生產(chǎn)性性狀類似的菌菌株盡量保留留下來，使優(yōu)優(yōu)良菌種不致致于漏網(wǎng)。初初篩工作以量量為主，測定定的精確性還還在其次。初初篩的手段應應盡可能快速速、簡單。復篩的目的是是確認符合生生產(chǎn)要求的菌菌株，所以，，復篩步驟以以質(zhì)為主，應應精確測定每每個菌株的生生產(chǎn)指標。菌種篩選的手手段初篩從菌體形態(tài)變變異分析平皿快速檢測測法

具體的的有紙片培養(yǎng)養(yǎng)顯色法、變變色圈法、透透明圈法、生生長圈法和抑抑制圈法等搖瓶培養(yǎng)法搖搖瓶培養(yǎng)法也也可用于初篩篩。

初篩的的搖瓶培養(yǎng)一一般是一個菌菌株只做一次次發(fā)酵測定，，從大量菌株株中選出10-20%較較好的菌株，，淘汰80-90%的菌菌株；而復篩篩中搖瓶培養(yǎng)養(yǎng)一般是一個個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好好的菌株，再再做進一步比比較，選出最最佳的菌株。特殊變變異菌菌的篩篩選方方法營養(yǎng)缺缺陷型型突變變株的的篩選選經(jīng)誘變變處理理后的的菌懸懸液在在篩選選前一一般應應先進進行誘誘變后后培養(yǎng)養(yǎng)，以以促使使變異異細胞胞發(fā)生生分離離，防防止出出現(xiàn)表表型延延遲現(xiàn)現(xiàn)象，，篩選選出不不純的的菌株株。營營養(yǎng)缺缺陷型型的篩篩選一一般包包括濃濃縮、、進一一步檢檢出和和鑒別別營養(yǎng)養(yǎng)缺陷陷型等等步驟驟?？剐酝煌蛔兙甑牡暮Y選選抗抗性突突變株株的篩篩選相相對比比較容容易，，只要要有10-6頻率的的突變變體存存在，，就容容易篩篩選出出來。。抗性性突變變株的的篩選選常用用的有有一次次性篩篩選法法和階階梯性性篩選選法兩兩種手手段。。一次性性篩選選法噬噬菌菌體抗抗性菌菌株、、耐高高溫菌菌株階梯性性篩選選法藥藥物抗抗性突突變株株。組成酶酶變異異株的的篩選選許多水水解酶酶是誘誘導酶酶，只只有在在含有有底物物或底底物類類似物物的培培養(yǎng)環(huán)環(huán)境中中，微微生物物才會會合成成這些些酶類類，所所以，，誘導導酶的的生產(chǎn)產(chǎn)不僅僅需要要誘導導物，，而且且受到到誘導導物的的種類類、數(shù)數(shù)量以以及分分解產(chǎn)產(chǎn)物的的影響響。具體的的篩選選方法法有恒恒化器器法、、循環(huán)環(huán)培養(yǎng)養(yǎng)法和和誘導導抑制制物法法。1)恒恒化化器法法：常常被用用于微微生物物的““馴化化”。。在培培養(yǎng)基基中添添加不不能起起誘導導作用用的低低濃度度底物物，菌菌生長長速率率極慢慢，而而群體體中少少數(shù)組組成型型變異異株則則可合合成有有關的的酶，，分解解利用用該底底物，，生長長速率率較快快。為了提提高組組成酶酶變異異株的的優(yōu)勢勢，即即它在在群體體中的的比例例，可可以應應用恒恒化器器培養(yǎng)養(yǎng)技術術。隨隨著恒恒化器器培養(yǎng)養(yǎng)中不不斷加加入新新鮮基基質(zhì)而而逐漸漸增大大組成成酶變變異株株的優(yōu)優(yōu)勢，，這樣樣就能能夠比比較容容易地地做進進一步步的純純化分分離。。2)循循環(huán)環(huán)培養(yǎng)養(yǎng)法：：利用用不含含誘導導物的的培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境境和含含有誘誘導物物的培培養(yǎng)環(huán)環(huán)境進進行交交替循循環(huán)培培養(yǎng)待待分離離的菌菌懸液液，從從而使使組成成酶變變異株株得到到富集集。當接種種到不不含誘誘導物物而含含有其其它可可利用用碳源源的培培養(yǎng)基基中時時，兩兩種類類型菌菌株同同樣能能較好好地生生長，，但在在此環(huán)環(huán)境中中組成成型突突變株株已能能合成成有關關的水水解酶酶，而而誘導導型菌菌株就就不能能合成成。將它們們轉(zhuǎn)接接入含含誘導導物的的培養(yǎng)養(yǎng)基中中時，，變異異株能能迅速速利用用誘導導底物