吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究-圖文

吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究郭延軍,石益海,陸淼,劉海燕,高秀麗,李秀梅,王瑩(大慶油田總醫(yī)院,黑龍江大慶163001摘要:目的探討噻唑烷二酮類藥物(TZD吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。方法建立STZ(鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常對(duì)照治療組、糖尿病組、糖尿病治療組。結(jié)果糖尿病組腎重/體重顯著高于正常對(duì)照組及正常對(duì)照治療組(P<0105,而糖尿病治療組顯著低于糖尿病組(P<0105。各組腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)蓄積、基底膜增厚及腎小球系膜細(xì)胞增生指標(biāo),糖尿病組均高于正常對(duì)照組、正常對(duì)照治療組和糖尿病治療組(P<0105經(jīng)TZD治療后可減輕。結(jié)論TZD類藥物可以抑制大鼠糖尿病腎小球系膜細(xì)胞增生、基底膜基質(zhì)合成以及腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)蓄積,對(duì)糖尿病大鼠腎臟有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞:醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué);噻唑烷二酮類藥物;糖尿病腎病;動(dòng)物模型學(xué)科分類代碼:3101440中圖分類號(hào):R36111文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-5775(200503-0180-05ExperimentalStudyonAffectionofUltra-microstructureofRatDiabetesKidneyTreatedwithPioglitazoneGUOYan-jun,SHIYi-hai,LUMiao,etal.(TheGeneralHospitalofDaqingOilfield,Daqing163001,ChinaAbstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsandthemechanismofthiazolinedineonkidneyofdia2beticrats.MethodsTheanimalmodelwasinducedbySTZ.Wistarratsweredividedintonormalcontrolgroup(Agroup,normaltherapygroup(Bgroup,diabeticcontrolgroup(Cgroupanddiabetictherapygroup(Dgrouprandomly.ResultsThekw/bwingroupCwashigherthangroupAandB(P<0.05.ButitwasloweringroupDthangroupC.Theaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemembraneandproliferationofmesentericcellingroupCwerehigherthanthoseinothergroupsbutcoulddecreaseafterTZDtreatment.ConclusionTZDdrugscouldinhibitaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemem2braneandproliferationofmesentericcellsothattoprotecttheratkidney.Keywords:TZD;Diabeticnephropathy;Animalmodel目前,對(duì)糖尿病腎病(DN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,而且對(duì)DN缺乏非常有效地干預(yù)手段。有研究表明,胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(TZD作為PPAR-γ的配體,不但可以改善糖代謝,尚可減輕胰島素抵抗,改善β細(xì)胞功能和血脂紊亂〔1,2,3〕,個(gè)別報(bào)道TZDs對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥也有一定療效〔3〕。為此,本實(shí)驗(yàn)采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ誘發(fā)大鼠DN的動(dòng)物模型,擬觀察DN的大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)改變,為DN的防治提供新方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法111材料11111主要試劑:鏈脲佐菌素(STZ:購(gòu)于sigma公司;Wistar大鼠:由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,全部雄性;TZD(鹽酸吡格列酮:購(gòu)于北京太平洋藥業(yè)有限公司,每片15mg。