第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件

生化藥物和基因工程藥物分析概論生化藥物和基因工程藥物分析概論1

一、藥物分類

第一節(jié)概述第一節(jié)概述2

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶32.基因工程藥物：以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。2.基因工程藥物：4二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及其降解物和衍生物類藥物1．生化藥物二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及52．基因工程藥物的種類

1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：

人生長激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長激素

2）細胞因子類藥物：

人干擾素人白細胞介素、集落刺激因子、促紅細胞生成素

3）酶類及凝血因子類藥物

2．基因工程藥物的種類

1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：6

三、特點

1.生物體的基本生化成分

2.分子量大:分子量測定

3.結(jié)構(gòu)難確證

4.全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、

最終產(chǎn)品

5.生物活性檢查

三、特點

1.生物體的基本生化成分7

6.安全性檢查

7.效價（含量）測定：

理化法：有效成分的含量

效價測定和酶活力測定：有效成分的生物活性6.安全性檢查

7.效價（含量）測定：

8

生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項目：

來源與種類純度

性狀干燥失重或水分

鑒別熾灼殘渣

氨酸組分分析生物活性

肽圖熱源試驗

糖含量含量分析

第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序與方法

生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項目：

9一、鑒別

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

等電聚焦法

生物鑒別法：家兔驚厥試驗一、鑒別

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

10（一）理化鑒別法1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+絡(luò)合顯色（一）理化鑒別法11

2.紫外分光光度法

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml判斷：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。

124.酶法：

例：尿激酶的鑒別---氣泡上升法

原理：4.酶法：13

方法：

取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時內(nèi)不溶。第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件145.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)。5.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位15

6.生物法：

利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。6.生物法：16（二）雜質(zhì)檢查

一般雜質(zhì)檢查

特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析

生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查

1.原料藥純度分析：

多糖類-----低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)

酶類藥物-----酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。

（二）雜質(zhì)檢查17例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查

選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%（g/g）。

1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%

2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查

選用N-乙酰-L-酪氨18

（三）安全性試驗

熱源試驗

異常毒性試驗:急性毒性物質(zhì)

過敏試驗：異性蛋白

降壓物質(zhì)試驗：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組

胺、類組胺

（三）安全性試驗

熱源試驗

19

無菌試驗：活菌

基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查

來源于宿主細胞的殘留DNA，外源性雜質(zhì)

致突變試驗

生殖毒性試驗無菌試驗：活菌

基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物20（四）含量測定

生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

（四）含量測定

生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量21含量測定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法

電化學(xué)分析法

光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法

色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色譜法、HPCE法

酶法：酶活力測定法、酶分析法

電泳法

生物檢定法含量測定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測22

1．電化學(xué)分析法

藥物膜電極

生物組織膜電極

藥物電極微生物電極

離子選擇性電極法免疫電極

免疫場效應(yīng)管

酶電極

第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用

1．電化學(xué)分析法藥物膜電極

23

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自動測定氨基酸

柱：RP—18，柱溫：48℃

流動相：A--0.05%TFA；B--乙腈-異丙醇（4：1）

梯度洗脫

熒光檢測器：ex=280nm～340nm,em=430nm2.HPLC法

1）RP-HPLC24

測定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

樣品干燥：真空

樣品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/LNaOH

進樣測定

測定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol25第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件26第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件272）HPIEC

測定對象：蛋白質(zhì)，多肽柱：離子交換鍵合相流動相：0.3mol/L～1.0mol/L的鹽的緩沖液。梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵素類鹽特點：可回收活性蛋白。2）HPIEC28

3）HPGFC應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測定。示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量的測定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流動相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%疊氮化鈉第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件29第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件30第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件312．酶活力測定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力測定實質(zhì)上是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越高。

2．酶活力測定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化32

酶反應(yīng)速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

通常酶活力測定時，先制備酶反應(yīng)進程曲線和酶濃度曲線。通過酶反應(yīng)速度的測定，求得酶的濃度或含量。酶反應(yīng)速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)33酶反應(yīng)進程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進程曲線求得反應(yīng)的初速度。

酶濃度曲線縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線檢驗反應(yīng)測定系統(tǒng)是否適宜。

酶反應(yīng)進程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間34

35酶活力測定的要求：測得的反應(yīng)速度必須和酶濃度有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。

酶活力測定的要求：測得的反應(yīng)速度必須和酶濃度有線性的比例關(guān)系362）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km。

pH：選用一個適宜的緩沖離子和離子強度、

適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。

溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃或

37℃，實驗中溫度變動應(yīng)控制在±0.1℃以內(nèi)。

輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要

相應(yīng)的輔酶。2）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物37空白和對照試驗：

空白試驗：是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼梢酝ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加（酶預(yù)先經(jīng)過失效處理）。

