聚丙烯酰胺凝膠電泳課件

聚丙烯酰胺凝膠電泳

PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE

LiLi聚丙烯酰胺凝膠電泳

Polyacrylamide1

一、PAG的組成

PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebixacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過自由基聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Acr+Bis

多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

一、PAG的組成

PAG是由2（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式3（2）亞甲雙丙烯酰胺（2）亞甲雙丙烯酰胺4聚丙烯酰胺凝膠電泳課件5

二、PAG的聚合

需要催化劑——氧化還原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進行聚合。二、PAG的聚合

需要催化劑——氧6

（一）化學聚合：AP-TEMED系統(tǒng)

過硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。

（一）化學聚合：AP-TEMED系統(tǒng)過7

AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合形成凝膠。TEMED的游離堿基能促進AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合

分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧

升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺8

（二）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)

核黃素（riboflavin）在光照下（可見光或紫外光）分解，其黃素部分被還原成無色型，但在有氧條件下無色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝膠。注意：分離膠的合成一般采用化學聚合。因為若用光聚合，凝膠的孔徑受光照強度與時間的影響，導致孔徑大小不同，從而影響蛋白質(zhì)的分離。（二）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)

核黃素（r9

三、PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：20~40完全透明且有彈性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊狀不成形，易破碎。三、PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

PAG孔徑10

凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和Bis的總克數(shù)。T=（a+b）/m×100%T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和11C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）×100%當T固定時，Bis濃度在5%時孔徑最小。C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。12

四、不連續(xù)PAGE

按具體操作分垂直板形電泳圓盤電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分連續(xù)PAGE

不連續(xù)PAGE四、不連續(xù)PAGE按具體操作分垂直板13

Disc

成分作用樣品膠T=3%C=20%單體欲分離的樣品溶液pH6.7Tris-HCl緩沖液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝膠有防對流作用電極槽緩沖液通常為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

Disc

成分作用樣品膠T=314

Disc成分作用濃縮膠除不加樣品外，其余組成成分同樣品膠相同樣品在此膠中被濃縮Disc成分作用濃縮膠除不加樣品外，15

Disc成分作用分離膠T=7%C=2.5%單體溶液pH8.9Tris-HCl緩沖液化學聚合法聚合成小孔膠主要的電泳分離部分Disc成分作用分離膠T=7%C16

分離原理

1.濃縮效應1）凝膠層的不連續(xù)性兩層凝膠T與C不同孔徑不同濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動，受阻力小，移動速度快。

分離原理

1.濃縮效應17

2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負電，朝正極移動，進入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（）很小，有效遷移率（M）很低，移動速度較慢，稱為慢離子。HCl

是強電解質(zhì)，=1，Cl-有效遷移率大，移動速度快，稱快離子。蛋白質(zhì)（pI＜6.0）帶負電荷，有效遷移率介于兩者之間。

2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性18pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

甘氨酸HCl蛋白質(zhì)樣品膠濃縮膠分離膠樣品低電導區(qū)pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

甘氨酸HCl蛋白質(zhì)樣品膠19

3）pH值的不連續(xù)性為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)別。3）pH值的不連續(xù)性20

3.分子篩效應與電荷效應進入分離膠后，Gly-成為快離子分離膠只有電荷效應和分子篩效應，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離3.分子篩效應與電荷效應21聚丙烯酰胺凝膠電泳課件22聚丙烯酰胺凝膠電泳課件23聚丙烯酰胺凝膠電泳課件24聚丙烯酰胺凝膠電泳課件25

五、PAGE的特點

1.具有分子篩效應，分辨率高2.樣品不易擴散，用量少，靈敏度可達10-6g3.化學性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)五、PAGE的特點

1.具有分子篩效應，分26

小結(jié)1.掌握（不連續(xù)）PAGE的原理2.掌握影響PAGE遷移率的因素3.掌握PAGE的操作注意點、試劑作用4.熟悉PAG的聚合小結(jié)1.掌握（不連續(xù)）PAGE27思考題名詞解釋1.凝膠總濃度2.凝膠交聯(lián)度問答題1.與CAME相比，PAGE有哪些特點。2.試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。3.簡述不連續(xù)PAGE的原理。思考題名詞解釋28聚丙烯酰胺凝膠電泳課件29

聚丙烯酰胺凝膠電泳

PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE

LiLi聚丙烯酰胺凝膠電泳

Polyacrylamide30

一、PAG的組成

PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebixacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過自由基聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Acr+Bis

多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

一、PAG的組成

PAG是由31（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式32（2）亞甲雙丙烯酰胺（2）亞甲雙丙烯酰胺33聚丙烯酰胺凝膠電泳課件34

二、PAG的聚合

需要催化劑——氧化還原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進行聚合。二、PAG的聚合

需要催化劑——氧35

（一）化學聚合：AP-TEMED系統(tǒng)

過硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。

（一）化學聚合：AP-TEMED系統(tǒng)過36

AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合形成凝膠。TEMED的游離堿基能促進AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合

分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧

升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺37

（二）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)

核黃素（riboflavin）在光照下（可見光或紫外光）分解，其黃素部分被還原成無色型，但在有氧條件下無色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝膠。注意：分離膠的合成一般采用化學聚合。因為若用光聚合，凝膠的孔徑受光照強度與時間的影響，導致孔徑大小不同，從而影響蛋白質(zhì)的分離。（二）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)

核黃素（r38

三、PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：20~40完全透明且有彈性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊狀不成形，易破碎。三、PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

PAG孔徑39

凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和Bis的總克數(shù)。T=（a+b）/m×100%T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和40C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）×100%當T固定時，Bis濃度在5%時孔徑最小。C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。41

四、不連續(xù)PAGE

按具體操作分垂直板形電泳圓盤電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分連續(xù)PAGE

不連續(xù)PAGE四、不連續(xù)PAGE按具體操作分垂直板42

Disc

成分作用樣品膠T=3%C=20%單體欲分離的樣品溶液pH6.7Tris-HCl緩沖液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝膠有防對流作用電極槽緩沖液通常為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

Disc

成分作用樣品膠T=343

Disc成分作用濃縮膠除不加樣品外，其余組成成分同樣品膠相同樣品在此膠中被濃縮Disc成分作用濃縮膠除不加樣品外，44

Disc成分作用分離膠T=7%C=2.5%單體溶液pH8.9Tris-HCl緩沖液化學聚合法聚合成小孔膠主要的電泳分離部分Disc成分作用分離膠T=7%C45

分離原理

1.濃縮效應1）凝膠層的不連續(xù)性兩層凝膠T與C不同孔徑不同濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動，受阻力小，移動速度快。

分離原理

1.濃縮效應46

2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負電，朝正極移動，進入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（）很小，有效遷移率（M）很低，移動速度較慢，稱為慢離子。HCl

是強電解質(zhì)，=1，Cl-有效遷移率大，移動速度快，稱快離子。蛋白質(zhì)（pI＜6.0）帶負電荷，有效遷移率介于兩者之間。

2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性47pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

甘氨酸HCl蛋白質(zhì)樣品膠濃縮膠分離膠樣品低電導區(qū)pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

甘氨酸HCl蛋白質(zhì)樣品膠48

3）pH值的不連續(xù)性為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)