11112主要儀器:透射電子顯微鏡:JEM-1200EX型,日本;光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng):Olympus,日本。112方法11211糖尿病動(dòng)物模型的建立健康雄性Wistar大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,鼠齡12周,常規(guī)飼養(yǎng)1周后,稱重。體重182~301g,平均體重235g,按于德民等方法建立STZ糖尿病模型〔4〕。采用0.1mmol/L枸椽緩沖液配成的1%鏈脲佐菌素(STZ溶液,以55mg/kg體重單次腹腔注射STZ,72h后剪斷尾尖用血糖儀測(cè)血糖,凡血糖濃度≥16.67mmol/L作為糖尿病大鼠。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、飲食,未使用胰島素及其他降血糖藥物。11212動(dòng)物分組健康雄性大鼠隨機(jī)分為兩組,包括正常對(duì)照組(NC,正常對(duì)照治療組(NCT;雄性成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為兩組,包括糖尿病組(DM,糖尿病治療組(DMT。每組10只。11213觀察指標(biāo)各治療組于成模3d后給藥,TZD類藥物成人劑量15~30mg/d,大鼠所用劑量為成人治療劑量的25~50倍。吡格列酮藥物配成溶液,每天15:00灌胃1次。DMT組及NCT組均給予鹽酸毗格列酮3mg/kg,NC組僅給予等量生理鹽水灌胃。每周稱重以及測(cè)血糖1次。在實(shí)驗(yàn)12周末,分別將50只大鼠處死后迅速取出雙腎,濾紙吸干稱重,一側(cè)腎臟放入10%福爾馬林固定液中,以備用免疫組織化學(xué)檢查;另一側(cè)腎臟取一部分皮質(zhì)放入215%戊二醛固定液,用作電子顯微鏡檢查,剩余部分腎臟置于-180℃液氮中以備提取RNA。11214測(cè)定方法1121411腎重/體重(肥大指數(shù):電子稱上面放一濾紙,然后將一腎臟放在上面稱重所得數(shù)據(jù)與大鼠平均體重進(jìn)行比較,即為腎臟肥大指數(shù)。1121412腎小球平均截面積、基質(zhì)基底膜面密度、毛細(xì)血管袢面密度:用PAS染色法,采用腎小球圖象分析腎臟疾病資料管理系統(tǒng)測(cè)定。將PAS染色的腎組織切片置光鏡下,放大40倍,圖像攝入醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)(TJTY-300。檢測(cè)皮質(zhì)區(qū)經(jīng)腎門正切的5個(gè)腎小球,計(jì)算腎小球截面積。檢測(cè)每份標(biāo)本10個(gè)腎小球,計(jì)算腎小球基質(zhì)、基底膜與系膜區(qū)面積比為基質(zhì)基底膜面密度。檢測(cè)每份標(biāo)本10個(gè)腎小球,計(jì)算毛細(xì)血管袢與系膜區(qū)面積比為毛細(xì)血管袢面密度。以上均取平均值。1121413腎小球細(xì)胞總數(shù):用于光鏡的腎組織標(biāo)本用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,4μm切片作PAS染色,選直徑為80~100μm,平均數(shù)為20個(gè)腎小球,采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)每1個(gè)腎小球橫截面陽(yáng)性細(xì)胞核總數(shù)(細(xì)胞核數(shù)少于50的腎小球刪除〔5〕,取平均值,但多形核以及一些退變細(xì)胞核的碎片除外。1121414基底膜厚度(電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu):(1固定:標(biāo)本立即放入2.5%戊二醛固定液中,并置入4℃冰箱中進(jìn)行前固定,前固定4h后,更換成0.05M磷酸緩沖液。最后以1%鋨酸固定液于室溫中進(jìn)行1h后固定。(2脫水和包埋:①首先依次用50%→70%→95%無(wú)水酒精進(jìn)行脫水,在每種酒精中停留30min;②用氧化丙稀透明3次,每次10~15min;③氧化丙稀與Epon812工作液等量混合,對(duì)組織進(jìn)行浸透;④新鮮配制的Epon812工作液包埋組織數(shù)小時(shí),使之逐漸固化;⑤將包埋組織的Epon812固化塊逐漸加高溫度(不超過(guò)60℃,使之聚合變硬,最后呈黃色透明狀。(3切片:LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片,醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色,JEM-1200型透射電鏡觀察攝片。各組大鼠電鏡圖像攝入醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)計(jì)算基底膜厚度。113統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10統(tǒng)計(jì)軟件做數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s,多組間比較用方差分析,P<0105有顯著性差異。