DB21∕T 3559-2021 軟棗獼猴桃品種鑒別技術規(guī)程 SSR分子標記法

DB21ICS65.020.01CCSB60遼寧省地方標準DB21/T3559—2021軟棗獼猴桃品種鑒別技術規(guī)程SSR分子標記法TechnicalregulationfortheidentificationofActinidiaargutaSSRmarkermethod2021-12-30發(fā)布2022-01-30實施DB21/T3559—2021目次1范圍.................................................................................12規(guī)范性引用文件.......................................................................13術語和定義...........................................................................14測試準備.............................................................................25DNA提取..............................................................................26PCR擴增..............................................................................37PCR擴增產(chǎn)物檢測......................................................................38指紋比對.............................................................................39數(shù)據(jù)記錄.............................................................................310結果判定............................................................................3附錄A（資料性）儀器設備與主要試劑、耗材...............................................4附錄B（資料性）溶液配制...............................................................5附錄C（規(guī)范性）核心引物...............................................................6附錄D（規(guī)范性）軟棗獼猴桃SSR等位基因數(shù)據(jù)記錄格式.....................................7附錄E（規(guī)范性）軟棗獼猴桃SSR指紋圖譜鑒別報告.........................................8IDB21/T3559—2021前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。IIDB21/T3559—2021軟棗獼猴桃品種鑒別技術規(guī)程SSR分子標記法1范圍本文件規(guī)定了利用簡單重復序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子標記法對軟棗獼猴桃（Actinidiaarguta(Sieb.&Zucc)Planch.exMiq.）材料進行鑒別過程中樣品準備、DNA提取、PCR擴增、PCR擴增產(chǎn)物檢測、指紋比對、數(shù)據(jù)記錄、結果判定等方面的技術要求。本文件適用于SSR分子標記技術構建軟棗獼猴桃資源DNA指紋圖譜過程中DNA分子數(shù)據(jù)采集和鑒別。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則LY/T2745仁用杏品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1PCR指聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR)，是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數(shù)量，以便進行檢測分析。3.2SSR分子標記SSRmolecularmarker又稱微衛(wèi)星標記，由于每個簡單重復序列兩端的序列是高度保守的單拷貝序列，因而可根據(jù)兩端的序列設計特異性引物，利用PCR技術對兩條引物間的DNA重復序列進行擴增，通過電泳可以區(qū)分不同大小的擴增產(chǎn)物片段，經(jīng)熒光染料標記加以區(qū)分。3.3待檢樣品testsample待鑒別的軟棗獼猴桃樣品，由送檢人提供。3.4對照樣品controlsample1DB21/T3559—2021用于與待檢樣品進行指紋比對的樣品，由送檢人提供。3.5核心引物coreprimer擴增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和一致性（無干擾譜帶），并具有較強的鑒別能力，可以用于建立軟棗獼猴桃比對的人工合成引物。3.6SSR指紋圖譜SSRfingerprint采用SSR核心引物（或相當于核心引物）擴增出的待檢樣品和對照樣品的DNA片段，通過毛細管電泳，得到不同大小的DNA片段圖譜。3.7指紋對比fingerprintcomparison將待檢樣品與對照樣品的SSR指紋圖譜進行比對，分析待檢樣品與對照樣品的SSR指紋是否具有差異，并確定其大小。4測試準備4.1儀器設備與主要試劑、耗材儀器設備與主要試劑、耗材參見附錄A。4.24.34.4溶液配制溶液配制方法參見附錄B。核心引物核心引物信息參見附錄C。樣品準備依據(jù)NY/T2324中樣本采集的技術規(guī)定進行樣本采集，3次以上重復。取無病蟲害的健康的芽，做好標記后，蒸餾水清洗后-80℃保存。5DNA提取a）將樣品倒入研缽中，加入液氮研磨2次，約取0.1mL放入1.5mL離心管；b）加入900μL2.5%CTAB提取液，65℃水浴60min，每10min顛倒，混勻；c）10000r?min-1離心1min，取上清650μL，加650μL氯仿∶異戊醇（24:1）混合液，混勻；離心5min，取上清400μL，加入800μL無水乙醇，-20℃放置30min；d）10000r?min-1e）5000r?min離心1min后倒掉上清液，用70%乙醇洗3次，自然風干，再用50μLTE溶解，置-1于4℃?zhèn)溆没虮４妫籪）用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA提取質量，要求電泳條帶清晰明亮；2

