細(xì)胞生物學(xué)研究方法(同名545)課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機制1第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動態(tài)觀點結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點同一性(unity)和多樣性(diversity)的問題細(xì)胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：結(jié)構(gòu)與功能（動態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動；實驗科學(xué)與實驗技術(shù)——細(xì)胞真知源于實驗室——Whatweknow//Howweknow.2如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動態(tài)觀點2第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物3第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法3第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

4第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lig顯微成像技術(shù)

光學(xué)和電子顯微鏡成像原理三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)常用的光學(xué)顯微鏡

普通雙筒顯微鏡(binocularmicroscope)熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)倒置顯微鏡5顯微成像技術(shù)光學(xué)和電子顯微鏡成像原理5光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)6光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)6r=0.61λ/nsinα

其中：n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率,空氣為1,油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)分辨率(resolution,r)：顯微鏡或人眼在25cm明視距離處，能清楚分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

r值越小，分辨能力越高。波長越短，分辨能力越高。

7r=0.61λ/nsinα分辨率(resolutio分辨極限(limitresolution)●一般地說，一定波長的射線不能用以探查比它本身波長短得多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，這是一切顯微鏡的一個基本限度?！駥梢姽猓?.4～0.7μm）來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之間的最小間隔是0.2μm。放大率(magnification)●最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率。8分辨極限(limitresolution)8

2.1.2常用光學(xué)顯微鏡

◆普通雙筒顯微鏡

(binocularmicroscope)

◆熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)◆相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)◆暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)◆倒置顯微鏡(invertedmicroscope)92.1.2常用光學(xué)顯微鏡9普通光學(xué)顯微鏡10普通光學(xué)顯微鏡10熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)熒光顯微鏡以紫外線為光源照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形態(tài)及其所在位置。要求：被檢物體發(fā)熒光（自發(fā)熒光、誘發(fā)熒光）用途：用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸及化學(xué)物質(zhì)的分布和定位等。11熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

12熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscop熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）圖片來自/

13熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）13Laserscanningconfocalmicroscope14Laserscanningconfocalmicros15151616相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)優(yōu)點：能夠觀察無色、透明、活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)。特點：能將物體本身的相位差（光程差）轉(zhuǎn)換為振幅（光強度）變化的顯微鏡。17相差顯微鏡(phasecontrastmicroscop倒置顯微鏡(invertedmicroscope)物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來。物鏡置于載物臺之下，光源位于載物臺的上方。集光器與載物臺之間的工作距離提高，可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。

18倒置顯微鏡(invertedmicroscope)1819192.1.3光學(xué)顯微鏡的樣品制備

1.樣品的固定(fixation)●目的:●做法:●固定液：快速殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時不會受到破壞。將樣品浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起。

202.1.3光學(xué)顯微鏡的樣品制備1.樣品的固定(fix2.包埋和切片(embeddingandsectioning)包埋：通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，使之硬化成固體的包埋塊。切片機切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為l～10μm。212.包埋和切片(embeddingandsection3.染色(staining)

目的：給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。蘇木精(hematoxylin)：核酸伊紅(eosin)：細(xì)胞質(zhì)蘇丹染料(Sudandyes)：脂肪223.染色(staining)224.放射自顯影用感光膠片測定細(xì)胞內(nèi)某種被放射性標(biāo)記的物質(zhì)在細(xì)胞固定時所在的位置。

234.放射自顯影232.1.4電子顯微鏡(electronmicroscope)1.透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)

讓電子束穿透樣片而成像。

242.1.4電子顯微鏡(electronmicroscopTransmissionElectronMicroscope

25TransmissionElectronMicrosco26262.掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy，SEM)用二次電子成像來觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

272.掃描電子顯微鏡(scanningelectronmScanningElectronMicroscope

28ScanningElectronMicroscope2LymphocyteviewedthroughaTEMandaSEM.(a)ThisTEMshowsathinsliceofalymphocyte,atypeofwhitebloodcell.Thistypeofmicroscopyallowsonetoseetheinternalstructurespresentintheslice.(b)InaSEM,surfacestructurescanbeseen,asdemonstratedinthisviewofalymphocyte.Notethethree-dimensionalappearanceofthiscell,incontrasttothetwo-dimensionalappearanceofthecellin(a)29LymphocyteviewedthroughaTE2.1.5電子顯微鏡的樣品制備

