線粒體疾病的分子生物學檢驗課件

線粒體疾病的分子生物學檢驗

Moleculardiagnosisformitochondrialrelateddisorders

線粒體疾病的分子生物學檢驗

Moleculardiagn線粒體（Mitochondrion）1.真核細胞中的細胞器，二分裂方式進行新陳代謝，平均壽命10天2.多數(shù)細胞含幾個到幾千個線粒體3.每個線粒體含2-10線粒體DNA（mtDNA）2線粒體（Mitochondrion）1.真核細胞中的細胞器線粒體功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP能量代謝3線粒體功能MitochondrialDisease.Che其他功能

儲存鈣離子調節(jié)膜電位并控制細胞程序性死亡細胞增殖與細胞代謝的調控合成膽固醇及某些血紅素

產熱

——Wikipedia其他功能儲存鈣離子——Wikipedia線粒體病

Mitochondrialdisorders發(fā)現(xiàn)-1962年，Lufe等發(fā)現(xiàn)一位年輕的瑞典婦女伴有異常增高的基礎代謝率，同時伴有線粒體結構的異常和氧化磷酸化功能的異常。直到1988年，Wallace等報道了首例由線粒體DNA突變引起的人類疾病，明確了mtDNA突變可引起人類疾病。

定義-是遺傳缺陷引起線粒體異常，致使ATP合成障礙、能量來源不足等導致的一組異質性病變，又稱為線粒體細胞病。發(fā)病率-約為1:5000（約每5000人中1人發(fā)?。㏒meitink2006線粒體病發(fā)現(xiàn)-1962年，Lufe等發(fā)現(xiàn)一位年輕的線粒體病mitochondrialdisorders——是一組高度臨床變異性和遺傳異質性的疾病線粒體蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes80%

structuralproteinoftheOXPHOScomplexes

proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes

proteinsinvolvedinmtDNA

translation

proteinsinvolvedinmtDNA

maintenance

proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000線粒體病mitochondrialdisorders——進一步導致線粒體功能異常：①底物的運輸缺陷；②底物的利用缺陷；③檸檬酸循環(huán)異常；④氧化磷酸化脫偶聯(lián)；⑤呼吸鏈異常。進一步導致線粒體功能異常：①底物的運輸缺陷；發(fā)病特點

核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳

線粒體基因突變——母系遺傳（突變的mtDNA在母血增加，受累及的后代發(fā)病頻率增加）mtDNA突變與臨床表型之間關系復雜，主要表現(xiàn)為同一種mtDNA突變可以引發(fā)多種不同的疾病表型，而同一種疾病表型又可以由多種不同的mtDNA突變誘導。遺傳異質性嬰幼兒起病較常見發(fā)病特點核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳

編碼線粒體結構蛋白的核基因突變進行性外眼肌麻痹（PEO）、線粒體神經腸胃腦肌病、Leigh氏綜合征

線粒體蛋白質翻譯相關的核基因突變2004年Miller等首次報道核基因編碼的線粒體核糖體蛋白亞單位16(MRPS16)純合突變，導致先天畸形伴張力衰竭、四肢水腫、肝轉氨酶活性升高并乳酸亞基中毒癥，該女嬰在出生后3天死亡。核基因突變編碼線粒體結構蛋白的核基因突變核基因突變線粒體基因突變突變的影響：引起呼吸鏈功能缺陷氧化磷酸化酶異常閾值效應：組織特異性突變的mtDNA在復制分離時可能不均等分配

母系遺傳：不同突變后代發(fā)病風險不同。

相比A8344G突變，攜帶A3243G突變的母系后代更容易發(fā)病。

突變分布：同質性——各器官組織分布相同異質性——不同組織、細胞分布不同

一般特點線粒體基因突變突變的影響：引起呼吸鏈功能缺陷一般特點母系遺傳（MaternalInheritance）11母系遺傳（MaternalInheritance）11同質性突變與異質性突變12線粒體基因同質性（Homoplasmy）0或100%異質性（Heteroplasmy）0-100%核基因純合子（Homozygous）0或100%雜合子（Heterozygous）50%同質性突變與異質性突變12線粒體基因核基因mtDNA同質性/異質性突變與閾值13mtDNA同質性/異質性突變與閾值13線粒體基因突變點突變目前已報道的mtDNA點突變將近330種，涉及mtDNA編碼的各個基因，其中結構基因突變177種、tRNA基因突變137種、rRNA基因突變12種、D-Loop區(qū)突變2種LHON、線粒體腦肌病合并乳酸血征及卒中發(fā)作綜合征、肌陣攣癲癇、破碎紅纖維病、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等重排重排突變逾數(shù)百遺傳性痙攣性截癱等

(http：//)線粒體基因突變點突變線粒體疾病是復雜性疾病遺傳方式復雜常染色體隱性遺傳（AutosomalRecessive）常染色體顯性遺傳（AutosomalDominant）性連鎖遺傳（Sexlinked）母系遺傳（Maternallyinherited）臨床表型復雜累及多系統(tǒng)（Multisystemicinvolvement）影響幾乎所有組織器官（Anyorganortissuecanbeaffected）