DB21/T3559—2021g）用紫外分光光度法測定純度和濃度，OD260/OD280比值范圍在1.7~1.9之間即為可用DNA樣品，將其最終質量濃度調至20ng?μL。-16PCR擴增6.1PCR反應體系總體積為20μL，其中6.0μLddH2O，10μL2×Taqmastermix，2.0μLDNA模板（20ng?μL），-1-1-11.0μLF-primer（20μmol?L，5’端飾有FAM熒光標記），1.0μLR-primer（20μmol?L）。6.2PCR擴增程序PCR擴增程序為：94℃預變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存。7PCR擴增產(chǎn)物檢測7.1標樣準備取PCR產(chǎn)物0.3μL、LIZ500分子量內標0.5μL和去離子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃變性5min，4℃冷卻后離心，加1.0μL1×Buffer緩沖液。7.2上機檢測參照LY/T2745中毛細管電泳比對方法。8指紋比對根據(jù)待檢樣品與對照樣品的譜帶位置進行指紋比對，確定是否具有差異；根據(jù)各泳道內分子量內標的位置與各樣品峰值的位置比較分析，確定待測樣品和對照樣品的片段大小。9數(shù)據(jù)記錄數(shù)據(jù)記錄采用統(tǒng)一格式，參見附錄D。10結果判定10.1判定方法將待檢樣品與對照樣品的SSR指紋比對結果進行分析，若待檢樣品與對照樣品有等位基因不同的位點，則依據(jù)該位點及其等位基因的不同，判定兩者不同；若待檢樣品與對照樣品全部位點等位基因均相同，則判定兩者為疑似相同。10.2判定結果根據(jù)10.1的判定結果，出具鑒別報告書，參見附錄E。3

DB21/T3559—2021AA附錄A（資料性）儀器設備與主要試劑、耗材A.1儀器設備冰箱（4℃、-20℃）精密天平（精度0.001g以上）、酸度計、2.5μL移液器、10μL移液器、100μL移液器、1000μL移液器、水浴鍋、高壓滅菌鍋、臺式離心機（10000r?min分光光度計、磁力攪拌器、PCR擴增儀、3730XL測序儀、瓊脂糧凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。-1或以上），紫外A.2主要試劑液氮、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、氯化鈉（NaCl）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯仿：異戊醇（24:1）、2×Taqmastermix、引物、瓊脂糖、去離子水、無水乙醇、雙蒸水、硼酸、B.3TBE電泳緩沖液。A.3主要器材量筒、玻璃棒、研缽、1.5mL離心管、移液器配套槍頭（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）、PCR管、96孔板。4DB21/T3559—2021BB附錄B（資料性）溶液配制B.1DNA提取溶液的配制B.1.11mol?L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）溶液（pH8.0）-1稱取30.28gTris于250mL燒杯中，加150mL去離子水充分攪拌溶解，用1mol?LHCl溶液調pH至8.0，-1定容至250mL，混勻。棕色瓶分裝，4℃冰箱保存。B.1.20.5mol?L乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTANa2?2H2O）溶液（pH8.0）-1稱取46.53gEDTANa2?2H2O于250mL燒杯中，加150mL去離子水充分攪拌溶解，用1mol?L溶液調pH至8.0，定容至250mL，混勻。4℃冰箱保存。-1NaOHB.1.3DNA提取液依次稱取十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）6.25g、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5.00g、氯化鈉（NaCl）20.454g至250mL燒杯中，分別加1mol?LTris-HCl溶液25mL、0.5mol?LEDTANa2?2H2O溶液10mL，-1-160℃水溶解，并用去離子水定容至250mL，混勻。4℃冰箱保存。B.1.41×TE緩存液分別量取1mol?LTris-HCl溶液2.5mL、0.5mol?LEDTANa2?2H2O溶液0.5mL，用去離子水定容-1-1至250mL，混勻。4℃冰箱保存。B.2引物的稀釋合成的引物在高速離心機中10000r?min離心2min，加入去離子水稀釋到濃度為20μmol?L。-1-1B.3TBE電泳緩沖液將Tris108g、硼酸55g、40ml0.5MEDTA溶解在600ml的去離子水中，調節(jié)pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。使用時稀釋10倍即可。5DB21/T3559—2021附錄C（規(guī)范性）核心引物C.1核心引物本文件中PCR反應體系中規(guī)定使用的引物，用于軟棗獼猴桃樣品鑒別。表C.1核心引物引物序列目的片段大小編號引物名稱FR12UDK-096UDK-098UDK-099UDK-103UDK-104UDK-106UDK-125UDK-128UDK-131UDK-143UDK-153UDK-158CCCAAAGTTCCTCACTCTTCCGTAAGGTTGGTACTGGCAGTCATCCTATTATTGCTGACACGACATCTTCTTCCCTTTCTTGGCAACATCTCGGCTGAAGATGCTCACCTGTCAAGCATTTGTAGAAACGAGCCCAAAATAGAGTTCAGCTCTCGGGACTGTTTGGTACGGTGTGGAGAGGATACGATTGGTGTAAAGTCAAAAACAGCCCCCCAGTGGAGATCACTTTCGCCCATCTAATCCGTACTCTGTAAACAAAAACCAAATCTGGCATGCATGATTATGGTTGGCATTGTTATAGGCCACCTCACTGGGCTGTCTAGTCATTTCCCTCAAAGGTTGCATATGAGTGGTTGCGTG