化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范

可修改歡送下載精品Word可修改歡送下載精品Word可修改歡送下載精品Word化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)2005年6月

目錄一、總那么………………3二、試驗(yàn)方法〔一〕第一階段試驗(yàn)…………………151、急性吸入毒性試驗(yàn)……………162、急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)……………203、急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)……………234、急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)……………………265、皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)………326、皮膚變態(tài)反響試驗(yàn)〔皮膚致敏試驗(yàn)〕………36〔二〕第二階段試驗(yàn)………………541、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)〔Ames試驗(yàn)〕………………552、體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)…………623、體內(nèi)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)……684、體內(nèi)哺乳動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)…………………755、哺乳動物精原細(xì)胞/初級精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，或…79精子畸形試驗(yàn)…………………876、嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)……………………907、免疫毒性評價試驗(yàn)方法………958、亞急性吸入〔14/28天〕毒性試驗(yàn)…………1049、亞急性經(jīng)皮〔21/28天〕毒性試驗(yàn)…………11010、亞急性經(jīng)口〔28天〕毒性試驗(yàn)……………115〔三〕第三階段試驗(yàn)………………1211、亞慢性吸入毒性試驗(yàn)…………1222、亞慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)…………1263、亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)…………1304、致畸試驗(yàn)………………………1365、兩代繁殖毒性試驗(yàn)……………1426、遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)…………147〔四〕第四階段試驗(yàn)………………1531、慢性吸入毒性試驗(yàn)……………1542、慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)……………1603、慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)……………1664、致癌試驗(yàn)，或…………………172慢性毒性/致癌性合并試驗(yàn)………………1805、毒物代謝動力學(xué)試驗(yàn)………1896、接觸人群調(diào)查與觀察〔參考國內(nèi)外有關(guān)專著或教科書〕〔五〕參考試驗(yàn)……………………1961、皮膚變態(tài)反響試驗(yàn)-局部淋巴結(jié)法…………1972、大腸桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)………2023、酵母菌基因突變試驗(yàn)………2104、體外哺乳動物細(xì)胞正向基因突變試驗(yàn)……2145、果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)………2206、枯草桿菌基因重組試驗(yàn)………2247、體外哺乳動物細(xì)胞程序外DNA合成〔UDS〕試驗(yàn)……………2328、體內(nèi)哺乳動物外周血細(xì)胞微核試驗(yàn)…………2389、體外哺乳動物姊妹染色單體交換〔SCE〕試驗(yàn)………………24410、體內(nèi)哺乳動物骨髓細(xì)胞姊妹染色體交換〔SCE〕試驗(yàn)……25011、繁殖/生長發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)………………25612、亞急性毒性合并繁殖/發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)…………………26213、一代繁殖試驗(yàn)………………26914、神經(jīng)毒性篩選組合試驗(yàn)……………………274總那么GeneralPrinciples

1依據(jù)根據(jù)?中華人民共和國職業(yè)病防治法?、?作業(yè)場所使用有毒物品勞動保護(hù)條例?、?危險化學(xué)品平安管理?xiàng)l例?、?職業(yè)衛(wèi)生技術(shù)效勞機(jī)構(gòu)管理方法?、?化學(xué)品毒性鑒定管理標(biāo)準(zhǔn)?制定本標(biāo)準(zhǔn)。2范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化學(xué)品毒性鑒定的毒理學(xué)檢測程序、工程和方法，適用于化學(xué)品毒性鑒定和評價。3標(biāo)準(zhǔn)性引用文件GB14924-2001實(shí)驗(yàn)動物與飼料標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2001實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施OECDGuidelineforTestingofChemicals(1981~2002)USACodeofFederalRegulations,Title40,Volume28USEPAOPPTSHealthEffectsTestGuidelines(1996~2000)4術(shù)語解釋化學(xué)品〔Chemicals〕：本標(biāo)準(zhǔn)所稱化學(xué)品，系指工業(yè)用和民用的化學(xué)原料、中間體、產(chǎn)品等單分子化合物、聚合物以及不同化學(xué)物組成的混合劑與產(chǎn)品。不包括法律、法規(guī)已有規(guī)定的食品、食品添加劑、化裝品、藥品等。急性吸入毒性〔AcuteInhalationToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物短時間〔24h內(nèi)〕持續(xù)吸入一種可吸入性受試樣品后，在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。半數(shù)致死濃度MedianLethalConcentration，LC50〕：指在內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入受試樣品引起受試動物發(fā)生死亡概率為50%的濃度。以單位體積空氣中受試樣品的質(zhì)量(mg/m3)來表示。急性經(jīng)皮毒性〔AcuteDermalToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物短時間〔24h內(nèi)〕經(jīng)皮膚接觸受試樣品后，在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。急性經(jīng)口毒性〔AcuteOralToxicity〕：一次或在24h內(nèi)屢次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動物受試樣品后，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。半數(shù)致死劑量〔MedianLethalDose，LD50〕：在一定時間內(nèi)經(jīng)口或經(jīng)皮給予受試樣品后，使受試動物發(fā)生死亡概率為50%的劑量。以單位體重接受受試樣品的質(zhì)量(mg/kgbw或g/kgbw)來表示。皮膚刺激性〔DermalIrritation〕：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性〔DermalCorrosion〕：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。眼刺激性〔EyeIrritation〕：眼球外表接觸受試樣品后產(chǎn)生的可逆性炎性變化。眼腐蝕性〔EyeCorrosion〕：眼球外表接觸受試樣品后引起的不可逆性組織損傷。皮膚致敏〔過敏性接觸性皮炎〕(SkinSensitization，AllergicContactDermatitis)：皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反響。對于人類這種反響可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反響不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。亞急性經(jīng)口毒性〔SubacuteOralToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在14～28天內(nèi)，每日經(jīng)口接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。亞急性經(jīng)皮毒性〔SubacuteDermalToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在14～28天內(nèi)，每日經(jīng)皮接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。亞急性吸入毒性〔SubacuteInhalationToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在14～28天內(nèi)，每日經(jīng)呼吸道接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。致突變性〔Mutagenicity〕：受試樣品引起原核或真核細(xì)胞、或?qū)嶒?yàn)動物遺傳物質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和/或數(shù)量改變的效應(yīng)。免疫毒性〔Immunotoxicity〕：受試樣品引起機(jī)體免疫功能抑制或異常增強(qiáng)的效應(yīng)。神經(jīng)毒性〔Neurotoxicity〕：受試樣品對神經(jīng)系統(tǒng)功能或結(jié)構(gòu)的損害效應(yīng)。亞慢性經(jīng)口毒性〔SubchronicOralToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在其局部生存期〔不超過10%壽命期〕內(nèi)，每日經(jīng)口接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。亞慢性經(jīng)皮毒性〔SubchronicDermalToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在其局部生存期〔不超過10%壽命期〕內(nèi)，每日經(jīng)皮接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。