實驗一細菌基因組的提取

關(guān)于實驗一細菌基因組的提取第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日分離純化核酸總的原則：

①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達到的要求：

①核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則一、實驗原理第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸制備時應(yīng)注意的事項:①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。

3、核酸制備的一般原則一、實驗原理第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸制備的步驟：破碎細胞提取純化I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸酶的抑制和抑制劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。4、核酸制備的一般方法和原理一、實驗原理第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸酶的抑制和抑制劑

DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸酶的抑制和抑制劑

RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。

第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑

蛋白質(zhì)變性劑的作用：

1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。

3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸制備中常用的酶

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸提取的一般過程1）破碎細胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。

動物：液氮處理后用勻漿器破碎。

細胞器DNA：首先純化細胞器。

以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸提取的一般過程2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)

1．首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離

2．使核酸與蛋白質(zhì)分離

3．除去脂類

4．多糖的除去第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日核酸提取的一般過程

3）核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。

第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日4）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃（5℃）最佳和最簡單

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存

保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日二、材料、設(shè)備及試劑

菌種：DBT降解菌設(shè)備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，渦旋振蕩器試劑：LB液體培養(yǎng)基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-飽和酚、氯仿、RNA酶A、無水乙醇第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日1、1.5ml菌液（每組兩管）4℃12000rpm離心30sec，棄去上清，倒置試管于吸水紙上吸干。2、每管加入400μl裂解液，用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解，37℃水浴30min。3、每管加入132μl的5MNaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000rpm離心15min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1ml槍頭的尖端）小心取出上清液轉(zhuǎn)倒兩支新的eppendorf管中。4、加入等體積的飽和苯酚，充分混勻后，12000rpm離心3min，離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質(zhì)，則需將上清液轉(zhuǎn)入新的試管，重復(fù)上述步驟直到水層透明，水層和酚層之間不再白色沉淀物為止（約2次）。三、操作步驟第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日5、將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000rpm離心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，用預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm離心15min，可見白色絲狀沉淀物。7、小心吸出液體，棄上清液，用預(yù)冷的400μl70％乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用50μlTE（含20μg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置備用。

第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、注意事項——材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、注意事項——細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、注意事項——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、注意事項——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）五、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ叩诙?，共二十五頁?022年，8月28日材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問題二：DNA降解對策

原因五、DNA提取常見問題第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗材料不佳或量少破壁或裂解