實(shí)驗(yàn)一分光光度技術(shù)及蛋白含量測定

關(guān)于實(shí)驗(yàn)一分光光度技術(shù)及蛋白含量測定第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日理論

掌握分光光度技術(shù)的基本原理了解分光光度計(jì)的基本構(gòu)造實(shí)驗(yàn)

利用分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定

1.雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

2.考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量

3.紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日分光光度技術(shù)（Spectrophotography）第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日

一、基本定義

利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。

應(yīng)用：定性、定量

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高精確度高操作簡便、快速

第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日二、工作原理

1.物質(zhì)對(duì)光線有選擇性吸收作用。

2.每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。

3.在一定條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比。

分光光度法所使用的光譜范圍：200nm--10μm200-400nm400-760nm760-10000nm紫外光區(qū)可見光區(qū)紅外光區(qū)第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日如何定性？

—利用吸收光譜鑒定化合物利用分光光度計(jì)繪制吸收光譜曲線

用各種不同的單色光分別通過某一溶液，測定此溶液對(duì)每一種單色光的吸收度，以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度-波長曲線，即吸收光譜曲線。每種物質(zhì)有其特征性的吸收光譜第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日

1.朗伯（Lambert）定律

一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時(shí)，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的厚度增加呈指數(shù)減少。

I/I0=e-K1lI0:入射光強(qiáng)度；I

:透射光強(qiáng)度；l：介質(zhì)厚度

如何定量？

—Lambert-Beer定律第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日2．比爾（Beer）定律一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時(shí)，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的濃度的增加呈指數(shù)減少。

I/I0=e-K2CI0:入射光強(qiáng)度；I

:透射光強(qiáng)度；C：介質(zhì)濃度

第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日3.Lambert-beer’slaw的合并一束單色光通過某溶液時(shí)，光波被溶液吸收一部分，吸收多少與溶液中溶質(zhì)的濃度和溶液厚度成正比。

I/I0=e-εclA=-lgI/I0=εcl

A：吸光度；C：溶液濃度；L：液層厚度

ε：即摩爾消光系數(shù)，也叫摩爾吸光度，溶液濃度為mol/L,光程為1cm時(shí)的消光系數(shù)第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日4.計(jì)算（1）標(biāo)準(zhǔn)管法（標(biāo)準(zhǔn)比較法）

實(shí)際測定過程中，用一已知濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計(jì)算。A標(biāo)準(zhǔn)=ε標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn)

A樣品=ε樣品C樣品L樣品

A：吸光度；ε：摩爾吸光度；C：溶液濃度；L：液層厚度第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)，

ε樣品=ε標(biāo)準(zhǔn)因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測定液的比色杯徑長相同

L樣品=L標(biāo)準(zhǔn)故上二式可寫成：A標(biāo)準(zhǔn)/A樣品=ε標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)/ε樣品C樣品

C樣品=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀得測定物的濃度。

第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線使用注意事項(xiàng)①標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。②吸光度在范圍內(nèi)。③所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。④標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定管測定應(yīng)在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行，避免誤差產(chǎn)生。第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日5．應(yīng)用中注意的問題①Lambert-beer’slaw的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度范圍，稀溶液能很好的服從該定律，A宜在0.05～1.0之間，超過該范圍→偏離→計(jì)算結(jié)果與實(shí)際濃度不相符②選擇波長：最大吸收波長，因?yàn)閍.靈敏；b.避免雜質(zhì)干擾③參比溶液（空白管）：消除背景效應(yīng)，應(yīng)包含除待測溶質(zhì)以外所有的成分。第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日

空白管：

測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會(huì)產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個(gè)空白管，即其中除了待測溶質(zhì)以外，其它的成分完全相同。測量時(shí)，首先以空白管對(duì)準(zhǔn)光路對(duì)儀器調(diào)零，既消除比色皿本身對(duì)光的吸收，又消除了非待測物對(duì)光的吸收，所測值即為待測物造成的光吸收。第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日分光光度計(jì)第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日一．基本部件