15線粒體疾病是復雜性疾病遺傳方式復雜15線粒體功能涉及眾多的組織器官16線粒體功能涉及眾多的組織器官16線粒體病的共同臨床特點

嬰兒期發(fā)?。?/p>

常見于嬰兒伴隨COX陰性肌纖維、腦病和Leigh綜合征。

兒童發(fā)?。?/p>

見于MELAS、MERRF、Leigh病、線粒體肌病、線粒體心肌病和KSS。

中樞神經系統(tǒng)損害：

共濟失調、癲癇、肌張力下降、脊髓病等

周圍神經損害：

交感神經病出現(xiàn)在MNGIE和Wolfram綜合征

視聽神經損害：

視神經病出現(xiàn)在Leber病和顯性遺傳視神經萎縮1型聽力喪失出現(xiàn)在KSS

肌肉病

見于線粒體肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹見于KSS和PEO（高度臨床變異性）Chinneryetal.Lancet2000線粒體病的共同臨床特點嬰兒期發(fā)病：（高度臨床變異性）Ch線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷。代謝產物分析（血液、尿液、腦脊液等）血液可以正常，但腦脊液多異常，（動脈比靜脈好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸鏈受到阻斷。正常不除外線粒體疾病。酶測定

氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)的酶活性測定。（western、比色法等）方法不穩(wěn)定一般情況下，血清CK（肌酸激酶）正常或輕度升高；升高占30%見于慢性進行性眼外肌麻痹；mtDNA丟失時非常高。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷。肌肉活檢線粒體病的肌肉病理改變特點：（1）出現(xiàn)線粒體結構異常、細胞色素陰性肌纖維或破碎紅纖維（RRF）為主要病理改變。（2）上述病理改變出現(xiàn)的頻率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改變。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-29219線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢兒童及成人線粒體疾病的診斷標準A符合線粒體腦肌病各綜合征的臨床表現(xiàn)如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；多系統(tǒng)不明原因發(fā)病必須至少三個系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀除先證者外，至少有一個母系家族成員有發(fā)病可能排除其它代謝和非代謝疾病B肌活檢在骨骼肌中存在>2%破碎樣紅肌纖維主要診斷標準(Bernieretal,2002)(3,5)兒童及成人線粒體疾病的診斷標準主要診斷標準(BernierC有以下一種或多種呼吸鏈酶活性受抑制的表現(xiàn)：

50歲以下肌活檢COX陰性肌纖維>2%；50歲以上肌活檢COX陰性肌纖維>5%；任一組織中呼吸鏈酶活性<20%；任一細胞系中呼吸鏈酶活性<30%；多于兩組織內相同呼吸鏈酶活性<30%；主要診斷標準21主要診斷標準21次要診斷標準：A癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；至少以下一種提示肌肉中線粒體異常的表現(xiàn)：①30~50歲肌活檢RRF在1%~2%；②30歲以下肌活檢出現(xiàn)RRF；③電鏡下見廣泛線粒體異常；B

至少一種呼吸鏈功能受抑制的表現(xiàn)：①生化或極譜描記的呼吸鏈復合物活性在20%~30%；②用免疫方法證實呼吸鏈復合物表達減少；(Bernieretal,2002)(3,5)次要診斷標準：A癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；(Bern次要診斷標準：C發(fā)現(xiàn)可能相關的mtDNA異常；D一種或多種氧化磷酸化受損的表現(xiàn)：①腦脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑為KSS，腦脊液蛋白質增高；③PET或31P-MRS證實肌肉或腦代謝降低；④最大氧分壓、平均氧分壓或乳酸閾值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)次要診斷標準：C發(fā)現(xiàn)可能相關的mtDNA異常；(Bern

符合以上2個主要診斷指標或1個主要診斷指標及2個次要診斷指標的即為確診線粒體??；符合1個主要診斷指標及1個次要診斷指標或至少3個次要診斷指標的為擬診線粒體?。?/p>

符合1個主要診斷指標或在符合臨床表現(xiàn)的基礎上還具備1個次要診斷指標的為疑診線粒體病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292符合以上2個主要診斷指標或1個主要診斷指標及2個次要診斷指線粒體病診斷時應注意

基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸鏈和酶復合體活性等相結合

要區(qū)分病理性突變和正常衰老所致的線粒體基因突變

線粒體基因異常與臨床表現(xiàn)的嚴重程度之間存在量效關系

散發(fā)與遺傳的相關性，診斷是否遺傳需排除環(huán)境、藥物和衰老等因素線粒體病診斷時應注意基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)線粒體基因組與細胞核基因組的相互關系線粒體基因組變異與疾病26第一節(jié)線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)26人類線粒體基因組Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

基因組小,僅16569bp

雙鏈環(huán)狀DNA

13結構基因

/mRNA22tRNA基因

2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNA基因

非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）

L鏈復制起始區(qū)（約30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）

高突變率線粒體基因組及其表達系統(tǒng)27人類線粒體基因組Lightstrand:8tRNA線粒體疾病的分子生物學檢驗課件線粒體疾病的分子生物學檢驗課件ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).ThetwostrandsofmtDNCategoryGenesNADHdehydrogenase

(complexI)MT-ND1,MT-ND2,MT-ND3,MT-ND4,MT-ND4L,MT-ND5,MT-ND6CoenzymeQ-cytochromecreductase/Cytochromeb