亞慢性吸入毒性〔SubchronicInhalationToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在其局部生存期〔不超過10%壽命期〕內(nèi)，每日經(jīng)呼吸道接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。蓄積毒性〔CumulativeToxicity〕：受試樣品在體內(nèi)蓄積引起的有害效應(yīng)，蓄積有兩種形式：〔1〕物質(zhì)蓄積，即長期反復(fù)接觸受試樣品時，由于吸收速度超過消除速度導(dǎo)致的該物質(zhì)在體內(nèi)逐漸增多；〔2〕功能蓄積，即受試樣品雖然在體內(nèi)的代謝和排出速度較快，但其造成的損傷恢復(fù)慢，在前一次的損傷未恢復(fù)前又發(fā)生新的損傷，如此殘留損傷的累積稱為功能蓄積。致畸性〔Teratogenicity〕：受試樣品在胚胎發(fā)育期引起胎仔永久性結(jié)構(gòu)和功能異常的效應(yīng)。生殖毒性〔ReproductionToxicity〕：受試樣品對親代繁殖功能或能力的影響和/或?qū)ψ哟L發(fā)育的損害效應(yīng)。生長發(fā)育毒性〔DevelopmentalToxicity〕：妊娠動物接觸受試樣品而引起的子代在出生以前、圍產(chǎn)期和出生以后所顯現(xiàn)出的機(jī)體缺陷或功能障礙。無可見有害作用水平〔NoObservedAdverseEffectLevel，NOAEL〕：在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，用現(xiàn)有的技術(shù)手段或檢測指標(biāo)未觀察到任何與受試樣品有關(guān)的毒性作用的最大染毒劑量或濃度。最低可見有害作用水平〔LowestObservedAdverseEffectLevel，LOAEL〕：在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，受試樣品引起實(shí)驗(yàn)動物形態(tài)、功能、生長發(fā)育等發(fā)生有害改變的最低染毒劑量或濃度。慢性毒性〔ChronicToxicity〕：實(shí)驗(yàn)動物在其正常生命期的大局部時間內(nèi)接觸受試樣品所引起的健康損害效應(yīng)。致癌作用〔Carcinogenesis〕：受試樣品引起腫瘤發(fā)生率和/或類型增加、潛伏期縮短的效應(yīng)。基線劑量〔BenchmarkDose,BMD〕：由于NOAEL和LOAEL都是實(shí)驗(yàn)中的具體劑量值，易受每組樣本含量大小和組間距寬窄等因素影響，故設(shè)定基線劑量，可選擇ED1〔概率為1%的受試個體出現(xiàn)效應(yīng)的劑量〕，或選擇ED5〔概率為5%的受試個體出現(xiàn)效應(yīng)的劑量〕或ED10〔概率為10%的受試個體出現(xiàn)效應(yīng)的劑量〕的95%可信限下限。毒物代謝動力學(xué)〔Toxicokinetics〕：定量研究毒物在體內(nèi)吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化、排泄等過程隨時間變化的動態(tài)規(guī)律的學(xué)科。平安系數(shù)〔SafetyFactor，SF〕：在以動物試驗(yàn)數(shù)據(jù)外推到人，或以小范圍人群調(diào)查結(jié)果判斷所評價的化學(xué)品對大范圍人群的有害作用時，為排除所涉及的不確定因素而設(shè)定的系數(shù)，用于制定化學(xué)品控制標(biāo)準(zhǔn)，以保證接觸人群的平安。危險性參考劑量〔RiskReferenceDose，RfD〕：危險度到達(dá)可接受程度的劑量。危險性參考濃度〔RiskReferenceConcentration，RfC〕：危險度到達(dá)可接受程度的濃度。日允許攝入量〔AcceptableDailyIntake，ADI〕：終身每日攝入化學(xué)物而不引起可檢出的健康損害效應(yīng)的劑量，一般以mg/kgbw.d表示?！仓掳┪锏摹硨?shí)際平安劑量〔VisualSafeDose，VSD〕：化學(xué)品引起致癌率有99%的把握低于10-6的劑量水平。職業(yè)接觸限值〔OccupationalExposureLimit，OEL〕：是職業(yè)性有害因素的接觸限制量值，指勞動者在職業(yè)活動過程中長期反復(fù)接觸對機(jī)體不引起急性或慢性有害健康影響的容許接觸水平。最高容許濃度〔MaximalAllowableConcentration，MAC〕：指工作地點(diǎn)、在一個工作日內(nèi)、任何時間均不應(yīng)超過的有毒化學(xué)物的濃度。5化學(xué)品毒性鑒定程序和方法化學(xué)品毒性鑒定分為4個階段〔1〕第一階段〔急性毒性試驗(yàn)、眼刺激試驗(yàn)和皮膚刺激試驗(yàn)〕主要是急性毒性參數(shù)的測定和了解受試樣品對皮膚、粘膜的刺激性以及致敏性，為毒性分級和標(biāo)簽管理提供依據(jù)。同時，可了解受試樣品對機(jī)體造成急性損害的可能性和嚴(yán)重程度，并為第二階段各項(xiàng)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。在測定LD50時，一般要求用兩種動物，染毒途徑應(yīng)包括所有人體可能的接觸途徑。急性吸入毒性試驗(yàn)急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)皮膚變態(tài)反響試驗(yàn)〔皮膚致敏試驗(yàn)〕〔2〕第二階段〔亞急性毒性試驗(yàn)和致突變試驗(yàn)〕主要是了解受試樣品的亞急性毒性和遺傳毒性，為第三階段各項(xiàng)試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)的選擇提供依據(jù)，并對受試樣品的致癌性進(jìn)行預(yù)測。鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)〔Ames試驗(yàn)〕體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)體內(nèi)哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)體內(nèi)哺乳動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)哺乳動物精原細(xì)胞/初級精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，或精子畸形試驗(yàn)嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)免疫毒性評價試驗(yàn)方法亞急性吸入〔14/28天〕毒性試驗(yàn)亞急性經(jīng)皮〔21/28天〕毒性試驗(yàn)亞急性經(jīng)口〔28天〕毒性試驗(yàn)〔3〕第三階段〔亞慢性毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)、繁殖試驗(yàn)〕通過亞慢性試驗(yàn)進(jìn)一步確定屢次重復(fù)染毒的毒作用性質(zhì)和靶器官，初步確定NOAEL或LOAEL，為第四階段各項(xiàng)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)的選擇提供依據(jù)；通過致畸試驗(yàn)判斷受試樣品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通過繁殖試驗(yàn)，可判斷受試樣品對生殖過程的損害作用。通過遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)，可判斷受試樣品是否具有遲發(fā)性神經(jīng)毒作用。亞慢性吸入毒性試驗(yàn)亞慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)致畸試驗(yàn)兩代繁殖毒性試驗(yàn)遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)〔4〕第四階段〔慢性毒性試驗(yàn)和致癌試驗(yàn)〕通過慢性毒性試驗(yàn)可確定受試樣品的NOAEL和LOAEL，為推算受試樣品的平安接觸限值提供依據(jù)。通過致癌試驗(yàn)可以確定受試樣品對受試實(shí)驗(yàn)動物的致癌性。通過代謝動力學(xué)試驗(yàn)可以了解受試樣品的吸收、分布、代謝和排泄特點(diǎn)，了解蓄積毒性作用及其可能的靶器官和毒作用機(jī)理。慢性吸入毒性試驗(yàn)慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)致癌試驗(yàn)或慢性毒性試驗(yàn)合并致癌試驗(yàn)毒物代謝動力學(xué)試驗(yàn)參考方法皮膚變態(tài)反響試驗(yàn)-局部淋巴結(jié)法大腸桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)酵母菌基因突變試驗(yàn)體外哺乳動物細(xì)胞正向基因突變試驗(yàn)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)枯草桿菌基因重組試驗(yàn)體外哺乳動物細(xì)胞程序外DNA合成〔UDS〕試驗(yàn)體內(nèi)哺乳動物外周血細(xì)胞微核試驗(yàn)體外哺乳動物姊妹染色單體交換〔SCE〕試驗(yàn)體內(nèi)哺乳動物骨髓細(xì)胞姊妹染色體交換〔SCE〕試驗(yàn)繁殖/生長發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)亞急性毒性合并繁殖/發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)一代繁殖試驗(yàn)神經(jīng)毒性篩選組合試驗(yàn)6化學(xué)品毒性鑒定工程的選擇原那么6.1試驗(yàn)工程的選擇應(yīng)當(dāng)根據(jù)化學(xué)品的理化特性，特別是通過對其化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系進(jìn)行初步分析，并盡量了解其使用范圍、生產(chǎn)或使用過程、人體接觸情況和現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，根據(jù)具體情況選擇系統(tǒng)的或補(bǔ)充的毒性試驗(yàn)。在化學(xué)品毒性鑒定過程中，根據(jù)各階段的試驗(yàn)結(jié)果，有針對性地取舍進(jìn)一步試驗(yàn)的工程和觀察指標(biāo)，以完善對該化學(xué)品所做出的毒性鑒定資料的科學(xué)性和可靠性。6.2受試樣品的染毒途徑應(yīng)與人體可能接觸的途徑一致，對人體有可能通過呼吸道、皮膚和消化道三種途徑接觸的化學(xué)品，應(yīng)進(jìn)行吸入、經(jīng)皮和經(jīng)口三種染毒途徑的各項(xiàng)試驗(yàn)；常溫下呈氣態(tài)的化學(xué)品一般不進(jìn)行經(jīng)口染毒途徑的各項(xiàng)試驗(yàn)；20℃蒸氣壓≤1×10-2Pa的非粉末狀化學(xué)品一般不需進(jìn)行吸入染毒途徑的各項(xiàng)試驗(yàn)。6.3對有可能與皮膚或眼睛接觸的化學(xué)品，應(yīng)進(jìn)行皮膚或眼刺激性試驗(yàn)；如化學(xué)品的pH≤2或≥11，那么不必進(jìn)行皮膚和粘膜的刺激試驗(yàn)，并認(rèn)為其對皮膚和眼有腐蝕作用。6.4對有可能與皮膚反復(fù)接觸的化學(xué)品，應(yīng)進(jìn)行皮膚致敏試驗(yàn)；經(jīng)皮毒性屬高毒以及對皮膚有腐蝕作用的化學(xué)品那么不進(jìn)行皮膚致敏試驗(yàn)。