對照試驗：是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。

空白和對照試驗：

空白試驗：是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引383）測定方法：取樣測定法：3）測定方法：39連續(xù)測定法：在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測。檢測方法：紫外-可見分光光度法旋光法熒光分光光度法電化學(xué)測定法酶偶聯(lián)測定法離子選擇性電極測定法等。

連續(xù)測定法：在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測。40示例：胰蛋白酶效價測定

胰蛋白酶肽鍵、酰氨鍵、酯鍵（堿性氨基酸）

水解速率：酯鍵﹥酰氨鍵﹥肽鍵

供試品溶液：50～60單位/ml

底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯

濃度：A：0.575～.0585

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯N-苯甲酰-L-精氨酸

示例：胰蛋白酶效價測定

胰蛋白酶肽鍵、酰氨鍵、酯鍵（41

253nm處的A隨酶促反應(yīng)遞增，根據(jù)酶活力單位定義計算酶活力。

253nm處的A隨酶促反應(yīng)遞增，根據(jù)酶42酶活性單位：在最適的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個微摩爾底物的酶量定為一個活性單位。

測定：

空白：底物溶液+0.001mol/LHCl

酶活性單位：在最適的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個微摩爾底物的酶量43

每30sA的改變：0.015～0.018，呈線性關(guān)系的時間不得少于3min。每30sA的改變：0.015～0.018，呈線性關(guān)44

A每分鐘改變0.003，相當(dāng)于1個胰蛋白酶單位。

供試液的A每分鐘改變

A每分鐘改變0.003，相當(dāng)于1個胰蛋白酶單位。

45相當(dāng)于的單位數(shù)為每mg供試品中含胰蛋白酶單位數(shù)為相當(dāng)于的單位數(shù)為46

重組人白細胞介素11的胰蛋白酶切肽圖分析肽圖分析是評價重組產(chǎn)品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽圖法和胰蛋白酶切ＲＰＨＰＬＣ肽圖法。第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件47

1。酶切條件取濃度為3ｍｇ·ｍＬ-1的樣品04ｍＬ對1%ＮＨ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析樣品250μＬ至微量進樣瓶,加03ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ處理的胰蛋白酶10μＬ混勻,于37℃溫控自動進樣器酶切,每80ｍｉｎ進樣一針,進樣量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32色譜軟件選擇214ｎｍ進行分析,直至ｒｈＩＬ11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切時間,在第14針后ｒｈＩＬ11已被完全酶切,酶切時間在18～22ｈ范圍內(nèi)肽圖圖譜基本一致,即確定最佳酶切條件為37℃保溫20ｈ。1。酶切條件48

2。ＨＰＬＣ系統(tǒng)測試ＨＰＬＣ系統(tǒng)測試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進樣后呈3個峰,12次重復(fù)進樣3個峰保留時間的ＲＳＤ分別為0.4%,0.6%和0.8%,峰面積的ＲＳＤ分別為0.7%,0.8%和0.8%。ｒｈＩＬ11對照品37℃酶切20ｈ后于4℃溫控自動進樣器連續(xù)進樣5次,結(jié)果見圖1。5個色譜圖完全重疊在一起,所產(chǎn)生21個峰的保留時間、峰高和峰面積的ＲＳＤ均分別小于1.0%,5.4%和9.8%,表明本系統(tǒng)誤差小,重復(fù)性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽圖分析。2。ＨＰＬＣ系統(tǒng)測試49

3批ｒｈＩＬ11制品的ＲＰＨＰＬＣ圖譜完全一致,說明該廠ｒｈＩＬ11的生產(chǎn)工藝是穩(wěn)定的;與ＧＩ公司生產(chǎn)的ｒｈＩＬ11對照品比較有20個峰與對照品一致,但第6峰的峰高和峰面積均明顯較小,且在第9和第10峰之間多一個峰,說明該廠ｒｈＩＬ11蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與ＧＩ公司生產(chǎn)的ｒｈＩＬ11比較存在細小差別。

50第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件51生化藥物和基因工程藥物分析概論生化藥物和基因工程藥物分析概論52

一、藥物分類

第一節(jié)概述第一節(jié)概述53

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶542.基因工程藥物：以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。2.基因工程藥物：55二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及其降解物和衍生物類藥物1．生化藥物二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及562．基因工程藥物的種類

1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：

人生長激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長激素

2）細胞因子類藥物：

人干擾素人白細胞介素、集落刺激因子、促紅細胞生成素

3）酶類及凝血因子類藥物

2．基因工程藥物的種類

1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：57

三、特點

1.生物體的基本生化成分

2.分子量大:分子量測定

3.結(jié)構(gòu)難確證

4.全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、

最終產(chǎn)品

5.生物活性檢查

三、特點

1.生物體的基本生化成分58

6.安全性檢查

7.效價（含量）測定：

理化法：有效成分的含量

效價測定和酶活力測定：有效成分的生物活性6.安全性檢查

7.效價（含量）測定：

59

生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項目：

來源與種類純度

性狀干燥失重或水分

鑒別熾灼殘渣

氨酸組分分析生物活性

肽圖熱源試驗

糖含量含量分析

第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序與方法

生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項目：

60一、鑒別

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

等電聚焦法

生物鑒別法：家兔驚厥試驗一、鑒別

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

61（一）理化鑒別法1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+絡(luò)合顯色（一）理化鑒別法62