(complexIII)MT-CYBcytochromecoxidase

(complexIV)MT-CO1,MT-CO2,MT-CO3ATPsynthaseMT-ATP6,MT-ATP8Transportchain(13peptides)Manyofthegenesencodethetransportchain:CategoryGenesNADHdehydrogenas2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT-RNR1(12SrRNA)MT-RNR2(16SrRNA).2rRNAs22tRNAsThefollowinggenesencodetRNA:AminoAcid

3-Letter

1-Letter

MTDNA

AlanineAlaAMT-TAArginineArgRMT-TRAsparagineAsnNMT-TNAsparticacidAspDMT-TDCysteineCysCMT-TCGlutamicacidGluEMT-TEGlutamineGlnQMT-TQGlycineGlyGMT-TGHistidineHisHMT-THIsoleucineIleIMT-TILeucineLeuLMT-TL1,MT-TL2LysineLysKMT-TKMethionineMetMMT-TMPhenylalaninePheFMT-TFProlineProPMT-TPSerineSerSMT-TS1,MT-TS2ThreonineThrTMT-TTTryptophanTrpWMT-TWTyrosineTyrYMT-TYValineValVMT-TV22tRNAsAminoAcid

3-LetHV2HV1340731636516024ControlregionD-loop576HV2HV1340731636516024Controlr線粒體疾病的分子生物學檢驗課件線粒體疾病的分子生物學檢驗課件ReplicationReplicationHumanmitochondrialDNA(mtDNA)hasthreepromoters,H1,H2,andL(heavystrand1,heavystrand2,andlightstrandpromoters).TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand.TheH2promotercausesthetranscriptionofthetwomitochondrialrRNAmolecules.TranscriptionHumanmitochondrialDNA線粒體疾病的分子生物學檢驗課件Theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvesthreetypesofproteins:themitochondrialRNApolymerase(POLRMT),2.mitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM),3.mitochondrialtranscriptionfactorsB1andB2(TFB1M,TFB2M).TheprocessoftranscriptcondonAnti-condonNucleartRNAMt-tRNAGCUGCCGCAGCGGGCUGCUGCcondonAnti-condonNucleartRNAM線粒體疾病的分子生物學檢驗課件第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)線粒體基因組與細胞核基因組的相互關系線粒體基因組變異與疾病43第一節(jié)線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)43核基因組與線粒體基因組的相互作用核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對話（cross-talk）”機制44核基因組與線粒體基因組的相互作用核基因組編碼了1500多個線第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)線粒體基因組與細胞核基因組的相互關系線粒體基因組變異與疾病線粒體基因組變異堿基突變：點突變。其中結構基因的點突變，與核基因組一樣，包括同義突變和錯義突變缺失與插入：mtDNA拷貝數(shù)目突變：線粒體基因組變異與疾病耳聾，Leber遺傳性視神經病變，糖尿病，高血壓，腫瘤45第一節(jié)線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)45在線粒體相關疾病中常見的DNA點突變MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G(80%),T3271C（在tRNALeu(UUR)基因）MERRF（肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維）：A8344G(80%),T8356C（在tRNALys基因）Leber視神經?。↙HON）：G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聾（Deafness）:A1555G,T1494C（在12SrRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type2Diabetes）:A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）

NARP（共濟失調伴色素性視網膜炎神經?。篢8993G,T8993C（在ATPase6基因）46在線粒體相關疾病中常見的DNA點突變MELAS綜合征（線粒體線粒體病的分子診斷標本選擇：

外周血白細胞——最常用毛發(fā)唾液尿液

骨骼肌——檢測mtDNA分子診斷的最好標本線粒體病的分子診斷標本選擇：檢測已知DNA突變的方法：等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）等位基因特異性擴增（ASA）限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RLFP）連接酶鏈反應（LCR）基因芯片技術檢測未知DNA突變的方法：單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP）變性梯度凝膠電泳（DEEG）異源雙鏈分析（HA）DNA序列測序變性高效液相色譜（DHPLC）分子診斷方法檢測已知DNA突變的方法：檢測未知DNA突變的方法：線粒體疾病中常見的突變核基因突變（nucleargenemutations）氧化磷酸化系統(tǒng)由核基因編碼的蛋白質,例如:Surf1,SCO2,NDUFV1,NDUFS1,etc.呼吸鏈缺陷:重復、缺失線粒體DNA點突變（mtDNApointmutations）LHON,MELAS,MERRF,NARP,etc.mtDNA缺失/重復（mtDNADeletions/duplications）

eg.KSS,Pearsonsynd,diabetes&deafness未知遺傳（unknowninheritance）49線粒體疾病中常見的突變核基因突變（nucleargene第二節(jié)

線粒體基因組與耳聾與耳聾相關的mtDNA突變耳聾相關的mtDNA突變的檢測50第二節(jié)線粒體基因組與耳聾與耳聾相關的mtDNA突變50“千手觀音”