6.5我國首創(chuàng)或根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道首次生產(chǎn)的化學(xué)品，原那么上需進(jìn)行4個階段的毒理學(xué)試驗(yàn)。首先必須做急性毒性試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、三項(xiàng)致突變試驗(yàn)〔包括基因水平和染色體水平的體外、體內(nèi)試驗(yàn)〕、致畸試驗(yàn)和繁殖試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判斷是否需繼續(xù)做其它試驗(yàn)工程。6.6引進(jìn)國外的生產(chǎn)技術(shù)，生產(chǎn)國外已登記生產(chǎn)和批準(zhǔn)應(yīng)用的化學(xué)品，如國內(nèi)的生產(chǎn)單位能證明所生產(chǎn)化學(xué)品的理化性質(zhì)、純度、主要雜質(zhì)成分及含量均與國外同類化學(xué)品一致時，可先進(jìn)行第一階段和兩項(xiàng)致突變試驗(yàn)〔包括基因水平和染色體水平兩種類型的試驗(yàn)〕。如試驗(yàn)結(jié)果與國外同類化學(xué)品一致，可不繼續(xù)進(jìn)行第三階段和第四階段試驗(yàn)。6.7與國內(nèi)已獲批準(zhǔn)生產(chǎn)的化學(xué)品屬同類化學(xué)品的，如國內(nèi)的生產(chǎn)單位能證明所生產(chǎn)化學(xué)品的理化性質(zhì)、純度、主要雜質(zhì)成分及含量均與國內(nèi)同類化學(xué)品一致時，可先進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)和一項(xiàng)致突變試驗(yàn)。如試驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)同類化學(xué)品一致，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。6.8凡將兩種以上的化學(xué)品混配成新的制劑時，除必須按相應(yīng)要求對其成分分別進(jìn)行試驗(yàn)外，還應(yīng)進(jìn)行急性聯(lián)合毒性試驗(yàn)，如有明顯的協(xié)同作用，那么根據(jù)具體情況對該制劑進(jìn)行必要的其它毒性試驗(yàn)。6.9致突變試驗(yàn)的選擇原那么6.9.1進(jìn)行3項(xiàng)致突變試驗(yàn)的化學(xué)品，如2項(xiàng)或3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)進(jìn)行致癌試驗(yàn)。如僅1項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)增做另一項(xiàng)同類型的致突變試驗(yàn)，如結(jié)果仍為陽性，應(yīng)進(jìn)行致癌試驗(yàn)；如結(jié)果為陰性，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如3項(xiàng)結(jié)果均為陰性，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。6.9.2進(jìn)行2項(xiàng)致突變試驗(yàn)的化學(xué)品，如2項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)進(jìn)行第三階段和第四階段的相應(yīng)試驗(yàn)。如僅1項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)增做另一項(xiàng)同類型的致突變試驗(yàn)。如結(jié)果仍為陽性，應(yīng)進(jìn)行第三階段和第四階段的相應(yīng)試驗(yàn)；如結(jié)果為陰性，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如2項(xiàng)結(jié)果均為陰性，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。6.9.3進(jìn)行1項(xiàng)致突變試驗(yàn)的化學(xué)品，如試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)增做另一項(xiàng)同類型的致突變試驗(yàn)。如結(jié)果仍為陽性，應(yīng)進(jìn)行第三階段和第四階段的相應(yīng)試驗(yàn)。如結(jié)果為陰性，可不繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。7受試樣品的規(guī)定7.1受試樣品必須是按照既定的生產(chǎn)工藝和配方進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的產(chǎn)品，其成分和濃度與實(shí)際生產(chǎn)、經(jīng)營和使用的產(chǎn)品相同。7.2提供與受試樣品毒性有關(guān)的物理、化學(xué)性質(zhì)資料7.2.1化學(xué)名稱、CAS編號、結(jié)構(gòu)式7.2.2測定方法、純度、所含主要雜質(zhì)、光譜圖7.2.3性狀、氣味、穩(wěn)定性〔熱、空氣、光〕7.2.4密度、熔點(diǎn)〔℃〕、沸點(diǎn)〔℃〕、閃點(diǎn)、蒸氣壓〔Pa℃〕、外表張力〔N/M℃〕、水中溶解度〔mg/L℃〕、脂溶性〔mg/100g℃，說明溶劑種類〕、脂水分配系數(shù)〔說明溶劑種類〕、膨脹系數(shù)、爆炸極限、pH值、一定pH值下的水解情況7.3提供原料來源、生產(chǎn)工藝、人的可能攝入量、使用說明書等有關(guān)資料7.4對受試樣品的處理7.4.1受試樣品應(yīng)新鮮配制。除非有資料說明以溶液〔或乳濁液、懸濁液等〕保存具有穩(wěn)定性。固體受試樣品應(yīng)溶于或懸于適當(dāng)?shù)馁x形劑〔溶劑或載體〕中，并進(jìn)行稀釋。液體受試樣品可直接使用或稀釋后使用。根據(jù)受試樣品的理化性質(zhì)〔水溶性和/或脂溶性〕確定受試樣品所用的賦形劑。所用賦形劑在使用劑量水平對實(shí)驗(yàn)動物、菌株或細(xì)胞應(yīng)不產(chǎn)生毒作用，且不與受試樣品發(fā)生任何化學(xué)反響，并能保持受試樣品的穩(wěn)定性。通常用蒸餾水、等滲鹽水、植物油、食用淀粉、羧甲基纖維素等。如不是常用賦形劑，應(yīng)有參考資料說明其成份。7.4.2對膨脹系數(shù)較高的化學(xué)品應(yīng)考慮膨脹系數(shù)對試驗(yàn)結(jié)果的影響，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中的最高劑量應(yīng)為實(shí)驗(yàn)動物能夠耐受的最大染毒劑量，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定其它試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)，如最大染毒劑量未觀察到明顯毒性效應(yīng)，那么體內(nèi)致突變試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量均應(yīng)到達(dá)實(shí)驗(yàn)動物能夠耐受的最大染毒劑量。7.4.3如果將受試樣品摻入飼料或溶于飲水中進(jìn)行染毒，受試樣品在飼料或飲水中的含量應(yīng)恒定并進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。受試樣品的添加量不能破壞飼料中的營養(yǎng)平衡。實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，必須用減重法稱量每周的食物攝入量〔如果受試樣品是參加飲水中染毒的，也應(yīng)測量水的攝入量〕，并通過食物或飲水的消耗情況計(jì)算動物對受試樣品的攝入量。8應(yīng)客觀評價動物試驗(yàn)的結(jié)果，將其外推到人的意義是有限的。盡可能結(jié)合人群觀察資料，作出科學(xué)的綜合性評價。8.1在使用NOAEL或LOAEL等對化學(xué)品的平安性進(jìn)行評價時，可根據(jù)情況調(diào)整平安系數(shù)〔例如對于在試驗(yàn)或流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有致癌或致畸作用的化學(xué)品，平安系數(shù)可增大至100～1000。在制定工作場所空氣中化學(xué)品職業(yè)接觸限值〔OEL〕時，應(yīng)更注重流行病學(xué)調(diào)查資料，參考動物試驗(yàn)數(shù)據(jù)，一般以動物試驗(yàn)的NOAEL或LOAEL為基準(zhǔn)，平安系數(shù)可以小于20?？砂匆韵鹿接?jì)算得出各種衛(wèi)生限值。式中SF1×SF2×SF3……×SFn代表從各個角度考慮的平安系數(shù)，在計(jì)算ADI時一般以100作為平安系數(shù)〔SF=10(種屬差異)×10(個體差異)〕。8.2在應(yīng)用致突變試驗(yàn)結(jié)果篩選致癌物時，應(yīng)用以下計(jì)算式計(jì)算致突變性陽性結(jié)果預(yù)期致癌性的概率：式1適用于對同一種致突變試驗(yàn)結(jié)果的推算，式中＋和－為致突變試驗(yàn)結(jié)果的陽性數(shù)和陰性數(shù)；C＋和C－為致癌性的有和無。式2適用于對多種致突變試驗(yàn)結(jié)果的推算，要求各致突變試驗(yàn)是互相獨(dú)立的，一般認(rèn)為反映不同遺傳學(xué)終點(diǎn)的試驗(yàn)根本相互獨(dú)立，如多個試驗(yàn)的檢測終點(diǎn)為同一遺傳學(xué)終點(diǎn)，只能將其中一個試驗(yàn)的結(jié)果納入推算，如檢測終點(diǎn)相同的試驗(yàn)方法的結(jié)果既有陽性又有陰性，那么將呈陽性的試驗(yàn)方法的結(jié)果納入推算。設(shè)陽性結(jié)果有K個，相應(yīng)的靈敏度為a1，a2…aK(a=1-P(M/C))，相應(yīng)的特異度為a1,a2…aK(a=1-P同時設(shè)陰性結(jié)果有N個，相應(yīng)的靈敏度為d1，d2…dK(d=1-P(M/C))，相應(yīng)的特異度為d1,d2…dK(d=1-P式中PK〔M+/C+〕=a1×a2…×aKPK〔M+/C-〕=〔1-a1〕×〔1-a2〕…×〔1-aK〕PN〔M-/C-〕=d1×d2…×dKPN〔M-/C+〕=〔1-d1〕×〔1-d2〕…×〔1-dK〕當(dāng)估算結(jié)果≥0.5時應(yīng)考慮進(jìn)行動物致癌試驗(yàn)，概率越高，進(jìn)行動物致癌試驗(yàn)的必要性越大。當(dāng)P〔C+/M+〕≤0.03時，如沒有理由認(rèn)為該化學(xué)品屬于非遺傳致癌物，可暫不考慮進(jìn)行動物致癌試驗(yàn)。8.3在對化學(xué)品的致畸性進(jìn)行評價時，我國常用致畸指數(shù)〔雌鼠LD50/最小致畸劑量〕和致畸危害指數(shù)〔最大不致畸劑量/最大可能攝入量〕，并按照計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分級，但由于不同化學(xué)品的急性致死劑量-反響關(guān)系曲線的情況不一，所以，可換用LD1、LD5或以雌鼠體重降低〔與對照組相比降低一定的百分比〕的劑量，目前推薦以BMD和平安系數(shù)對化學(xué)品的致畸性進(jìn)行評價。8.4由于誘癌作用無閾值，因此，在對化學(xué)品的致癌危險度進(jìn)行評定時采用實(shí)際平安劑量，即化學(xué)品引起致癌率有99%的把握低于10-6的劑量水平。