1．光源分光光度計(jì)上常用的光源有兩種，即鎢燈和氫燈

(或氘燈)。在可見光區(qū)，近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢燈；在紫外光區(qū)，多使用氫燈。

2．單色器棱鏡或光柵，把混合光分解為單一波長的光。

3．吸收池（比色皿、比色池）選用合適的比色皿（可見光—玻璃；紫外光–石英；規(guī)格、新舊程度一致）

4．檢測器

5．測量裝置

第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日二.分光光度計(jì)使用步驟（示教）三.使用時(shí)注意事項(xiàng)

1.波長選擇。

2.機(jī)器預(yù)熱。

3.不測量時(shí)，應(yīng)使樣品室蓋處于開啟狀態(tài)，否則會(huì)使光電管疲勞。

4.不應(yīng)把成有腐蝕性液體的比色皿放在儀器表面。

5.比色皿使用注意事項(xiàng)第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日

1.由于紫外光不能透過玻璃比色皿，紫外光區(qū)測量時(shí)要用石英比色皿。

2.同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度一致）。

3.比色皿2光面與2毛面，光學(xué)表面對(duì)準(zhǔn)光路，不能有任何污損，否則會(huì)引起光吸收的增加。

4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液體約占全部容積的2/3。

5.腐蝕性溶液不得長期盛放在比色皿中。

6.每次使用后,應(yīng)立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水沖洗比色皿3～4次。本次試驗(yàn)，考馬斯亮藍(lán)可使玻璃比色皿著色，酒精浸泡后清洗。第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)定量分析實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)三考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)四紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)一雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量【基本原理】

蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合成紫色的化合物（稱雙縮脲反應(yīng)）。在一定濃度范圍，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法測定蛋白質(zhì)的含量。含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無此反應(yīng)。雙縮脲法的靈敏度為1-20mg。第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日試劑（ml）

1

2

3

4

5

6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.10.30.50.70.9—生理鹽水0.90.70.50.30.11.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0【操作步驟】（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.取小試管6支，編號(hào)按下表操作

2．混合后，于37℃水浴中放置15分鐘，在520nm波長下比色，以

第6管調(diào)零，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度的克數(shù)為橫座標(biāo)，繪成曲線。第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日（二）樣品測定：

取血清樣品0.1ml，加生理鹽水0.9m1，再加雙縮脲試劑4m1，于37℃水浴中放置15分鐘，測其吸光度，根據(jù)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算得出每l00ml血清（樣品）中蛋白質(zhì)的克數(shù)。

注意：雙縮脲法的靈敏度為1-20mg，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)注意濃度實(shí)驗(yàn)時(shí)，樣品管可與標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)處理第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日【基本原理】

考馬斯亮蘭G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)可通過范德華力結(jié)合，與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，最大吸收峰從465nm變成595nm，能過測定595nm處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，1-5μg；測定速度快；干擾物質(zhì)少?，F(xiàn)已被廣泛使用。實(shí)驗(yàn)三考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日1．取試管3支，編號(hào)按下表操作

試劑（ml）空白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本生理鹽水0.1

蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(50ug／ml)0.1

樣品0.1

考馬斯亮藍(lán)試劑5.05.05.02.混勻，放置5分鐘，在波長595nm處，以空白管調(diào)“0”，測定各管的吸光度?！静僮鞑襟E】第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日3.計(jì)算

A標(biāo)本/A標(biāo)準(zhǔn)

×50（μg/ml）

=樣品中蛋白質(zhì)的含量（μg/ml）

注意：蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度50μg/ml第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)四紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量【基本原理】

由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內(nèi)，吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測定。靈敏度：50-100μg第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日【操作步驟】（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.取試管6支，編號(hào)，按下表操作。試劑（ml）123456

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.51.