21位聾啞演員中18人有藥物史部分患者使用正常劑量也會致聾“一針致聾”現(xiàn)象“千手觀音”突變位點基

因同質性/異質性疾

病首次報道aT961delT+C(n)ins961insC12SrRNA同質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Bacinoetal.(1995)Tangetal.(2002)T1095C12SrRNA同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagarajanetal.(2000)C1494T＊12SrRNA同質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhaoetal.(2004)A1555G＊12SrRNA同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezantetal.(1993)G1606AtRNAVal異質性綜合征型耳聾Tirantietal.(1998)A3243G＊tRNALeu(UUR)異質性綜合征型耳聾vandenOuweland,etal.(1992)G7444ACO1/tRNASer(UCN)同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandyaetal.(1999)A7445G＊CO1/tRNASer(UCN)同質性/異質性非綜合征型耳聾Reidetal.(1994)7472insC＊tRNASer(UCN)同質性/異質性綜合征型耳聾Tirantietal.(1995)T7511C＊tRNASer(UCN)同質性/異質性非綜合征型耳聾Sueetal.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同質性/異質性綜合征型耳聾Nakamuraetal.(1995)A8344G＊tRNALys異質性綜合征型耳聾Shoffneretal.(1990)G8363AtRNALys異質性綜合征型耳聾Santorellietal.(1996)T14709CtRNAGlu同質性綜合征型耳聾Rigolietal.(2001)G15927AtRNAThr同質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wangetal.(2008)突變位點基因同質性/異質性疾病首次報道aT961de第二節(jié)

線粒體基因組與耳聾與耳聾相關的mtDNA突變耳聾相關的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術DHPLC技術DNA測序技術基因芯片技術檢測位點引物序列(5′～3′)退火溫度(℃)產物長度(bp)A1555GC1494TCGATCAACCTCACCACCTCT58802TGGACAACCAGCTATCACCAA7445GACGCCAAAATCCATTTCACT58987CGGGAATTGCATCTGTTTTT53第二節(jié)線粒體基因組與耳聾與耳聾相關的mtDNA突變檢測位對1642例氨基糖苷類誘發(fā)的非功能性耳聾漢族聾兒進行線粒體12SrRNA變異檢測J.Luetal./Mitochondrion.2010,10(4):380–39054對1642例氨基糖苷類誘發(fā)的非功能性耳聾漢族聾兒進行線粒體555512SrRNA基因中有68

個核苷酸變異所有的核苷酸變異均為同質性68個核苷酸變異中，有3

個

C1494T其余

65

個變異為A1555G5612SrRNA基因中有68個核苷酸變異5657575858第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經病變與Leber遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變Leber遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變常用檢測技術59第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經病變與LeberLeber’sHereditaryOpticNeuropathy(LHON)Leber’sHereditaryOpticNeuroLeber’sHereditary

–inheritedfrommitochondrialDNAOptic–affectstheeyeNeuropathy–disease/abnormalityofnervous systemLeber’sDegenerationofretinalganglioncellsandtheiraxonsInheritedfrommaternalmitochondrialDNAOccursduringyoungadulthoodDegenerationofretinalgangliAcutePhase:Painless,acuteonsetofcentralvisionlossLossofvisualacuity/colouroncesymptomsappearinoneeye,othereyeaffectedweekslaterSubacutePhaseatrophyofopticdisclegallyblindAsymptomaticuntilvisualblurringdevelopsSignsandSymptomsAcutePhase:SubacutePhaseAsyMaternalinheritanceMutationoccursinmitochondrialDNA(mtDNA)OnlytheeggcontributesmtDNAtotheembryoGeneticsofLHONMaternalinheritanceGeneticso(1)G11778A:50-60%LHONpopulation(2)G3460A:8-25%LHONpopulation(3)T14484C:10%LHONpopulationSinglePointMutations

3majorpathogenicmutations:(1)G11778A:50-60%LHONpoG14459AT14484CG14459AMalesvs.FemalesLHONispredominantinmalesStudieslookingatx-linkagehavenotbeenconfirmednorstatisticallysignificantMalesvs.FemalesLHONispredoEpidemiology–racedependent1177834601448470%Europeans90%Asians86%QuebecCanadiansDuetoFounderEffect

（奠基者效應）KoreansEpidemiology–racedependent1presenceofmixtureofmorethanonetypeoforganellargenomeiemtDNANumerouscelldivisionsandthuslotsoftimeisrequiredformutantallelestobeexpressedinmitochondriaSymptomsdon’tappearuntiladulthoodAlsoimplicatedasthereasonforvariabilityinseverityofvisionlossHeteroplasmypresenceofmixtureofmorethPhotoreceptorsInterneuronsRGC(retinalganglialcells)NeuronsAxonsmakeupopticnerveRetinaPhotoreceptorsRetinaFireactionpotentialsHugeATPdemandVerysensitivetoenergysupplyandmitochondriadefectsEspeciallyRGCsforcentralvisualfieldLimitedregeneration

abilitiesRGC:neuronsFireactionpotentialsRGC:neuOtherneuronsinthebodycanbeaffectedtoo(CNS+PNS)ThisresultsinLeber`sPlusMovementdisordersTremorsCardiacconductiondefectsMS-like（多發(fā)性硬化樣）featuresAllNeuronsareVulnerableOtherneuronsinthebodycanATPDemandLeberOxidativePhosphorylatione-TransportChainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressRGCATPDemandLeberOxidativePhospComplex1

e-prematurelyleaktoO2

aka.NADHDehydrogenaseMitochondrialMatrixIntermembraneSpace3pointmutations4e-+4H++O2