2結(jié)果211TZD對(duì)各組血壓、血糖、腎重/體重(肥大指數(shù)、24h尿蛋白定量的影響(見(jiàn)表1。表1各組大鼠一般資料(x±s組別實(shí)驗(yàn)周期(周鼠數(shù)(只血壓(kPa血糖(mmol/L24h尿蛋白定量(g/L腎重/體重(‰正常對(duì)照組12101514±1164197±013601012±010063166±0123正常對(duì)照治療組12101512±1175128±013801013±010073160±0153糖尿病組12101512±21426188±319#301026±01013#34177±0125#3糖尿病治療組12101610±11422193±4159#301016±0109#3△3180±0190#3△注:與正常對(duì)照組比較,#P<0105;與正常對(duì)照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<0105212TZD對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響21211圖1所示:為正常對(duì)照組(NC大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色情況,可見(jiàn)有許多袢狀毛細(xì)血管,這些毛細(xì)血管盤繞成5個(gè)毛細(xì)血管小葉或節(jié)段,小葉內(nèi)的毛細(xì)血管之間有系膜組織相連接,毛細(xì)血管之間的吻合支很少。毛細(xì)血管腔無(wú)壓迫現(xiàn)象,系膜寬度未超過(guò)毛細(xì)血管直徑。腎小管細(xì)胞的游離面有發(fā)達(dá)的刷狀緣,PAS染色呈深紅色,管腔面規(guī)則,胞質(zhì)細(xì)顆粒狀,胞核圓形,染色質(zhì)細(xì)膩。21212圖2所示:為糖尿病組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色情況,可見(jiàn)系膜增生,增生的系膜組織對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢有明顯壓迫現(xiàn)象和破壞作用,受擠壓的毛細(xì)血管出現(xiàn)萎陷乃至消失,系膜寬度略超過(guò)毛細(xì)血管直徑,呈彌漫分布。21213圖3所示:為正常對(duì)照組大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見(jiàn)足細(xì)胞從胞體伸出幾個(gè)大的突起,在依次分出次級(jí)突起。足突相互形成指狀相嵌的交叉狀,呈薄片狀與基底膜相接觸。足突分布均勻,無(wú)融合及假絨毛樣改變現(xiàn)象。腎小球毛細(xì)血管基底膜位于內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間,是一層連續(xù)的半透膜?？梢?jiàn)基底膜均勻一致,內(nèi)疏松層、中間的致密層和外疏松層光滑,無(wú)電子致密物沉積。21214圖4及圖5所示:為糖尿病大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見(jiàn)系膜區(qū)系膜基質(zhì)增生,系膜細(xì)胞輕度增生。圖1正常對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS(×4002糖尿病組(DM大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色(×400圖3電鏡下正常對(duì)照組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×60004電鏡下糖尿病組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)a(×5000圖5電鏡下糖尿病組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×10000圖6電鏡下糖尿病治療組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×10000上皮細(xì)胞的足突輕度融合,使原來(lái)附于基底的排列有序的足狀突起代之以帶狀結(jié)構(gòu),貼敷于基底膜上。毛細(xì)血管基底膜局部增厚,基底膜樣物質(zhì)均勻增多,基底膜的微細(xì)結(jié)構(gòu)消失。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊凝聚。21215圖6所示:為糖尿病治療組大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見(jiàn)系膜區(qū)無(wú)系膜基質(zhì)增生,無(wú)系膜細(xì)胞增生。上皮細(xì)胞的足突融合減輕,毛細(xì)血管基底膜無(wú)增厚。