與光鏡相比，組織固定的特殊要求：樣品要薄，制成50～100nm的超薄切片。保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。樣品要具有一定的反差。電子顯微鏡的樣品切片最后被放置在載網(wǎng)上而不是玻片上。302.1.5電子顯微鏡的樣品制備與光鏡相比，組織固定的特染色(Stainning)醋酸雙氧鈾：可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，染核酸和蛋白質(zhì)，但對膜的染色效果較差。檸檬酸鉛：核蛋白及糖元結(jié)合，也可大大提高細(xì)胞膜系統(tǒng)與物質(zhì)的反差。31染色(Stainning)醋酸雙氧鈾：可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子1.負(fù)染色(negativestainning)

用重金屬作染色劑，對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。由于電子密度高的重金屬鹽包埋了樣品中低電子密度的背景，增強了背景散射電子的能力以提高反差。這樣，在圖像中背景是黑暗的，而未包埋的樣品顆粒則透明光亮，這種染色稱為負(fù)染色。321.負(fù)染色(negativestainning)32

3.冰凍蝕刻技術(shù)33

3.冰凍蝕刻技術(shù)33電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡石英透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差34電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM20顯微結(jié)構(gòu)（microscopicstructure）：光鏡下所見到的物體結(jié)構(gòu)。超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure）:又稱為亞顯微結(jié)構(gòu)。是在光學(xué)顯微鏡下觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構(gòu)。35顯微結(jié)構(gòu)（microscopicstructure）：光鏡第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)36第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法用超速離心技一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離37一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、高速、超速和梯度密度離心分離各種細(xì)胞器、生物大分子及其復(fù)合物38第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、高速、超速和梯度密度離心分離二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining39二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色DNA：福爾根（Feulgen）反應(yīng)－－紫紅色多糖類：PAS反應(yīng)－－黃色脂肪：蘇丹III－－紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon）－－紅色三、特異抗體技術(shù)免疫熒光免疫電鏡免疫沉淀Westernblotting四、特異核酸標(biāo)記技術(shù)InsituhybridizationNorthernblot(RNA);Southernblot(DNA)40二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色DNA：福爾根（DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。41DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：41三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)42三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)：422.2細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

◆

酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位?！裘庖呒?xì)胞化學(xué)技術(shù)：利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中抗原成分分布的一類技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)免疫電鏡432.2細(xì)胞化學(xué)技術(shù)◆酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：通過酶的特異細(xì)胞化Figure9-16.Indirectimmuno-cytochemistry.Thisdetectionmethodisverysensitivebecausetheprimaryantibodyisitselfrecognizedbymanymoleculesofthesecondaryantibody.Thesecondaryantibodyiscovalentlycoupledtoamarkermoleculethatmakesitreadilydetectable.Commonlyusedmarkermoleculesincludefluorescentdyes(forfluorescencemicroscopy),theenzymehorseradishperoxidase(foreitherconventionallightmicroscopyorelectronmicroscopy),colloidalgoldspheres(forelectronmicroscopy),andtheenzymesalkalinephosphataseorperoxidase(forbiochemicaldetection).44Figure9-16.Indirectimmuno-c四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

45四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 光鏡水平的原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)46原位雜交技術(shù)462.3細(xì)胞分選技術(shù)(cellsorting)

◆細(xì)胞分選：

用流式細(xì)胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）對細(xì)胞或染色體進(jìn)行分選，并進(jìn)行定量分析。

472.3細(xì)胞分選技術(shù)(cellsorting)◆細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)48流式細(xì)胞術(shù)48細(xì)胞標(biāo)記49細(xì)胞標(biāo)記49染色體標(biāo)記50染色體標(biāo)記50染色體分選流式細(xì)胞儀51染色體分選流式細(xì)胞儀51第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)

1，植物細(xì)胞

（原代細(xì)胞培養(yǎng)，永生細(xì)胞系）2，動物細(xì)胞

（單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細(xì)胞培養(yǎng)）3，非細(xì)胞體系