2H2Oe-+O2

O2-Complex1

e-prematurelyleakLessATPLeberATPDemandOxidativePhosphorylatione-transportchainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressMoreSuperoxideO2-RGCLessATPLeberATPDemandOxidatiLeber:oxidativestress+ATPdeprivationAtrophy:wearingawayoftissueChronicoxidativestress:Apoptosis(celldeath)Thingsgowrong…Thelinkisimportant!!Leber:oxidativestress+ATPGeneticTestingforthematernallyinheritedmitochondrialDNA.Avoidpotentialenvironmentalprecipitantssuchastobaccoandexcessivealcohol.Avoidmedicationswhichhavebeenshowntoinducethedisease(Ethambutol乙胺丁醇,Chloramphenicol氯霉素)GeneticTestingforthematernVisiondamagefromdegenerationofopticnerveMaternallyinheritedthroughmtDNA3pointmutationsComplexIROS(reactiveoxygenspecies)TreatmentAntioxidantsInhibitmitochondrial-dependentapoptosisVisiondamagefromdegeneratio突變位點基因同質性/異質性首次報道*G3316AND1同質性Saillardetal.(2000)T3394CND1同質性Hofmannetal.(1997)G3460A*ND1同質性/異質性Huoponenetal.(1991)C3497TND1同質性Kongetal.(2003）G3733AND1同質性/異質性Valentinoetal.(2004)C4171AND1同質性/異質性Kimetal.(2002)T4216CND1同質性Torronietal.(1994）A4435GtRNAMet同質性Herrnstadtetal.（2002）G7444ACOⅠ同質性Huoponenetal.（1993）T10663CND同質性Brownetal.(1995)G11696AND4同質性/異質性Zhouetal.（2006）G11778A*ND4同質性/異質性Wallaceetal.(1988)T12338CND4同質性Wongetal.（2002）G14459AND6同質性/異質性Junetal.(1994)C14482G/AND6同質性/異質性Howelletal.(1998)T14484C*ND6同質性/異質性Johnsetal.(1992)A14495GND6異質性Chinneryetal.(2001)T14502CND6同質性Ozawaetal.（1991）C14568TND6同質性Wissingeretal.(1997)A14693GtRNAGlu同質性/異質性Tzenetal.（2003）A15951GtRNAThr同質性Lietal.（2006）原發(fā)性突變：G3460A，G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的80-90％繼發(fā)性突變：T3394C，T4216C，C4019T，G5244A，C4777T，G9438A，G13708A，G15257A新突變：A4435G位于tRNAMet

基因可以調節(jié)ND4G11778A突變的外顯率與Leber遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變79突變位點基因同質性/異質性首次報道*G3316AND1同質性A4435G可以調節(jié)ND4G11778A突變的外顯率tRNAMet80A4435G可以調節(jié)ND4G11778A突變的外顯率tR第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經病變與Leber遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變Leber病變相關的mtDNA突變常用檢測技術PCR-RFLP技術PCR-SSCP技術DHPLC技術DNA測序技術G3460A，G11778A，T11484C原發(fā)性突變測序圖81第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經病變與Leber遺傳第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病美國糖尿病協(xié)會(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標準，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于β細胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的1～3％據浙江省糖尿病防治中心提供的數(shù)據，浙江省糖尿病患病率為2.96%線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷82第四節(jié)線粒體與糖尿病線粒體糖尿病82第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷83第四節(jié)線粒體與糖尿病線粒體糖尿病83線粒體DNA突變與糖尿病突變位點累及基因同質性/異質性疾病首次報道C1310T12SrRNA同質性糖尿病臨床表型Guanetal.(2010)A1438G12SrRNA同質性糖尿病臨床表型Vawteretal.(2009)A3243G*tRNALeu(UUR)異質性糖尿病合并耳聾Vandenetal.(1992)C3254AtRNALeu(UUR)異質性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T3264CtRNALeu(UUR)異質性糖尿病Matsuokaetal.(1997)T3271CtRNALeu(UUR)異質性糖尿病Jakschetal.(1995)G3316AMT-ND1同質性非胰島素依賴性糖尿病Ogiharaetal.(1995)T3394CMT-ND1同質性非胰島素依賴性糖尿病Wallaceetal.(1995)T3398CMT-ND1同質性糖尿病合并耳聾Jakschetal.(1995)A3399TMT-ND1同質性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T4291CtRNAIle同質性糖尿病臨床表型Liftonetal.(2004)A4833GMT-ND2同質性非胰島素依賴性糖尿病Onayaetal.(2000)A7472CtRNASer(UCN)同質性糖尿病合并耳聾Hannaetal.(2005)A8296GtRNALys同質性/異質性糖尿病合并耳聾Ohsawaetal.(1998)A10398GMT-ND3同質性2型糖尿病Katoetal.(2003)A12026GMT-ND4同質性糖尿病Onayaetal.(1998)C12258AtRNASer(AGY)異質性糖尿病合并耳聾Turnbulletal.(1998)T14709C*tRNAGlu同質性/異質性糖尿病合并耳聾Moraesetal.(1995)T16189CMT-DLOOP同質性2型糖尿病Poultonetal.(1998)84線粒體DNA突變與糖尿病突變位點累及基因同質性/異質性疾病首攜帶tRNALeu(UUR)A3243G突變的糖尿病家系85攜帶tRNALeu(UUR)A3243G突變的糖尿病家系399bp307bp92bpMUn-cut143B43B12

A3243G為異質性突變RFLPDNASequencingDHPLCControlA3243GA3242GWT86399bp307bp92bpMUn-攜帶tRNAGly