213各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)(12周后腎臟病理參數(shù)比較21311各組大鼠腎組織基質(zhì)基底膜面密度、腎小球平均截面積、毛細(xì)血管袢面密度比較(見(jiàn)表2表2各組大鼠腎小球形態(tài)學(xué)指標(biāo)(12周后腎臟病理參數(shù)比較(x±s組別鼠數(shù)(只基質(zhì)基底膜面密度腎小球平均截面積毛細(xì)血管袢面密度正常對(duì)照組100127±010*******±711100173±0105正常對(duì)照治療組100125±010*******±61160175±0105糖尿病組100176±0111#3489142±13145#3015±0107#3糖尿病治療組100128±0104△288130±8102△0176±0103△注:與正常對(duì)照組比較,#P<0105;與正常對(duì)照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<010521312各組大鼠腎組織腎小球內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的比較(見(jiàn)表3表3各組大鼠腎小球內(nèi)總細(xì)胞數(shù)(x±s組別鼠數(shù)(只檢測(cè)腎小球數(shù)(個(gè)腎小球平均細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/腎小球橫截面正常對(duì)照組102081180±11102正常對(duì)照治療組102072198±9131糖尿病組1020100137±9188#3糖尿病治療組102082116±3145△注:與正常對(duì)照組比較,#P<0105;與正常對(duì)照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<010521313電鏡觀察各組大鼠腎組織腎小球基底膜厚度(見(jiàn)表4表4電鏡觀察各組大鼠腎組織腎小球基底膜厚度(x±s組別鼠數(shù)(只腎小球基底膜厚度(μm正常對(duì)照組101162±0124正常對(duì)照治療組101176±0112糖尿病組102166±0137#3糖尿病治療組101171±0114△注:與正常對(duì)照組比較,#P<0105;與正常對(duì)照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<01053討論糖尿病腎病(DN的預(yù)后多數(shù)不良,已成為糖尿病病人主要的死亡原因。這主要是因?yàn)槠淠I臟病變是慢性進(jìn)行性損害,臨床癥狀出現(xiàn)較晚,一般出現(xiàn)尿蛋白時(shí),病程多在10年以上。另外,一個(gè)重要原因是糖尿病引起腎臟損傷的主要機(jī)制尚不清楚,而且目前缺乏有效地防治藥物,以減緩腎臟的損害〔4,5,6〕。有研究表明,形成DN的多種機(jī)制可能與以下幾個(gè)方面的因素有關(guān)。其中包括循環(huán)障礙、腎血流動(dòng)力學(xué)異常,以及遺傳易感因素等。但其確切機(jī)制目前未完全明了,仍需實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步闡明DN發(fā)病機(jī)制。最近新一代噻唑烷二酮類胰島素增敏劑—鹽酸吡格列酮,成為新世紀(jì)治療糖尿病的一類新藥。但它是否對(duì)DN有防治作用以及其作用機(jī)制,目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)采用單次腹腔注射STZ制成1型糖尿病模型〔7〕,經(jīng)用鹽酸毗格列酮給大鼠灌胃治療,觀察治療DN的療效,并探討其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠腎重/體重之比(腎臟肥大指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組及正常對(duì)照治療組,提示糖尿病腎臟肥大,與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔8,9〕。經(jīng)PAS染色發(fā)現(xiàn),DN病變主要發(fā)生系膜區(qū)。腎小球系膜擴(kuò)大,腎小球總數(shù)增多,系膜增生,增生的系膜組織對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢有明顯壓迫現(xiàn)象和破壞作用,受擠壓的毛細(xì)血管出現(xiàn)萎陷乃至消失,系膜寬度略超過(guò)毛細(xì)血管直徑,以上說(shuō)明腎小球系膜出現(xiàn)病變,為中度系膜增生。毛細(xì)血管袢面密度減少,而且腎小球平均截面積增大,電鏡還發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)堆積、基底膜增厚。這些形態(tài)學(xué)改變的結(jié)果,一方面再次證明DN模型成功,另一方面也證明了DN發(fā)病的機(jī)制,可能是由于腎小球系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)堆積,腎小球系膜擴(kuò)大,從而發(fā)生以下幾種情況:(1對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢失去支持和保護(hù)作用;(2系膜區(qū)是血漿大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)通道,系膜區(qū)發(fā)生病變后,不能或不易通過(guò)濾過(guò)屏障的大分子物質(zhì)以及沉淀于毛細(xì)血管壁的特殊物質(zhì)(免疫復(fù)合物等,均不能通過(guò)系膜細(xì)胞間隙或系膜通道進(jìn)入淋巴管和血管,或通過(guò)血管