（DNA復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡運輸，細(xì)胞核裝配等）

細(xì)胞提取物，細(xì)胞核提取物52第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)52原代培養(yǎng)：從機體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長一定時間以后，就會由于營養(yǎng)成分的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及接觸抑制等因素而停止生長，因此必需將細(xì)胞傳到新的培養(yǎng)瓶中去使其繼續(xù)生長。53原代培養(yǎng)：從機體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。53細(xì)胞株：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞生長出現(xiàn)停滯，但有極少數(shù)細(xì)胞可能渡過危機而傳下去，這些細(xì)胞一般又可順利傳代40-50代，并且保持染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為。這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。細(xì)胞系：由細(xì)胞株傳至50代后又出現(xiàn)危機不能再傳下去，但是如果有部分細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變就有可能在體外培養(yǎng)的條件下無限制地傳下去。這些細(xì)胞具有癌細(xì)胞的特點，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。細(xì)胞系的特點是染色體發(fā)生明顯變化，失去接觸抑制的特性。實驗室中常用的細(xì)胞系54細(xì)胞株：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞

動物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制

細(xì)胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失

55 動物細(xì)胞培養(yǎng)55名稱類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠Hela宮頸癌上皮細(xì)胞HenrittalLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtK1上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2/0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠實驗室中幾種常用的細(xì)胞系56名稱類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠Hela宮頸癌上皮細(xì)胞Hen植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的克隆57植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的克隆57Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)58Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)582.4細(xì)胞工程技術(shù)◆細(xì)胞工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照人們的設(shè)計，改變細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或特種細(xì)胞的一門綜合性科學(xué)技術(shù)?！艏?xì)胞培養(yǎng)：在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長的技術(shù)。正常細(xì)胞一般可培養(yǎng)40～50代。592.4細(xì)胞工程技術(shù)◆細(xì)胞工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法，◆細(xì)胞融合(cellfusion)指自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細(xì)胞。滅活的仙臺病毒

或聚乙二醇60◆細(xì)胞融合(cellfusion)60◆單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodytechnique)將產(chǎn)生抗體的單個B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞雜交的技術(shù)。HAT培養(yǎng)基包含：次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤（A）

61◆單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodyt◆顯微操作術(shù)(micromanipulation)用顯微操作裝置對細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)和微量注射的技術(shù)。62◆顯微操作術(shù)(micromanipulation)62◆動物細(xì)胞核移植克隆技術(shù)

ABCD63◆動物細(xì)胞核移植克隆技術(shù)ABCD63CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana64CaenorhabditiselegansDrosophi一、名詞解釋分辨率、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)二、簡要說明電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的主要區(qū)別三、光學(xué)顯微鏡（熒光顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡）和電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡）的原理與應(yīng)用范圍。65一、名詞解釋651、關(guān)于電子顯微鏡，下列哪項有誤A.

觀察組織或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)均需超薄切片B.

鏡筒需要真空在熒光屏上成像利用電子束作為照明源

光學(xué)顯微鏡能夠分辯出其詳細(xì)結(jié)構(gòu)的是A.

細(xì)胞B.

線粒體C.

有被小泡D.

葉綠體、要探知細(xì)胞內(nèi)某一蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可以通過（）技術(shù)實現(xiàn)。A.

Southern印跡B.

Northern

印跡C.

Western

印跡D.

原位雜交

661、關(guān)于電子顯微鏡，下列哪項有誤664Feulgen反應(yīng)可用來測定下列物質(zhì)中的（）蛋白質(zhì)B.

脂肪.

多糖.