2.紫外分光光度法

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml判斷：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。

634.酶法：

例：尿激酶的鑒別---氣泡上升法

原理：4.酶法：64

方法：

取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時內(nèi)不溶。第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件655.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)。5.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位66

6.生物法：

利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。6.生物法：67（二）雜質(zhì)檢查

一般雜質(zhì)檢查

特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析

生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查

1.原料藥純度分析：

多糖類-----低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)

酶類藥物-----酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。

（二）雜質(zhì)檢查68例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查

選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%（g/g）。

1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%

2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查

選用N-乙酰-L-酪氨69

（三）安全性試驗

熱源試驗

異常毒性試驗:急性毒性物質(zhì)

過敏試驗：異性蛋白

降壓物質(zhì)試驗：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組

胺、類組胺

（三）安全性試驗

熱源試驗

70

無菌試驗：活菌

基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查

來源于宿主細胞的殘留DNA，外源性雜質(zhì)

致突變試驗

生殖毒性試驗無菌試驗：活菌

基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物71（四）含量測定

生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

（四）含量測定

生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量72含量測定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法

電化學(xué)分析法

光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法

色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色譜法、HPCE法

酶法：酶活力測定法、酶分析法

電泳法

生物檢定法含量測定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測73

1．電化學(xué)分析法

藥物膜電極

生物組織膜電極

藥物電極微生物電極

離子選擇性電極法免疫電極

免疫場效應(yīng)管

酶電極

第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用

1．電化學(xué)分析法藥物膜電極

74

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自動測定氨基酸

柱：RP—18，柱溫：48℃

流動相：A--0.05%TFA；B--乙腈-異丙醇（4：1）

梯度洗脫

熒光檢測器：ex=280nm～340nm,em=430nm2.HPLC法

1）RP-HPLC75

測定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

樣品干燥：真空

樣品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/LNaOH

進樣測定

測定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol76第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件77第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件782）HPIEC

測定對象：蛋白質(zhì)，多肽柱：離子交換鍵合相流動相：0.3mol/L～1.0mol/L的鹽的緩沖液。梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵素類鹽特點：可回收活性蛋白。2）HPIEC79

3）HPGFC應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測定。示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量的測定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流動相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%疊氮化鈉第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件80第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件81第十三章-生化藥物和基因工程藥物分析概論課件822．酶活力測定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力測定實質(zhì)上是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度越快所表示的酶活力越高。

2．酶活力測定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化83

酶反應(yīng)速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

通常酶活力測定時，先制備酶反應(yīng)進程曲線和酶濃度曲線。通過酶反應(yīng)速度的測定，求得酶的濃度或含量。酶反應(yīng)速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)84酶反應(yīng)進程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間，曲線斜率表示反應(yīng)速度。從酶反應(yīng)進程曲線求得反應(yīng)的初速度。

酶濃度曲線縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度，橫坐標(biāo)為酶量。通過酶濃度曲線檢驗反應(yīng)測定系統(tǒng)是否適宜。

酶反應(yīng)進程曲線縱坐標(biāo)為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間85

86酶活力測定的要求：測得的反應(yīng)速度必須和酶濃度有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。

酶活力測定的要求：測得的反應(yīng)速度必須和酶濃度有線性的比例關(guān)系872）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km。

pH：選用一個適宜的緩沖離子和離子強度、

適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)來控制pH。

溫度：酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃或

37℃，實驗中溫度變動應(yīng)控制在±0.1℃以內(nèi)。

輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些需要

相應(yīng)的輔酶。2）酶促反應(yīng)的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物88空白和對照試驗：

空白試驗：是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼梢酝ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加（酶預(yù)先經(jīng)過失效處理）。

對照試驗：是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。

空白和對照試驗：

空白試驗：是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引893）測定方法：取樣測定法：3）測定方法：90連續(xù)測定法：在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測。檢測方法：紫外-可見分光光度法旋光法熒光分光光度法電化學(xué)測定法酶偶聯(lián)測定法離子選擇性電極測定法等。

連續(xù)測定法：在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測。91示例：胰蛋白酶效價測定

胰蛋白酶肽鍵、酰氨鍵、酯鍵（堿性氨基酸）

水解速率：酯鍵﹥酰氨鍵﹥肽鍵

供試品溶液：50～60單位/ml

底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯

濃度：