壁進(jìn)入腎小管;(3系膜細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,并有血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ的受體,使之收縮,而對(duì)前列腺素E2也較敏感,使之舒張,系膜細(xì)胞增生后,系膜細(xì)胞的收縮與舒張失調(diào),調(diào)節(jié)腎小球的血流狀態(tài)發(fā)生紊亂,并使系膜細(xì)胞間隙或系膜通道的體積變化受阻,從而影響血漿和大分子物質(zhì)的腎小球內(nèi)移動(dòng);(4系膜細(xì)胞增生,則產(chǎn)生大量的系膜基質(zhì)或基質(zhì)樣物質(zhì),使基底膜增厚;(5增生的系膜細(xì)胞可產(chǎn)生大量的膠原纖維和基質(zhì);(6系膜細(xì)胞增生可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,使系膜增生及腎小球動(dòng)脈硬化,最終出現(xiàn)糖尿病腎臟肥大〔10,11〕。經(jīng)TZDs類藥物治療后,腎臟肥大指數(shù)下降,糖尿病組細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少,腎小球基底膜厚度明顯減少,腎小球總數(shù)減少,腎小球系膜細(xì)胞增生減輕。這些形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了TZDs類藥物對(duì)DN有治療作用,其機(jī)制可能是TZDs類藥物直接作用于腎小球細(xì)胞,抑制腎小球細(xì)胞增生及細(xì)胞外基生精沖劑對(duì)精索靜脈曲張大鼠睪丸組織抗過(guò)氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究安立文,隋勇,侯高峰(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150040摘要:目的探討生精沖劑對(duì)精索靜脈曲張睪丸中超氧化物歧化酶(SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE活性及脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO、一氧化氮(NO含量的影響。方法測(cè)定治療組大鼠睪丸中SOD、CAT、ACE活性及LPO、NO含量與模型組的差別。結(jié)果治療組大鼠睪丸中SOD、CAT、ACE活性高于模型組,LPO、NO含量低于對(duì)照組(P<0101。結(jié)論生精沖劑對(duì)精索靜脈曲張生成的睪丸脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞:藥理學(xué);生精沖劑;精索靜脈曲張;睪丸損傷;SOD;CAT;ACE;LPO;NO學(xué)科分類代碼:31014410中圖分類號(hào):R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-5775(200503-0184-02ExperimentalStudyonAnti-peroxidationInjuryofShengjingInstantPowderforTestisTissueofVaricoceleofRatANLi-wen,SHUIYong,HOUGao-feng(TheFirstAffiliatedHospitalofTCMUniversityofHeilongjiang,Harbin150040,ChinaAbstract:ObjectivetostudythechangeoftheactivityofSOD,CAT,ACEandthecontentofLPO,NOinvaricoceletestisinducedbyshengjinginstantpowder.MethodsToassaythecontentofLPO,NOandtheactivityofSOD,CATandACEinvaricoceletestis.ResultsTheactivityofSOD,CATandACEwashigherincure-grouprattestisthanthatinmodel-group.OnthecontrarythecontentofLPOandNOincuregroupwaslower.ConclusionShengjingin2stantpowdermightprotectthetestisfrontheinjuryoflipidperoxidationinvaricocele.Keywords:Shengjinginstantpowder;Varicocele;Testisinjury;SOD;CAT質(zhì)堆積,保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)膜的電荷和分子屏障,阻止蛋白的濾出,從而發(fā)揮降低尿蛋白作用,進(jìn)而促進(jìn)腎小球系膜損傷的修復(fù)。TZD對(duì)人類DN的治療效果還有待于更多的臨床研究。本實(shí)驗(yàn)為臨床的應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn):〔1〕SaltielAR,OlefskyJM.Thiazoli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