T10003C突變的糖尿病家系

87攜帶tRNAGlyT10003C突變的糖尿病家系87tRNAGlyT10003C為同質性突變88tRNAGlyT10003C為同質性突變88AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAs89AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAs89SecondarystructureoftRNAGlySecondarystructureoftRNALeu(UUR)90SecondarystructureoftRNAGly9191第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷PCR技術正向引物（F）：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′反向引物（R）：5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′擴增片段398bp（3153～3551bp）DHPLC技術PCR-RFLP技術DNA測序技術92第四節(jié)線粒體與糖尿病線粒體糖尿病92分子診斷研究（A3243G異質性分析）收集病人外周血抽提DNAPCR擴增目的片段

PCR-RFLP測序驗證RT-ARMs-qPCR（amplification

refractory

mutationsystem）Pyrosequencing（焦磷酸測序）

TargetedNext-GenerationSequencing二代測序High-throughputsequencing實例分子診斷研究（A3243G異質性分析）收集病人外周血抽提母系遺傳糖尿病家系注：母系成員共24人，其中糖尿病患者為10人。相應PCR產物經普通測序驗證：MIDD母系遺傳性糖尿病伴耳聾(maternallyinheriteddiabetesanddeafness):母系遺傳糖尿病家系注：母系成員共24人，其中糖尿病患者為10PCR-RFLP圖含mtDNA3243PCR產物的限制性內切酶（ApaI）酶切結果圖mtDNA3243異質性突變檢測結果M：DNAmarker；Lane1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17：mtDNA3243異質性突變；Lane4、5、14、15：mtDNA3243未突變；限制酶ApaⅠ的酶切位點(GGGCC↓C),由于該突變?yōu)楫愘|性突變,故應該會出現(xiàn)553、423、130bp共3條條帶;而野生型沒有ApaⅠ的酶切位點,故電泳只能看到長度為553bp的1條片段PCR-RFLP圖含mtDNA3243PCR產物的引物可以覆蓋整個線粒體DNA基因組（3組）PCR產物富集過程基因組DNA文庫高通量捕獲測序

TargetedNext-GenerationSequencing探針引物可以覆蓋整個線粒體DNA基因組（3組）PCR產物富集過應用技術平臺IlluminaGAllX作為新一代分子生物學綜合技術平臺，GenomeAnalyzer測序技術避免了像傳統(tǒng)測序技術那樣耗費大量人力、物力進行片段克隆、轉化、質粒抽提等工作，具有高準確性，高通量，高靈敏度，低運行成本等突出優(yōu)勢，是目前市場占有率最高的第二代高通量基因測序儀。應用技術平臺IlluminaGAllX作為新一NextGenerationSequencing(NGS)測序深度（deep）：

是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據量為20M。NextGenerationSequencing(NGNextGenerationSequencing(NGS)覆蓋度（coverage）：指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。Read：高通量測序平臺產生的序列標簽NextGenerationSequencing(NG線粒體DNA序列：16.6kb3243位點捕獲到兩種堿基A/Gsupport=6758（A）/903（G）結果分析heteroplasmymutant=11%線粒體DNA序列：16.6kb3243位高通量捕獲測序檢測結果：表MIDD家系A3243G突變異質性水平檢測結果高通量捕獲測序檢測結果：表MIDD家系A3243G突變異質Step1andStep2:Step3andStep4；Step5：PyrosequencingDNA聚合酶熒光素酶雙磷酸酶硫酸化酶PyrosequencingTM焦磷酸測序技術是一種基于四種酶（DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）的級聯(lián)反應來進行定量序列分析的技術。在整個反應體系中，以PCR產物的一條單鏈為模板，與測序引物退火結合后，按照事先計算好的順序將四種dNTP依次加到樣品中。雙峰Step1andStep2:Step3andStep焦磷酸測序QiagenPyroMarkQ24QIAGEN公司最新的PyroMarkQ24焦磷酸測序儀，采用成熟的焦磷酸測序技術，是集測序、樣品制備、試劑和對照以及完整和靈活的軟件于一體的系統(tǒng)。

不需要制膠，不需要毛細管，也不需要熒光染料和同位素。10分鐘可分析96個樣品的SNP，可滿足高通量分析的要求；每個樣品孔都可進行獨立的測序或SNP分析，實驗設計靈活。序列分析簡單，結果準確可靠。特點焦磷酸測序QiagenPyroMarkQ24QIAGEMIDD家系A3243G突變異質性水平檢測值（%）焦磷酸測序II6II8II10II11III1III10III12III13III15III16III17III19III20IV1IV2IV6--11.224.920.520.530.632.938.928.3--54.7焦磷酸測序結果：表MIDD家系A3243G突變異質性水平檢測結果MIDD家系A3243G突變異質性水平檢測值（%）焦磷酸測序