9對化學(xué)品毒性鑒定機(jī)構(gòu)的要求從事化學(xué)品毒性鑒定的機(jī)構(gòu)應(yīng)符合?化學(xué)品毒性鑒定管理標(biāo)準(zhǔn)?中“化學(xué)品毒性鑒定實(shí)驗(yàn)室條件及工作準(zhǔn)那么〔GLP〕〞的各項(xiàng)要求，并根據(jù)獲得資質(zhì)的等級從事相應(yīng)工程的化學(xué)品毒性鑒定工作。10對實(shí)驗(yàn)動物及動物實(shí)驗(yàn)室的要求10.1對實(shí)驗(yàn)動物的要求10.1.1實(shí)驗(yàn)動物的根本選擇原那么10.1.1.1必須使用具有合格證的實(shí)驗(yàn)動物〔尚未實(shí)行等級管理的動物種屬除外〕。10.1.1.2應(yīng)盡量選用各項(xiàng)試驗(yàn)的首選動物，如選擇其他種屬應(yīng)說明原因并確定該種屬對所檢測的毒性作用敏感。10.1.2動物試驗(yàn)的一般要求〔某些試驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)動物有特殊要求，那么以試驗(yàn)方法中所列的要求為準(zhǔn)〕：10.1.2.1用于同一項(xiàng)試驗(yàn)的同性別動物，在進(jìn)行試驗(yàn)前個體之間的體重相差最多不超過20%。10.1.2.2雌性動物一般應(yīng)為未交配過的。10.1.2.3實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中需適應(yīng)至少3～5天后才能開始染毒。10.1.2.4在同一次試驗(yàn)中需屢次進(jìn)行經(jīng)口染毒時，至少每周對受試動物進(jìn)行稱重并根據(jù)體重調(diào)整每只動物的染毒體積。10.1.3動物福利要求應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)動物的使用量，同時為實(shí)驗(yàn)動物提供足夠的空間，以供動物采取正常的適應(yīng)姿勢，并且能夠有適當(dāng)?shù)囊苿幼杂?；?yīng)提供足夠的合格飼料和飲水；在試驗(yàn)過程中應(yīng)盡量減輕動物的痛苦，不得虐待動物。10.2進(jìn)行各項(xiàng)動物試驗(yàn)的動物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家法律法規(guī)的有關(guān)規(guī)定并獲得主管部門頒發(fā)的合格證。10.3用于動物試驗(yàn)的飼料、飲水、墊料、籠具等應(yīng)符合國家法律法規(guī)的有關(guān)規(guī)定〔飼料應(yīng)具有主管部門頒發(fā)的合格證〕。10.4實(shí)驗(yàn)動物管理及從事動物試驗(yàn)的人員，必須經(jīng)培訓(xùn)、考核，持證上崗。11鑒定報告內(nèi)容11.1受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度、經(jīng)口染毒需注明染毒體積。11.2體內(nèi)試驗(yàn)需注明：實(shí)驗(yàn)動物的種屬、品系和來源〔注明合格證號和動物級別〕、性別、體重范圍〔周齡〕、單籠喂養(yǎng)還是群飼；實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源〔如非標(biāo)準(zhǔn)飼料，應(yīng)注明飼料的配方〕、室溫、相對濕度，動物實(shí)驗(yàn)室和飼料的合格證號；劑量設(shè)計(jì)和動物分組方法，每組所用動物性別、數(shù)量及初始體重范圍。11.3體外試驗(yàn)需注明：使用的菌株或細(xì)胞種類、使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、代謝活化系統(tǒng)；劑量水平、對照組設(shè)置、陽性物種類和劑量。11.4主要操作步驟〔如為吸入染毒應(yīng)注明染毒設(shè)備中的氣流速度等參數(shù)〕。11.5各項(xiàng)檢測指標(biāo)的測定方法及主要檢測儀器的名稱和型號。11.6檢測結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法以及各項(xiàng)參數(shù)的計(jì)算方法。11.7體內(nèi)試驗(yàn)需描述染毒后動物中毒表現(xiàn)及出現(xiàn)時間和恢復(fù)情況、死亡時間、大體解剖和尸檢所見，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查的需描述觀察結(jié)果。11.8列表報告各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果〔一般以的形式表達(dá)〕，并列出經(jīng)計(jì)算所得的毒理學(xué)參數(shù)。11.9結(jié)論。

第一階段試驗(yàn)

急性吸入毒性試驗(yàn)AcuteInhalationToxicityTest1范圍本方法規(guī)定了動物急性吸入毒性試驗(yàn)的根本原那么、技術(shù)和要求。本方法適用于評價氣體、揮發(fā)性物質(zhì)或氣溶膠/顆粒物等化學(xué)品的急性吸入毒性作用。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelineforTestingofChemicals(No.403.Feb.1981)OECDGuidelineforTestingofChemicals(No.433.Feb.2002)3試驗(yàn)?zāi)康?.1檢測化學(xué)品對實(shí)驗(yàn)動物的急性吸入毒性作用和強(qiáng)度。3.2為亞急(慢)性等吸入毒性試驗(yàn)提供劑量選擇的依據(jù)。4定義4.1急性吸入毒性(AcuteInhalationToxicity):實(shí)驗(yàn)動物短時間〔24h內(nèi)〕持續(xù)吸入一種可吸入性受試樣品后，在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。指在內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入受試樣品引起受試動物發(fā)生死亡的概率為50%的濃度。以單位體積空氣中受試樣品的質(zhì)量(mg/m3)來表示。劑量-反響關(guān)系(Dose-responseRelationship)：表示化學(xué)毒物的劑量與某一群體中質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生率之間的關(guān)系。5試驗(yàn)根本原那么各試驗(yàn)組動物在一定時間內(nèi)吸入不同濃度的受試樣品，染毒濃度的選擇可通過預(yù)試驗(yàn)確定。染毒后觀察動物的毒性反響和死亡情況。試驗(yàn)期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢，試驗(yàn)結(jié)束時仍存活的動物要處死并進(jìn)行大體解剖。6試驗(yàn)方法6.1實(shí)驗(yàn)動物首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別各劑量組個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗(yàn)前動物要在試驗(yàn)環(huán)境中至少適應(yīng)3～5d時間。6.2劑量設(shè)計(jì)根據(jù)所選方法的要求，原那么上應(yīng)設(shè)4～5個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進(jìn)行預(yù)試。如果受試樣品毒性很低，也可采用一次限量法，即用20只動物〔雌雄各半〕，10000mg/m3吸入2h或5000mg/m3吸入4h，如未引起動物死亡，那么不再進(jìn)行多個劑量的急性吸入毒性試驗(yàn)。6.3染毒染毒可采用靜式染毒法或動式染毒法。6.3.1受試樣品并使其揮發(fā)，造成試驗(yàn)需要的受試樣品濃度的空氣，一次吸入性染毒2h。6.3.1.1染毒柜的容積以每只染毒小鼠每小時不少于3L空氣計(jì)，每只大鼠每小時不少于30L計(jì)。6.3.1.2～次，求其平均濃度。在無適當(dāng)測試方法時。可用下式計(jì)算染毒濃度C=(a×d/v)×106式中： C--染毒濃度(mg/m3) a--參加受試樣品的量(ml) d--化學(xué)品密度 v--染毒柜容積(L)6.3.2動式染毒法動式染毒是采用機(jī)械通風(fēng)裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度受試樣品的空氣均勻不斷地送入染毒柜，空氣交換量大約為12～15次/h，并排出等量的染毒氣體，維持相對穩(wěn)定的染毒濃度〔對通過染毒柜的流動氣體應(yīng)不間斷地進(jìn)行監(jiān)測，并至少記錄2次〕。一次吸入性染毒2h。當(dāng)受試化合物需要特殊要求時，應(yīng)用其它的氣流速率。染毒時，染毒柜內(nèi)應(yīng)確保至少有19%的氧含量和均衡分配的染毒氣體。一般情況下，為確保染毒柜內(nèi)空氣穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)動物的體積不應(yīng)超過染毒柜體積的5%。且染毒柜內(nèi)應(yīng)維持微弱的負(fù)壓，以防受試樣品泄露污染周圍環(huán)境。同時，應(yīng)注意防止受試樣品爆炸。6.3.2.1受試樣品氣化〔霧化〕和輸入的常用方法6.3.2.1.1氣體受試樣品，經(jīng)流量計(jì)與空氣混合成一定濃度后，直接輸人染毒柜。6.3.2.1.2易揮發(fā)液體受試樣品，通過空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使揮發(fā)后輸人染毒柜。6.3.2.1.3假設(shè)受試樣品現(xiàn)場使用時采取噴霧法時，可采用噴霧器或超聲霧化器使其霧化后輸入染毒柜。6.3.2.2染毒濃度計(jì)算染毒濃度一般應(yīng)采用動物呼吸帶實(shí)際測定濃度，每半小時一次，取其平均值。各測定濃度值應(yīng)在其平均值的25%以內(nèi)。假設(shè)無適當(dāng)?shù)臏y試方法，也可采用以下公式計(jì)算染毒濃度：C=[a×d/(v1+v2)]×106式中：C--染毒濃度(mg/m3)a--氣化或霧化受試樣品的量(ml)d--受試樣品密度v1--輸入染毒柜風(fēng)量(L)v2--染毒柜容積(L)6.5試驗(yàn)結(jié)果評價評價試驗(yàn)結(jié)果時，應(yīng)將LC50與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見相結(jié)合考慮，LC50值是受試樣品急性毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識以及判定受試樣品經(jīng)呼吸道吸入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LC50值時一定要注明所用實(shí)驗(yàn)動物的種屬、性別、染毒方式及時間長短、觀察期限等。評價應(yīng)包括動物接觸受試樣品與動物異常表現(xiàn)〔包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其它毒性作用〕的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。急性吸入毒性分級見附錄1-C。7鑒定報告 鑒定報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：7.1受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；7.2動式染毒設(shè)備中的氣流速度；7.3實(shí)驗(yàn)動物的種屬、品系和來源〔注明合格證號和動物級別〕;7.4實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實(shí)驗(yàn)室合格證號；7.5所用染毒濃度和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；7.6計(jì)算LC50的方法；7.7染毒后動物中毒表現(xiàn)及出現(xiàn)時間和恢復(fù)情況、死亡時間、大體解剖所見；7.8列表報告結(jié)果〔建議的表格形式見附錄1-D〕，計(jì)算的LC50及其95%可信區(qū)間；7.9結(jié)論。8試驗(yàn)結(jié)果的解釋通過LC50的測定，可評價受試樣品的急性吸入毒性及其毒性分級(見附錄1-C),但其結(jié)果外推到人類的有效性是有限的。