DNA

674Feulgen反應(yīng)可用來測定下列物質(zhì)中的（）67第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機制68第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動態(tài)觀點結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點同一性(unity)和多樣性(diversity)的問題細(xì)胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：結(jié)構(gòu)與功能（動態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動；實驗科學(xué)與實驗技術(shù)——細(xì)胞真知源于實驗室——Whatweknow//Howweknow.69如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動態(tài)觀點2第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物70第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法3第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

71第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lig顯微成像技術(shù)

光學(xué)和電子顯微鏡成像原理三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)常用的光學(xué)顯微鏡

普通雙筒顯微鏡(binocularmicroscope)熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)倒置顯微鏡72顯微成像技術(shù)光學(xué)和電子顯微鏡成像原理5光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)73光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)6r=0.61λ/nsinα

其中：n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率,空氣為1,油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)分辨率(resolution,r)：顯微鏡或人眼在25cm明視距離處，能清楚分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

r值越小，分辨能力越高。波長越短，分辨能力越高。

74r=0.61λ/nsinα分辨率(resolutio分辨極限(limitresolution)●一般地說，一定波長的射線不能用以探查比它本身波長短得多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，這是一切顯微鏡的一個基本限度。●對可見光（0.4～0.7μm）來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之間的最小間隔是0.2μm。放大率(magnification)●最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率。75分辨極限(limitresolution)8

2.1.2常用光學(xué)顯微鏡

◆普通雙筒顯微鏡

(binocularmicroscope)

◆熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)◆相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)◆暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)◆倒置顯微鏡(invertedmicroscope)762.1.2常用光學(xué)顯微鏡9普通光學(xué)顯微鏡77普通光學(xué)顯微鏡10熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)熒光顯微鏡以紫外線為光源照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形態(tài)及其所在位置。要求：被檢物體發(fā)熒光（自發(fā)熒光、誘發(fā)熒光）用途：用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸及化學(xué)物質(zhì)的分布和定位等。78熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

79熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscop熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）圖片來自/

80熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）13Laserscanningconfocalmicroscope81Laserscanningconfocalmicros82158316相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)優(yōu)點：能夠觀察無色、透明、活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)。特點：能將物體本身的相位差（光程差）轉(zhuǎn)換為振幅（光強度）變化的顯微鏡。84相差顯微鏡(phasecontrastmicroscop倒置顯微鏡(invertedmicroscope)物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來。物鏡置于載物臺之下，光源位于載物臺的上方。集光器與載物臺之間的工作距離提高，可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。

85倒置顯微鏡(invertedmicroscope)1886192.1.3光學(xué)顯微鏡的樣品制備

1.樣品的固定(fixation)●目的:●做法:●固定液：快速殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時不會受到破壞。將樣品浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起。

872.1.3光學(xué)顯微鏡的樣品制備1.樣品的固定(fix2.包埋和切片(embeddingandsectioning)包埋：通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，使之硬化成固體的包埋塊。切片機切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為l～10μm。882.包埋和切片(embeddingandsection3.染色(staining)

目的：給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。蘇木精(hematoxylin)：核酸伊紅(eosin)：細(xì)胞質(zhì)蘇丹染料(Sudandyes)：脂肪893.染色(staining)224.放射自顯影用感光膠片測定細(xì)胞內(nèi)某種被放射性標(biāo)記的物質(zhì)在細(xì)胞固定時所在的位置。

904.放射自顯影232.1.4電子顯微鏡(electronmicroscope)1.透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)

讓電子束穿透樣片而成像。

912.1.4電子顯微鏡(electronmicroscopTransmissionElectronMicroscope

92TransmissionElectronMicrosco93262.掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy，SEM)用二次電子成像來觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

942.掃描電子顯微鏡(scanningelectronmScanningElectronMicroscope

95ScanningElectronMicroscope2LymphocyteviewedthroughaTEMandaSEM.(a)ThisTEMshowsathinsliceofalymphocyte,atypeofwhitebloodcell.Thistypeofmicroscopyallowsonetoseetheinternalstructurespresentintheslice.(b)InaSEM,surfacestructurescanbeseen,asdemonstratedinthisviewofalymphocyte.Notethethree-dimensionalappearanceofthiscell,incontrasttothetwo-dimensionalappearanceofthecellin(a)96LymphocyteviewedthroughaTE2.1.5電子顯微鏡的樣品制備