RT-ARMs-qPCR編號mtDNAA3243G異質突變水平（%）野生型突變型II62.13E+063.60E+0514.46II82.24E+062.87E+0511.36II102.04E+064.67E+0518.63II119.27E+052.44E+020.00III11.40E+053.08E+010.00III101.44E+061.64E+0510.22III121.83E+064.91E+0521.15III131.57E+063.51E+0518.27III151.66E+063.94E+0519.18III161.76E+068.98E+0533.45III191.34E+067.11E+0534.67III201.60E+061.06E+0639.85Ⅳ12.66E+046.62E+000.00Ⅳ25.59E+052.33E+020.00Ⅳ66.16E+051.29E+0667.68Ⅳ71.58E+062.05E+0656.47精確定量A3243G異質水平同時計算拷貝數(shù)。A3243G突變攜帶者線粒體拷貝與正常人拷貝數(shù)相比較是減少的，且其差異有統(tǒng)計學意義。突變負荷=突變型拷貝數(shù)/（突變型拷貝數(shù)+野生型拷貝數(shù)）RT-ARMs-qPCR編號mtDNAA3243G異線粒體疾病的分子生物學檢驗課件線粒體疾病的分子生物學檢驗

Moleculardiagnosisformitochondrialrelateddisorders

線粒體疾病的分子生物學檢驗

Moleculardiagn線粒體（Mitochondrion）1.真核細胞中的細胞器，二分裂方式進行新陳代謝，平均壽命10天2.多數(shù)細胞含幾個到幾千個線粒體3.每個線粒體含2-10線粒體DNA（mtDNA）108線粒體（Mitochondrion）1.真核細胞中的細胞器線粒體功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP能量代謝109線粒體功能MitochondrialDisease.Che其他功能

儲存鈣離子調節(jié)膜電位并控制細胞程序性死亡細胞增殖與細胞代謝的調控合成膽固醇及某些血紅素

產熱

——Wikipedia其他功能儲存鈣離子——Wikipedia線粒體病

Mitochondrialdisorders發(fā)現(xiàn)-1962年，Lufe等發(fā)現(xiàn)一位年輕的瑞典婦女伴有異常增高的基礎代謝率，同時伴有線粒體結構的異常和氧化磷酸化功能的異常。直到1988年，Wallace等報道了首例由線粒體DNA突變引起的人類疾病，明確了mtDNA突變可引起人類疾病。

定義-是遺傳缺陷引起線粒體異常，致使ATP合成障礙、能量來源不足等導致的一組異質性病變，又稱為線粒體細胞病。發(fā)病率-約為1:5000（約每5000人中1人發(fā)?。㏒meitink2006線粒體病發(fā)現(xiàn)-1962年，Lufe等發(fā)現(xiàn)一位年輕的線粒體病mitochondrialdisorders——是一組高度臨床變異性和遺傳異質性的疾病線粒體蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes80%

structuralproteinoftheOXPHOScomplexes

proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes

proteinsinvolvedinmtDNA

translation

proteinsinvolvedinmtDNA

maintenance

proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000線粒體病mitochondrialdisorders——進一步導致線粒體功能異常：①底物的運輸缺陷；②底物的利用缺陷；③檸檬酸循環(huán)異常；④氧化磷酸化脫偶聯(lián)；⑤呼吸鏈異常。進一步導致線粒體功能異常：①底物的運輸缺陷；發(fā)病特點

核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳

線粒體基因突變——母系遺傳（突變的mtDNA在母血增加，受累及的后代發(fā)病頻率增加）mtDNA突變與臨床表型之間關系復雜，主要表現(xiàn)為同一種mtDNA突變可以引發(fā)多種不同的疾病表型，而同一種疾病表型又可以由多種不同的mtDNA突變誘導。遺傳異質性嬰幼兒起病較常見發(fā)病特點核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳

編碼線粒體結構蛋白的核基因突變進行性外眼肌麻痹（PEO）、線粒體神經腸胃腦肌病、Leigh氏綜合征

線粒體蛋白質翻譯相關的核基因突變2004年Miller等首次報道核基因編碼的線粒體核糖體蛋白亞單位16(MRPS16)純合突變，導致先天畸形伴張力衰竭、四肢水腫、肝轉氨酶活性升高并乳酸亞基中毒癥，該女嬰在出生后3天死亡。核基因突變編碼線粒體結構蛋白的核基因突變核基因突變線粒體基因突變突變的影響：引起呼吸鏈功能缺陷氧化磷酸化酶異常閾值效應：組織特異性突變的mtDNA在復制分離時可能不均等分配

母系遺傳：不同突變后代發(fā)病風險不同。

相比A8344G突變，攜帶A3243G突變的母系后代更容易發(fā)病。

突變分布：同質性——各器官組織分布相同異質性——不同組織、細胞分布不同

一般特點線粒體基因突變突變的影響：引起呼吸鏈功能缺陷一般特點母系遺傳（MaternalInheritance）117母系遺傳（MaternalInheritance）11同質性突變與異質性突變118線粒體基因同質性（Homoplasmy）0或100%異質性（Heteroplasmy）0-100%核基因純合子（Homozygous）0或100%雜合子（Heterozygous）50%同質性突變與異質性突變12線粒體基因核基因mtDNA同質性/異質性突變與閾值119mtDNA同質性/異質性突變與閾值13線粒體基因突變點突變目前已報道的mtDNA點突變將近330種，涉及mtDNA編碼的各個基因，其中結構基因突變177種、tRNA基因突變137種、rRNA基因突變12種、D-Loop區(qū)突變2種LHON、線粒體腦肌病合并乳酸血征及卒中發(fā)作綜合征、肌陣攣癲癇、破碎紅纖維病、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等重排重排突變逾數(shù)百遺傳性痙攣性截癱等