急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)AcuteDermalToxicityTest1范圍本方法規(guī)定了動物急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)的根本原那么、技術(shù)和要求。本方法適用于評價化學(xué)品的急性經(jīng)皮毒性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGUIDELINEFORTESTINGCHENICALS〔No.402.1995〕USEPAOPPTISHealthEffects(Series870.1200June1996)3試驗(yàn)?zāi)康拇_定受試樣品能否經(jīng)皮膚吸收和短期經(jīng)皮染毒所產(chǎn)生的毒性作用和強(qiáng)度，并為確定亞急〔慢〕性經(jīng)皮毒性及其它試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供試驗(yàn)依據(jù)。4定義4.1急性經(jīng)皮毒性(AcuteDermalToxicity):受試樣品一次或在24h內(nèi)屢次經(jīng)皮膚染毒所產(chǎn)生的健康損害效應(yīng)。4.2經(jīng)皮半數(shù)致死劑量〔DermalMedianLethalDose〕:一次或在24h內(nèi)屢次經(jīng)皮膚染毒受試樣品引起50%實(shí)驗(yàn)動物死亡的劑量，以mg/kgbw表示。劑量-反響關(guān)系(Dose-responseRelationship)：表示化學(xué)毒物的劑量與某一群體中質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生率之間的關(guān)系。5試驗(yàn)根本原那么在試驗(yàn)前，先去除實(shí)驗(yàn)動物受試部位的被毛。將實(shí)驗(yàn)動物分成假設(shè)干劑量組，每組涂布不同劑量的受試樣品，而后觀察實(shí)驗(yàn)動物中毒反響和死亡情況，計(jì)算LD50。對試驗(yàn)中死亡的動物做大體解剖和病理學(xué)檢查，對試驗(yàn)結(jié)束時的存活動物也應(yīng)做大體解剖。注意排除受試樣品引起的皮膚局部刺激或腐蝕作用所致的全身效應(yīng)。6試驗(yàn)方法6.1受試樣品配制固體受試樣品應(yīng)研磨，過100目篩。用適量無毒無刺激性賦形劑混勻，以保證受試樣品與皮膚良好的接觸。常用的賦形劑有水、植物油、凡士林、羊毛脂等。液體受試樣品一般不必稀釋，可直接用原液試驗(yàn)。6.2實(shí)驗(yàn)動物首選大鼠，也可選用豚鼠或家兔。實(shí)驗(yàn)動物體重要求范圍分別為：大鼠200～300g，豚鼠350～450g，家兔2000～3000g。試驗(yàn)期間，為防止實(shí)驗(yàn)動物相互抓撓，應(yīng)采用單籠喂養(yǎng)。試驗(yàn)前24h，在動物背部正中線兩側(cè)剪毛或剃毛，仔細(xì)檢查皮膚，要求完整無損，以免改變皮膚的通透性。去毛面積不應(yīng)少于實(shí)驗(yàn)動物體外表積的10%。各類動物體外表積的數(shù)值和計(jì)算方法見附錄1-E。6.3劑量和分組實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4～5個劑量組。假設(shè)使用水、植物油、凡士林、羊毛脂外的賦形劑，那么需設(shè)賦形劑對照組。豚鼠或大鼠每一劑量組〔單性別〕不少于5只；家兔每一劑量組〔單性別〕不少于4只。各劑量組間要有適當(dāng)?shù)慕M距，可按等比或等差級設(shè)置劑量，以使各劑量組實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的毒性反響和死亡率呈現(xiàn)劑量-反響〔效應(yīng)〕關(guān)系。一般情況下，如果劑量到達(dá)2000mg/kgbw仍不出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物死亡時，那么不需要再進(jìn)行高劑量試驗(yàn)。6.4試驗(yàn)步驟選擇適當(dāng)方法固定好實(shí)驗(yàn)動物，將受試樣品均勻涂布于實(shí)驗(yàn)動物的去毛區(qū)，并用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以保證受試樣品和皮膚的密切接觸，防止脫落和動物舔食受試樣品。涂布4h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當(dāng)?shù)娜軇┫慈テつw上殘留的受試樣品。6.5全面觀察中毒的發(fā)生、開展過程和規(guī)律以及中毒特點(diǎn)和毒作用的靶器官，7試驗(yàn)結(jié)果評價按附錄1-B計(jì)算LD50，按附錄1-C進(jìn)行急性經(jīng)皮毒性分級。8鑒定報告鑒定報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：8.1實(shí)驗(yàn)動物種屬品系、來源、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料和飲水；8.2按劑量組列表(見附表1-D)說明每組動物數(shù)、性別狀況、出現(xiàn)毒效應(yīng)的動物數(shù)、死亡動物數(shù)；8.3染毒時間、染毒持續(xù)時間、染毒后動物中毒的主要表現(xiàn)；8.4LD50計(jì)算方法；8.5LD50值及其95%可信區(qū)間〔包括雌、雄實(shí)驗(yàn)動物各自的LD50〕；8.6病理組織學(xué)檢查結(jié)果；8.7結(jié)論。9試驗(yàn)結(jié)果的解釋經(jīng)皮LD50是評價化學(xué)物急性毒性的重要參數(shù)之一，也是急性毒性分級的依據(jù)。但LD50僅表示受試樣品經(jīng)皮吸收引起實(shí)驗(yàn)動物死亡50%的劑量，并不能全面反映受試樣品經(jīng)皮吸收的所有急性毒性特征，因此，評價一受試樣品經(jīng)皮急性毒性既要考慮其對某一品系實(shí)驗(yàn)動物的經(jīng)皮LD50值，又要考慮其中毒病癥表現(xiàn)及反響出現(xiàn)的早晚和持續(xù)時間的長短，并結(jié)合體重變化與病理學(xué)檢查結(jié)果等，經(jīng)綜合分析才能得出經(jīng)皮急性毒性較為全面的評價。

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)AcuteOralToxicityTest1范圍本方法規(guī)定了動物急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的根本原那么、技術(shù)和要求。本方法適用于評價化學(xué)品的急性毒性作用。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelineforTestingofChemicals(No.401.Feb.1987)OECDGuidelineforTestingofChemicals(No.425.Feb.2001)USEPAOPPTISHealthEffectsGuideline(Series870.1100June1996)3試驗(yàn)?zāi)康?.1檢測化學(xué)品對實(shí)驗(yàn)動物的急性毒性作用和強(qiáng)度。3.2為亞急(慢)性等毒性試驗(yàn)提供劑量選擇的依據(jù)。3.3試驗(yàn)結(jié)果可作為化學(xué)品急性毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識。４定義4.1急性經(jīng)口毒性(AcuteOralToxicity):一次或在24h內(nèi)屢次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動物受試樣品后，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量。以單位體重接受受試樣品的質(zhì)量(mg/kgbw或g/kgbw)來表示。劑量-反響關(guān)系(Dose-responseRelationship)：表示化學(xué)毒物的劑量與某一群體中質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生率之間的關(guān)系。5試驗(yàn)根本原那么以經(jīng)口灌胃法給予各試驗(yàn)組動物不同劑量的受試樣品，每組用一個劑量，染毒劑量的選擇可通過預(yù)試驗(yàn)確定。染毒后觀察動物的毒性反響和死亡情況。試驗(yàn)期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢，試驗(yàn)結(jié)束時仍存活的動物要處死并進(jìn)行大體解剖。本方法主要適用于嚙齒類動物的研究，但也可用于非嚙齒類動物的研究。6試驗(yàn)方法6.1受試樣品的處理受試樣品應(yīng)溶解或懸浮于適宜的賦形劑中，〔不溶性固體或顆粒狀物質(zhì)研磨、過100目篩〕建議首選水或食用植物油〔如玉米油〕作溶劑，也可考慮使用其它賦形劑〔如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等〕等配成混懸液；不能配制成混懸液時，可配制成其它形式(如糊狀物等)，但不能采用具有明顯毒性的有機(jī)化學(xué)溶劑。如采用有毒性的溶劑應(yīng)單設(shè)溶劑對照組觀察。6.2實(shí)驗(yàn)動物首選健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g)，也可選用其它敏感動物。同性別實(shí)驗(yàn)動物個體間體重相差不得超過平均體重的20%。試驗(yàn)前動物要在試驗(yàn)環(huán)境中至少適應(yīng)3～5d時間。6.3劑量設(shè)計(jì)根據(jù)所選方法的要求，原那么上應(yīng)設(shè)4～5個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進(jìn)行預(yù)試。如果受試樣品毒性很低，也可采用最大限量法，即用20只動物〔雌雄各半〕，采用5000mg/kgbw劑量，如未引起動物死亡，可不再進(jìn)行多個劑量的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。6.4試驗(yàn)步驟6.4.1試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)禁食〔一般16h左右〕，不限制飲水。假設(shè)采用代謝率高的其它動物，禁食時間可以適當(dāng)縮短。6.4.2正式試驗(yàn)時，稱量動物體重，隨機(jī)分組，然后對各組動物用經(jīng)口灌胃法一次染毒。用容量為10ml/kgbw。假設(shè)一次給予容量太大，也可在24ｈ內(nèi)分2～3次染毒〔每次間隔4h～6h〕，但合并作為一次劑量計(jì)算。染毒后繼續(xù)禁食3h～4h。假設(shè)采用分批屢次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時可給動物一定量的食物和水。