與光鏡相比，組織固定的特殊要求：樣品要薄，制成50～100nm的超薄切片。保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。樣品要具有一定的反差。電子顯微鏡的樣品切片最后被放置在載網(wǎng)上而不是玻片上。972.1.5電子顯微鏡的樣品制備與光鏡相比，組織固定的特染色(Stainning)醋酸雙氧鈾：可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，染核酸和蛋白質(zhì)，但對膜的染色效果較差。檸檬酸鉛：核蛋白及糖元結(jié)合，也可大大提高細(xì)胞膜系統(tǒng)與物質(zhì)的反差。98染色(Stainning)醋酸雙氧鈾：可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子1.負(fù)染色(negativestainning)

用重金屬作染色劑，對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。由于電子密度高的重金屬鹽包埋了樣品中低電子密度的背景，增強了背景散射電子的能力以提高反差。這樣，在圖像中背景是黑暗的，而未包埋的樣品顆粒則透明光亮，這種染色稱為負(fù)染色。991.負(fù)染色(negativestainning)32

3.冰凍蝕刻技術(shù)100

3.冰凍蝕刻技術(shù)33電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡石英透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差101電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM20顯微結(jié)構(gòu)（microscopicstructure）：光鏡下所見到的物體結(jié)構(gòu)。超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure）:又稱為亞顯微結(jié)構(gòu)。是在光學(xué)顯微鏡下觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構(gòu)。102顯微結(jié)構(gòu)（microscopicstructure）：光鏡第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)103第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法用超速離心技一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離104一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、高速、超速和梯度密度離心分離各種細(xì)胞器、生物大分子及其復(fù)合物105第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、高速、超速和梯度密度離心分離二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining106二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色DNA：福爾根（Feulgen）反應(yīng)－－紫紅色多糖類：PAS反應(yīng)－－黃色脂肪：蘇丹III－－紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon）－－紅色三、特異抗體技術(shù)免疫熒光免疫電鏡免疫沉淀Westernblotting四、特異核酸標(biāo)記技術(shù)InsituhybridizationNorthernblot(RNA);Southernblot(DNA)107二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色DNA：福爾根（DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。108DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：41三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)109三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)：422.2細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

◆

酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位?！裘庖呒?xì)胞化學(xué)技術(shù)：利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中抗原成分分布的一類技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)免疫電鏡1102.2細(xì)胞化學(xué)技術(shù)◆酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：通過酶的特異細(xì)胞化Figure9-16.Indirectimmuno-cytochemistry.Thisdetectionmethodisverysensitivebecausetheprimaryantibodyisitselfrecognizedbymanymoleculesofthesecondaryantibody.Thesecondaryantibodyiscovalentlycoupledtoamarkermoleculethatmakesitreadilydetectable.Commonlyusedmarkermoleculesincludefluorescentdyes(forfluorescencemicroscopy),theenzymehorseradishperoxidase(foreitherconventionallightmicroscopyorelectronmicroscopy),colloidalgoldspheres(forelectronmicroscopy),andtheenzymesalkalinephosphataseorperoxidase(forbiochemicaldetection).111Figure9-16.Indirectimmuno-c四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

112四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 光鏡水平的原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)113原位雜交技術(shù)462.3細(xì)胞分選技術(shù)(cellsorting)

◆細(xì)胞分選：

用流式細(xì)胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）對細(xì)胞或染色體進(jìn)行分選，并進(jìn)行定量分析。

1142.3細(xì)胞分選技術(shù)(cellsorting)◆細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)115流式細(xì)胞術(shù)48細(xì)胞標(biāo)記116細(xì)胞標(biāo)記49染色體標(biāo)記117染色體標(biāo)記50染色體分選流式細(xì)胞儀118染色體分選流式細(xì)胞儀51第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)

1，植物細(xì)胞

（原代細(xì)胞培養(yǎng)，永生細(xì)胞系）2，動物細(xì)胞

（單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細(xì)胞培養(yǎng)）3，非細(xì)胞體系

（DNA復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡運輸，細(xì)胞核裝配等）

細(xì)胞提取物，細(xì)胞核提取物119第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)52原代培養(yǎng)：從機體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長一定時間以后，就會由于營養(yǎng)成分的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及接觸抑制等因素而停止生長，因此必需將細(xì)胞傳到新的培養(yǎng)瓶中去使其繼續(xù)生長。120原代培養(yǎng)：從機體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。53細(xì)胞株：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去