(http：//)線粒體基因突變點突變線粒體疾病是復雜性疾病遺傳方式復雜常染色體隱性遺傳（AutosomalRecessive）常染色體顯性遺傳（AutosomalDominant）性連鎖遺傳（Sexlinked）母系遺傳（Maternallyinherited）臨床表型復雜累及多系統(tǒng)（Multisystemicinvolvement）影響幾乎所有組織器官（Anyorganortissuecanbeaffected）

121線粒體疾病是復雜性疾病遺傳方式復雜15線粒體功能涉及眾多的組織器官122線粒體功能涉及眾多的組織器官16線粒體病的共同臨床特點

嬰兒期發(fā)?。?/p>

常見于嬰兒伴隨COX陰性肌纖維、腦病和Leigh綜合征。

兒童發(fā)?。?/p>

見于MELAS、MERRF、Leigh病、線粒體肌病、線粒體心肌病和KSS。

中樞神經系統(tǒng)損害：

共濟失調、癲癇、肌張力下降、脊髓病等

周圍神經損害：

交感神經病出現(xiàn)在MNGIE和Wolfram綜合征

視聽神經損害：

視神經病出現(xiàn)在Leber病和顯性遺傳視神經萎縮1型聽力喪失出現(xiàn)在KSS

肌肉病

見于線粒體肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹見于KSS和PEO（高度臨床變異性）Chinneryetal.Lancet2000線粒體病的共同臨床特點嬰兒期發(fā)?。海ǜ叨扰R床變異性）Ch線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷。代謝產物分析（血液、尿液、腦脊液等）血液可以正常，但腦脊液多異常，（動脈比靜脈好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸鏈受到阻斷。正常不除外線粒體疾病。酶測定

氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)的酶活性測定。（western、比色法等）方法不穩(wěn)定一般情況下，血清CK（肌酸激酶）正?；蜉p度升高；升高占30%見于慢性進行性眼外肌麻痹；mtDNA丟失時非常高。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷。肌肉活檢線粒體病的肌肉病理改變特點：（1）出現(xiàn)線粒體結構異常、細胞色素陰性肌纖維或破碎紅纖維（RRF）為主要病理改變。（2）上述病理改變出現(xiàn)的頻率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改變。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292125線粒體疾病的生化診斷當患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢兒童及成人線粒體疾病的診斷標準A符合線粒體腦肌病各綜合征的臨床表現(xiàn)如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；多系統(tǒng)不明原因發(fā)病必須至少三個系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀除先證者外，至少有一個母系家族成員有發(fā)病可能排除其它代謝和非代謝疾病B肌活檢在骨骼肌中存在>2%破碎樣紅肌纖維主要診斷標準(Bernieretal,2002)(3,5)兒童及成人線粒體疾病的診斷標準主要診斷標準(BernierC有以下一種或多種呼吸鏈酶活性受抑制的表現(xiàn)：

50歲以下肌活檢COX陰性肌纖維>2%；50歲以上肌活檢COX陰性肌纖維>5%；任一組織中呼吸鏈酶活性<20%；任一細胞系中呼吸鏈酶活性<30%；多于兩組織內相同呼吸鏈酶活性<30%；主要診斷標準127主要診斷標準21次要診斷標準：A癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；至少以下一種提示肌肉中線粒體異常的表現(xiàn)：①30~50歲肌活檢RRF在1%~2%；②30歲以下肌活檢出現(xiàn)RRF；③電鏡下見廣泛線粒體異常；B

至少一種呼吸鏈功能受抑制的表現(xiàn)：①生化或極譜描記的呼吸鏈復合物活性在20%~30%；②用免疫方法證實呼吸鏈復合物表達減少；(Bernieretal,2002)(3,5)次要診斷標準：A癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；(Bern次要診斷標準：C發(fā)現(xiàn)可能相關的mtDNA異常；D一種或多種氧化磷酸化受損的表現(xiàn)：①腦脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑為KSS，腦脊液蛋白質增高；③PET或31P-MRS證實肌肉或腦代謝降低；④最大氧分壓、平均氧分壓或乳酸閾值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)次要診斷標準：C發(fā)現(xiàn)可能相關的mtDNA異常；(Bern

符合以上2個主要診斷指標或1個主要診斷指標及2個次要診斷指標的即為確診線粒體??；符合1個主要診斷指標及1個次要診斷指標或至少3個次要診斷指標的為擬診線粒體??；

符合1個主要診斷指標或在符合臨床表現(xiàn)的基礎上還具備1個次要診斷指標的為疑診線粒體病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292符合以上2個主要診斷指標或1個主要診斷指標及2個次要診斷指線粒體病診斷時應注意

基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸鏈和酶復合體活性等相結合

要區(qū)分病理性突變和正常衰老所致的線粒體基因突變

線粒體基因異常與臨床表現(xiàn)的嚴重程度之間存在量效關系

散發(fā)與遺傳的相關性，診斷是否遺傳需排除環(huán)境、藥物和衰老等因素線粒體病診斷時應注意基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)線粒體基因組與細胞核基因組的相互關系線粒體基因組變異與疾病132第一節(jié)線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達系統(tǒng)26人類線粒體基因組Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

基因組小,僅16569bp

雙鏈環(huán)狀DNA

13結構基因

/mRNA22tRNA基因

2rRNA