6.4.3觀察并記錄染毒過程和觀察期內(nèi)的動物的中毒和死亡情況。觀察期限一般為14d，觀察指標(biāo)、LD50的計(jì)算及試驗(yàn)記錄形式分別見附錄1-A、1-B、1-D。對死亡動物進(jìn)行尸檢。觀察期結(jié)束后，處死存活動物并進(jìn)行大體解剖，如有必要，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。6.5可采用多種方法測定LD50，建議采用霍恩氏法、寇氏法、概率單位-對數(shù)圖解法、最大耐受量試驗(yàn)和上-下法等(見附錄1-B)。7鑒定報告鑒定報告應(yīng)包括如下內(nèi)容：7.1受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；7.2實(shí)驗(yàn)動物的種屬、品系和來源〔注明合格證號和動物級別〕;7.3實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、動物實(shí)驗(yàn)室合格證號；7.4所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；7.5染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；7.6計(jì)算LD50的方法及其LD50和95%可信限；7.7列表報告結(jié)果〔建議的表格形式見附錄D〕；7.8結(jié)論。通過急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和LD50的測定可評價受試樣品的急性經(jīng)口毒性、急性經(jīng)口毒性分級，其結(jié)果外推到人類的有效性很有限。

急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)AcuteEyeIrritation/CorrosionTest1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物急性眼刺激/腐蝕性試驗(yàn)的根本原那么、要求和方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測化學(xué)物的眼睛刺激性/腐蝕性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No405，F(xiàn)eb.1987)USEPAOPPTSHealthEffectsTestGuidelines(Series870.2400,Aug.1998)3試驗(yàn)?zāi)康拇_定評價化學(xué)物對哺乳動物眼睛是否有刺激作用/腐蝕作用及其程度。4定義4.1眼睛刺激性(EyeIrritation)：指眼球外表接觸受試樣品后產(chǎn)生的可逆性炎性變化。4.2眼睛腐蝕性(EyeCorrosion)：指眼球外表接觸受試樣品后引起的不可逆性組織損傷。5試驗(yàn)根本原那么5.1 受試樣品以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動物的一側(cè)眼睛結(jié)膜囊內(nèi)，以未作處理的另一側(cè)眼睛作為自身對照；5.2 在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評價受試樣品對眼睛的刺激作用。觀察時間應(yīng)能足以評價刺激效應(yīng)的可逆性和不可逆性。觀察時間最少72h，但一般不超過21d；5.3 當(dāng)動物出現(xiàn)嚴(yán)重和持久的痛苦跡象時，以適當(dāng)?shù)姆绞綄游锾幩溃?.4 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于其可預(yù)見的腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)；5.5 已在皮膚試驗(yàn)中證實(shí)具有腐蝕或嚴(yán)重刺激毒性的物質(zhì)不必進(jìn)行眼刺激試驗(yàn)，可以推測該物質(zhì)對眼睛將會引起相似的嚴(yán)重結(jié)果；5.6 在充分并公認(rèn)的體外試驗(yàn)結(jié)果中確定可能產(chǎn)生刺激性或腐蝕性的物質(zhì)不必進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。6試驗(yàn)方法6.1受試樣品：液體、固體或半固體、顆粒物。6.2實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境6.2.1動物種屬首選健康成年白色家兔，體重2～3kg。如果使用其它的哺乳動物做試驗(yàn)，試驗(yàn)者應(yīng)提供選擇的依據(jù)。6.2.2動物數(shù)量如果受試樣品的顯著效應(yīng)是可預(yù)見的，可以考慮用一只動物。如果用一只動物試驗(yàn)得出的結(jié)果提示受試樣品有嚴(yán)重的刺激性和腐蝕性，那么不必進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。如果結(jié)果相反，那么至少需要3只家兔。有時，在增加動物的進(jìn)一步試驗(yàn)中應(yīng)該適當(dāng)?shù)恼f明可疑反響。6.2.3飼養(yǎng)環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。6.3劑量設(shè)計(jì)對于液態(tài)受試樣品，一般不需稀釋，可直接使用原液，染毒量為0.1ml。假設(shè)受試樣品為固態(tài)或顆粒狀，應(yīng)將其研磨成細(xì)粉狀，過200目篩，染毒量應(yīng)為100mg。氣溶膠產(chǎn)品需噴至容器中，收集其液體再使用。對揮發(fā)性物質(zhì)，劑量可以通過使用前后稱量容器質(zhì)量進(jìn)行估計(jì)。6.4試驗(yàn)步驟6.4.1試驗(yàn)前眼睛的檢查試驗(yàn)前動物要在動物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中至少適應(yīng)3d時間。試驗(yàn)前24h，要對實(shí)驗(yàn)動物的兩只眼睛進(jìn)行常規(guī)檢查。有眼睛刺激病癥、角膜缺陷或結(jié)膜損傷的動物不能用于試驗(yàn)。6.4.2染毒6.4.2.1輕輕拉開實(shí)驗(yàn)動物一側(cè)眼睛的下眼瞼，將受試樣品0.1ml(100mg)滴入(或放入)結(jié)膜囊中，使上、下眼簾被動閉合1s，以防止受試樣品喪失。未處理的另一側(cè)眼睛作為自身對照。6.4.2.2滴入受試樣品24h內(nèi)不沖洗眼睛，如果認(rèn)為必要，在24h時可進(jìn)行沖洗。6.4.2.3如果受試樣品有明顯的刺激征象，另選3只動物進(jìn)行沖洗試驗(yàn)。在滴入受試樣品30s后，用生理鹽水沖洗5min，水的流量和流速都不應(yīng)導(dǎo)致眼損傷。6.4.3觀察周期觀察時間最少要72h，也不能嚴(yán)格固定不變，但必須足夠以充分評估觀察到的可逆或不可逆效應(yīng)。通常觀察時間一般不超過21d。6.4.4臨床檢查和評分6.4.4.1在滴入受試樣品后的第1h，24h，48h,72h和96h對眼睛進(jìn)行檢查，如果72h時未出現(xiàn)刺激反響，可終止試驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)累及角膜或有其它眼刺激作用，7d內(nèi)不恢復(fù)者，為確定該損害的可逆性或不可逆性需延長觀察時間，一般不超過21d。除了對角膜、虹膜、結(jié)膜進(jìn)行觀察外，其它損害效應(yīng)都應(yīng)記錄并報告。在24h觀察和記錄結(jié)束后，可使用熒光素鈉對所有動物的眼睛作進(jìn)一步檢查。在每次檢查中均應(yīng)按表1記錄眼的刺激反響，并按表2進(jìn)行眼刺激強(qiáng)度評價。6.4.4.2在進(jìn)行檢查時，可使用放大鏡、手持裂隙燈，并按表3記錄表1眼各部位損傷評分表部位及損傷情況積分角膜A．混濁程度(以最致密部位為準(zhǔn))無混濁0散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1半透明區(qū)易分辨，虹膜輕度模糊不清2出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜模糊不清，瞳孔大小勉強(qiáng)可見3角膜混濁，虹膜無法識別4B．角膜受損范圍＜1/411/4～l/221/2～3/433/4～14積分A×B×5最高積為80虹膜正常0皺褶明顯加深、充血、水腫、角膜周圍有充血(出現(xiàn)任何一項(xiàng)或任何二項(xiàng))，對光反響遲鈍1對光反響消失、出血、肉眼可見嚴(yán)重?fù)p傷(出現(xiàn)其中一項(xiàng)或全部)2積分×5最高積分為10結(jié)膜A.充血，指瞼結(jié)膜(包括角膜、虹膜的球結(jié)膜局部)血管正常0血管充血，呈鮮紅色1血管充血，呈深紅色，個別血管難以識別2彌漫性充血，呈深紫紅色3B.水腫無水腫0輕微水腫伴局部眼瞼外翻1明顯水腫伴局部眼瞼外翻2水腫至眼瞼近半閉合3水腫至眼瞼超過半閉合4C．分泌物無0少量分泌物(不包括動物內(nèi)眥少量分泌物)1分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著3積分(A+B+C)×2最高積分為20角膜、虹膜和結(jié)膜反響累加最高積分為110表2眼刺激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)染毒后前4天最高總積分平均值刺激反響持續(xù)時間〔總積分平均值〕刺激強(qiáng)度0～第1d≥0無刺激性2.5～第2d≥0輕刺激性15～第4d=0輕刺激性第4d＞0中度刺激性25～第7d≤20，半數(shù)以上動物第7d≤10中度刺激性第7d≤20，半數(shù)以上動物第7d＞10,但是無任何一只動物7d＞30中度刺激性第7d≤20，半數(shù)以上動物第7d＞10,而且有一只動物7d＞30重度刺激性第7d＞20重度刺激性50～重度刺激性表3裂隙燈觀察眼刺激反響評分標(biāo)準(zhǔn)角膜損傷積分虹膜積分1．水腫1.前房(auteriorChamber)A．區(qū)域A．細(xì)胞數(shù)＜1/41很少量11/4～1/22中等數(shù)21/2～3/43很多33/4～14B．閃光(flare)輕微1B．致密度中等2上皮水腫加上基質(zhì)輕微水腫1明顯3正常角膜的1．5倍厚22．虹膜正常角膜的2倍厚3A．虹膜充血整個角膜不透明4輕度1中度22．角膜熒光素鈉著色明顯3A．散點(diǎn)狀著色B．瞳孔對光反響＜1/41遲鈍11/4～1/22消失21/2～3/43虹膜總分113/4～14眼瞼和結(jié)膜損傷積分1．充血輕度1B．融合著色中度2＜1/41明顯31/4～1/222．水腫輕度11/2～3/43中度23/4～14明顯33．著色輕(1／3)13．角膜血管化、疤痕、色素沉著中等(1／3-2/3)2A．范圍(環(huán)狀面)大范圍(2／3-1)3＜1/414.潰瘍輕度11/4～1/22中度21/2～3/43明顯33/4～145．疤痕輕度1中等24.角膜穿孔4明顯3角膜總分20眼險和結(jié)膜總分156.5結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評價6.5.1數(shù)據(jù)匯總數(shù)據(jù)應(yīng)以表格形式匯總，記錄觀察期內(nèi)每只動物的刺激評分，直到病癥消失或21d試驗(yàn)結(jié)束。詳細(xì)描述刺激的程度和性質(zhì)，嚴(yán)重?fù)p害的出現(xiàn)，以及觀察到的除眼以外的任何效應(yīng)。按表4進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。表4家兔眼刺激試驗(yàn)結(jié)果*動物編號部位眼刺激性反響積分1h24h48h72h第4d第7d樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照1結(jié)膜虹膜角膜總分2結(jié)膜虹膜角膜總分3結(jié)膜虹膜角膜總分4結(jié)膜虹膜角膜總分總積分平均值*實(shí)驗(yàn)條件：不沖洗/30秒后沖洗6.5.2結(jié)果的評價眼刺激評分應(yīng)與觀察到的反響的性質(zhì)和可逆性或其它方面結(jié)合進(jìn)行評價。單獨(dú)的積分值不能作為受試樣品的刺激性質(zhì)的最后評判，應(yīng)將所有觀察結(jié)果及各種因素進(jìn)行綜合評價。7鑒定報告除一般鑒定報告的內(nèi)容外，還應(yīng)包括以下方面：7.1表格記錄每只動物每個時間點(diǎn)〔如1h,24h,48h，72h和4d,7d〕的刺激反響；7.2具體描述除眼部以外的其它作用；7.3刺激／腐蝕程度和性質(zhì)的描述；7.4描述在各觀察時點(diǎn)積分時的檢查方法〔如裂隙燈、生物顯微鏡、熒光素染色〕；7.5結(jié)論。8試驗(yàn)結(jié)果的解釋急性眼刺激試驗(yàn)結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。假設(shè)用其它品系動物進(jìn)行試驗(yàn)時也得到類似結(jié)果，那么會增加從動物外推到人的可靠性。

皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)DermalIrritation/CorrosionTest1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物皮膚刺激/腐蝕性試驗(yàn)的根本原那么、要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測化學(xué)品對皮膚的刺激性/腐蝕性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.404，July.1992)USEPAOPPTSHealthEffectsTestGuidelines(Series870.2500,Aug.1998)3試驗(yàn)?zāi)康拇_定化學(xué)物對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)化學(xué)物對皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)。4定義4.1皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。4.2皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。5試驗(yàn)根本原那么5.1將受試樣品一次〔或?qū)掖巍惩俊卜蟆秤诮】禑o破損的皮膚上，并作自身對照〔除非疑心有嚴(yán)重的刺激/腐蝕并逐漸開展〕；5.2在規(guī)定時間間隔內(nèi)觀察和評價刺激反響的程度，并作詳細(xì)的記錄。觀察時間應(yīng)足夠進(jìn)行可逆或不可逆效應(yīng)的觀察，以便進(jìn)行完整的評價，但一般不超過14天；5.3強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預(yù)見其腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)；5.4假設(shè)受試樣品有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性〔LD50≤200mg/kgbw〕的物質(zhì)不必進(jìn)行本試驗(yàn)；5.5在充分并公認(rèn)的體外試驗(yàn)結(jié)果中確定可能產(chǎn)生腐蝕或刺激毒性的物質(zhì)不必進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。如果從受試樣品的結(jié)構(gòu)活性構(gòu)效關(guān)系可以預(yù)見潛在的腐蝕毒性，那么不必做本試驗(yàn)。6試驗(yàn)方法6.1受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實(shí)際應(yīng)用濃度。固體受試樣品經(jīng)研磨粉碎，過100目篩，然后用水或適當(dāng)?shù)馁x形劑〔如凡士林、阿拉伯樹膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等〕按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。當(dāng)使用賦形劑時，要考慮賦形劑對受試樣品皮膚刺激效應(yīng)的影響，使用的賦形劑既不能改變受試樣品的吸收、分布、代謝、蓄積或化學(xué)性質(zhì)，也不能增強(qiáng)、減弱或改變它的毒性特征。6.2實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。如果使用其他的哺乳動物做試驗(yàn)，試驗(yàn)者應(yīng)提供選擇的依據(jù)。至少需要4只健康成年動物〔雄性和/或雌性均可〕，除非提供選擇較少動物的依據(jù)。推薦使用逐步接觸法〔見6.4.2〕，以便說明可疑反響。每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動物要在動物實(shí)驗(yàn)室中至少適應(yīng)3d時間。實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。6.3劑量設(shè)計(jì)受試樣品0.5m1(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試驗(yàn)的一致性，測試面積應(yīng)力求相等。6.4試驗(yàn)步驟6.4.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備試驗(yàn)前24h，將實(shí)驗(yàn)動物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進(jìn)行試驗(yàn)。不應(yīng)在長有濃密島狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗(yàn)。6.4.2染毒取受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布〔2.5cm×2.5cm〕和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封閉試驗(yàn)，敷用時間為4h。試驗(yàn)結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑去除殘留受試樣品。如疑心受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗(yàn)，將三個涂布受試樣品的紗布塊同時或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點(diǎn)出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗(yàn)。6.4.3觀察期限觀察時間確實(shí)定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。于去除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反響，按表1進(jìn)行皮膚反響評分，以受試動物積分的平均值進(jìn)行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點(diǎn)最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。表1皮膚刺激反響評分皮膚反應(yīng)積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑〔僅僅可覺察到〕1明顯紅斑2中等程度到重度程度紅斑3嚴(yán)重紅斑〔輕微的結(jié)痂〕至輕度焦痂〔深度損傷〕4水腫形成無水腫0很輕微水腫〔僅僅可覺察到〕1輕微水腫〔腫起部位邊界清楚〕2中度水腫〔隆起約lmm〕3嚴(yán)重水腫〔隆起約lmm，超出染毒部位〕4表2皮膚刺激強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)積分均值*強(qiáng)度分級0～無刺激性0.5～輕刺激性2.0～中等刺激性6.0～強(qiáng)刺激性*指觀察時點(diǎn)的最高積分均值6.5結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評價:數(shù)據(jù)應(yīng)以表3形式匯總。皮膚刺激評分應(yīng)與觀察到的反響的性質(zhì)和可逆性或其它方面綜合進(jìn)行評價。單獨(dú)的積分值不能作為受試樣品的刺激性質(zhì)的最后評判，可以作為參考值，在完整的觀察描述和評價下具有一定意義。除根據(jù)皮膚紅斑、水腫形成的標(biāo)準(zhǔn)積分外，還應(yīng)結(jié)合刺激作用的性質(zhì)、恢復(fù)程度等進(jìn)行化學(xué)物刺激作用的綜合評價。表3家兔急性皮膚刺激/腐蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表動物編號性別體重〔kg〕1h24h48h樣品對照樣品對照樣品對照紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分1234總積分平均值刺激強(qiáng)度分級7鑒定報告除一般鑒定報告的內(nèi)容外，還應(yīng)包括以下方面：7.1用表格記錄每只動物每個時間點(diǎn)〔如第1、24、48和72小時，直到損害逆轉(zhuǎn)或試驗(yàn)終止〕的紅斑、水腫以及其它皮膚損害/反響；7.2觀察到的任何損傷和系統(tǒng)效應(yīng)；7.3刺激／腐蝕程度和性質(zhì)的描述；7.4結(jié)論。8試驗(yàn)結(jié)果的解釋急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。假設(shè)用其它品系動物進(jìn)行試驗(yàn)時也得到類似結(jié)果，那么會增加從動物外推到人的可靠性。試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件下的試驗(yàn)，在人類實(shí)際接觸化學(xué)品過程中很少存在這種接觸方式。

皮膚變態(tài)反響實(shí)驗(yàn)〔皮膚致敏試驗(yàn)〕SkinSensitisationTest1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物皮膚致敏試驗(yàn)的根本原那么、要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測化學(xué)品對皮膚的變態(tài)反響性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No406，July.1992)USEPAOPPTSHealthEffectsTestGuidelines(Series870.2600,Aug.1998)3試驗(yàn)?zāi)康拇_定重復(fù)接觸化學(xué)物對哺乳動物是否可引起皮膚變態(tài)反響及其程度。4定義4.1皮膚致敏反響/過敏性接觸性皮炎〔SkinSensitization/AllergicContactDermatitis)：是皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反響。對于人類這種反響可能以搔癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反響不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。4.2誘導(dǎo)接觸(InductionExposure)：指機(jī)體通過接觸受試樣品以到達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生致敏狀態(tài)目的的試驗(yàn)性暴露；4.3誘導(dǎo)期(InductionPeriod)：指機(jī)體通過接觸受試樣品而誘導(dǎo)出過敏狀態(tài)所需的時間；4.4激發(fā)接觸(ChallengeExposure)：機(jī)體接受誘導(dǎo)暴露后，再次接觸受試樣品的試驗(yàn)性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反響。5試驗(yàn)根本原那么實(shí)驗(yàn)動物通過屢次皮膚涂抹誘導(dǎo)接觸受試樣品10～14d〔誘導(dǎo)期〕后，給予激發(fā)劑量的受試樣品，觀察實(shí)驗(yàn)動物，并與對照動物比擬對激發(fā)接觸受試樣品的皮膚反響強(qiáng)度。6試驗(yàn)方法6.1實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境6.1.1動物種屬首選健康、成年的白色豚鼠，體重250～300g。如選擇其它種屬，試驗(yàn)者需提供選擇的依據(jù)。6.1.2動物實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)動物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。動物自由飲食和飲水。需提供富含維生素C的食物。6.1.3動物數(shù)量和性別動物數(shù)量和性別依賴于選擇的試驗(yàn)方法。兩種性別均可用于局部封閉敷貼法〔Buehlertest〕和豚鼠最大反響試驗(yàn)〔GPMT〕。雌性動物應(yīng)該是未生育過和未懷孕的。Buehler試驗(yàn)要求試驗(yàn)組至少20只豚鼠，對照組至少10只。GPMT要求試驗(yàn)組至少10只豚鼠，對照組至少5只，如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定受試樣品的致敏性，應(yīng)增加動物數(shù)，試驗(yàn)組至少20只，對照組至少10只。6.2試驗(yàn)方法可靠性的檢查使用的能引起輕度/中度致敏的陽性物每隔6個月檢查一次。局部封閉涂皮法至少有30%動物出現(xiàn)皮膚過敏反響；皮內(nèi)注射法至少有60%動物出現(xiàn)皮膚過敏反響。陽性物一般采用：已苯乙烯醛(CASNo.101–86–0)；巰基苯并噻唑(CASNo.149–30–4)；氨基苯甲酸乙酯(CASNo.94–09–7)；二硝基氯苯(CASNo.97–00–7)；或DER331環(huán)氧樹脂。6.3劑量設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量水平可以通過少量動物(2～3只)的預(yù)試驗(yàn)獲得。誘導(dǎo)劑量為能引起皮膚刺激反響的最高濃度，激發(fā)劑量為不能引起皮膚刺激作用的最高劑量。水溶性受試樣品可用水或無刺激性外表活性劑作為賦形劑，其它受試樣品可用80%乙醇(誘導(dǎo)接觸)或丙酮(激發(fā)接觸)作賦形劑。6.4試驗(yàn)步驟6.4.1局部封閉涂皮法〔Buehlertest〕6.4.1.1動物數(shù)：試驗(yàn)組至少20只，對照組至少10只。6.4.1.2劑量水平：用2～3只動物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，尋找能引起皮膚輕度刺激反響的最高濃度〔劑量〕。在試驗(yàn)中設(shè)陰性對照組，在誘導(dǎo)接觸時該組僅涂以溶劑作為對照；在激發(fā)接觸時該組涂以受試樣品。對照組動物必須與受試樣品組動物為同一批。在實(shí)驗(yàn)室開展致敏反響試驗(yàn)初期、或使用新的動物種屬或品系時，需同時設(shè)陽性對照組。6.4.1.3誘導(dǎo)接觸：試驗(yàn)前24h實(shí)驗(yàn)動物背部左側(cè)去毛，去毛范圍為4cm2～6cm2。于第0、7、14d分別將0.4ml新配制的受試樣品〔最小刺激濃度〕涂布在背部左側(cè)2cm×2cm的區(qū)域，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，去除殘留受試樣品。6.4.1.4激發(fā)接觸：末次誘導(dǎo)2W后，即第28d，將0.4ml受試樣品〔最大無刺激濃度,建議為誘導(dǎo)濃度的1/2〕敷貼于豚鼠右側(cè)背部2cm×2cm的脫毛區(qū)(試驗(yàn)前24h去毛)，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，后者緊貼皮膚，再以無刺激膠帶封閉固定6h后，移去敷貼物，清洗方法同前。6.4.1.5結(jié)果觀察與評價：在24、48h后分別觀察局部皮膚反響。用盲法觀察對照組和試驗(yàn)組。按表1對局部皮膚反響評分。當(dāng)受試樣品組動物出現(xiàn)皮膚反響積分≥2時，判為該動物出現(xiàn)皮膚致敏反響陽性，并計(jì)算致敏率，按表2判定受試樣品的致敏強(qiáng)度。6.4.1.6如果結(jié)果可疑，該動物可以一周后重新激發(fā)，用最初的對照組或新的對照組進(jìn)行比擬。表1皮膚致敏反響試驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)評分紅斑和焦痂形成無反響0輕微的紅斑(勉強(qiáng)可見)1明顯紅斑(散在或小塊紅斑)2中度-重度紅斑3嚴(yán)重紅斑(紫紅色)至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫(勉強(qiáng)可見)1中度水腫(皮膚隆起輪廓清楚)2嚴(yán)重水腫(皮膚隆起約1cm或以上)3最高積分7注：皮膚致敏程度分級同表2表2皮膚致敏反響試驗(yàn)分級標(biāo)準(zhǔn)致敏率〔%〕等級致敏程度＜9Ⅰ弱9～Ⅱ輕度29～Ⅲ中度65～Ⅳ強(qiáng)≥81Ⅴ極強(qiáng)注：致敏率是反響評分為1或以上的動物數(shù)占該組動物總數(shù)的百分比，Ⅰ級致敏度沒有意義，在實(shí)際使用下無致敏危險。6.4.2豚鼠最大反響試驗(yàn)(GuineaPigMaximizationTest,GPMT)采用完全福氏佐劑(FreundCompleteAdjvant,FCA)皮內(nèi)注射方法檢測致敏的可能性。6.4.2.1動物數(shù):試驗(yàn)組至少用10，對照組至少5只。如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定受試樣品的致敏性，應(yīng)增加動物數(shù)，試驗(yàn)組20只，對照組10只。6.4.2.2劑量水平:誘導(dǎo)接觸受試樣品濃度為能引起皮膚輕度刺激反響的最高濃度，激發(fā)接觸受試樣品濃度為不能引起皮膚刺激反響的最高濃度。試驗(yàn)濃度水平可以通過少量動物〔2～3只〕的預(yù)試驗(yàn)獲得。6.4.2.3試驗(yàn)步驟6.4.2.3.1誘導(dǎo)接觸〔第0d〕:受試樣品組：將頸背部去毛區(qū)〔2cm×4cm〕中線兩側(cè)劃定三個對稱點(diǎn)，每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1mL下述溶液。第1點(diǎn)1:1〔V/V〕FCA/水或生理鹽水的混合物第2點(diǎn)耐受濃度的受試樣品第3點(diǎn)用1:1〔V/V〕FCA/水或生理鹽水配制的受試物，濃度與第2點(diǎn)相同對照組：注射部位同受試樣品第1點(diǎn)1:1〔V/V〕FCA/水或生理鹽水的混合物第2點(diǎn)未稀釋的賦形劑第3點(diǎn)用1:1〔V/V〕FCA/水或生理鹽水配制的濃度為50％〔w/v〕的賦形劑6.4.2.3.2誘導(dǎo)接觸〔第7d〕:將涂有0.5〔mL〕受試樣品的2cm×4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定48h。對無皮膚刺激作用的受試樣品，可加強(qiáng)致敏，于第二次誘導(dǎo)接觸前24h在注射部位涂抹10％十二烷基硫酸鈉〔SLS〕0.5mL。對照組僅用賦形劑作誘導(dǎo)處理。6.4.2.3.3激發(fā)接觸〔第21d〕:將豚鼠軀干部去毛，用涂有0.5g(mL)受試樣品的2cm×2cm濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后再用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定24h。對照組動物作同樣處理。如激發(fā)接觸所得結(jié)果不能確定，可在第一次激發(fā)接觸一周后進(jìn)行第二次激發(fā)接觸。對照組作同步處理。6.4.2.4觀察及結(jié)果評價:激發(fā)接觸結(jié)束，除去涂有受試樣品的濾紙后24、48和72h，觀察皮膚反響，〔如需要去除受試殘留物可用水或選用不改變皮膚已有反響和不損傷皮膚的溶劑〕按表3評分。當(dāng)受試樣品組動物皮膚反響積分≥1時，應(yīng)判為皮膚致敏反響陽性，按表2對受試樣品進(jìn)行致敏強(qiáng)度分級。表3皮膚致敏反響試驗(yàn)評分標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)評分無反響0散在或小塊紅斑1中度彌漫的紅斑、輕度水腫2嚴(yán)重的紅斑、水腫36.4.3皮膚變態(tài)反響試驗(yàn)-局部淋巴結(jié)法〔SkinSensitization-LocalLymphNodeAssay，LLNA)見參考方法。7鑒定報告除一般鑒定報告的內(nèi)容外，還應(yīng)包括以下方面：7.1陽性試驗(yàn)信息，包括陽性對照物、試驗(yàn)方法和試驗(yàn)時間；7.2評分等級系統(tǒng)的簡要描述；7.3誘導(dǎo)和激發(fā)使用的賦形劑，如果不是水和生理鹽水，說明使用的理由。任何可能與受試樣品反響、或增強(qiáng)、或阻礙吸收的原料均應(yīng)報告；7.4誘導(dǎo)和激發(fā)使用受試樣品的總量，每次使用的技術(shù)；7.5結(jié)論8試驗(yàn)結(jié)果的解釋試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能得出受試樣品的致敏能力和強(qiáng)度，這些結(jié)果只能在很有限的范圍內(nèi)外推到人類。

標(biāo)準(zhǔn)性附錄附錄1-A1-A嚙齒類動物中毒表現(xiàn)觀察工程表器官系統(tǒng)觀察及檢查工程中毒后一般表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及軀體運(yùn)動行為改變姿勢，叫聲異常，不安或呆滯動作震顫，運(yùn)動失調(diào)，麻痹，驚厥，強(qiáng)制性動作各種刺激的反響易興奮，知覺過敏或缺乏知覺大腦及脊髓反射減弱或消失肌肉張力強(qiáng)直，馳緩自主神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔大小縮小或放大分泌流涎，流淚呼吸性質(zhì)鼻孔流鼻涕呼吸性質(zhì)和速率徐緩，困難，潮式呼吸心血管系統(tǒng)心區(qū)觸診心動過緩，心律不齊，心跳過強(qiáng)或過弱胃腸系統(tǒng)腹形氣脹或收縮，腹瀉或便秘糞便硬度和顏色糞便不成形，黑色或灰色生殖泌尿系統(tǒng)陰戶，乳腺陰莖會陰部膨脹脫垂污穢皮膚和毛皮顏色，張力完整性發(fā)紅，皺折，松弛，皮疹豎毛粘膜粘膜口腔流粘液，充血，出血性紫紺，蒼白潰瘍眼眼瞼眼球透明度上瞼下垂眼球突出或震顫混濁其它直腸或皮膚溫度一般情況降低或升高姿勢不正常，消瘦附錄1-B化學(xué)物急性毒性試驗(yàn)LD50〔LC50〕計(jì)算方法1-B1霍恩氏〔Horn〕法1.1預(yù)試驗(yàn)：可根據(jù)受試樣品的性質(zhì)和己知資料，選用下述方法：一般多采用0.1、