痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊

《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作術(shù)語注釋質(zhì)量保證（QualityAssurance，QA）是能持續(xù)提高實驗室服務(wù)效率和可信度的體系，包括室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評估和質(zhì)量提高。質(zhì)量控制（QualityControl，QC）也稱室內(nèi)質(zhì)量控制。包括結(jié)核病痰涂片操作鏡檢實驗室質(zhì)量控制的所有方法，如儀器和染色液的檢查等。室間質(zhì)量保證（ExternalQualityAssessment，EQA）是根據(jù)與其他網(wǎng)絡(luò)實驗室（中間級實驗室和中心實驗室）比較批量檢測和盲法復(fù)檢結(jié)果評價基層實驗室能力的過程。EQA包括實驗室現(xiàn)場評估以評價操作質(zhì)量并且也包括現(xiàn)場對涂片的復(fù)讀。EQA是IUATLD描述的熟練度檢測的擴大。質(zhì)量提高（QualityImprovement，QI）是通過分析痰涂片鏡檢診斷服務(wù)的各組成部分，尋找能永久清除障礙成功的過程。數(shù)據(jù)收集、分析、創(chuàng)意思路都是這一過程的重要部分。它涵蓋了連續(xù)監(jiān)測、明確缺陷及后續(xù)改正措施，如必要時重新培訓(xùn)以杜絕問題再次發(fā)生。QI常依賴于有效的現(xiàn)場評估訪視?，F(xiàn)場評價（On-siteevaluation）國家或地區(qū)結(jié)核病規(guī)劃下的地區(qū)督導(dǎo)員的常規(guī)對下級實驗室的督導(dǎo)檢查和高水平實驗室督導(dǎo)員的年度督導(dǎo)檢查。批量檢測（PanelTesting）把已染色和/或未染色涂片從中心或國家參比實驗室送到外圍或中間級實驗室以檢查讀片和報告的過程。批量檢測和世界衛(wèi)生組織定義的熟練度檢測是等同的。盲法復(fù)檢（Blinded-Rechecking）把涂片從外圍實驗室送到參比實驗室（中間級或中心實驗室）再次讀片。指南推薦采用盲法復(fù)查，確?？刂品绞孪炔恢劳鈬鷮嶒炇业臋z查結(jié)果。其他文件中，這也被稱做復(fù)讀。涂片陽性率（Slidepositivityrate，SPR）在一定時間內(nèi)一個實驗室所有受檢涂片（診斷或監(jiān)測涂片）中陽性涂片的比例。高假陽性（HighFalsePositive，HFP）陰性片被錯誤地判讀為2＋～4＋陽性。高假陰性（HighFalseNegative，HFN）2＋～4＋陽性涂片被錯誤地判讀為陰性。量化誤差（QuantificationError，QE）同一張陽性涂片受檢方和控制方陽性判斷級別的差異。低假陽性（LowFalsePositive，LFP）陰性涂片被錯誤地判斷為低陽性（1＋以下）。低假陰性（LowFalseNegative，LFN）低陽性（1＋以下）涂片被錯誤地判斷為陰性。第1頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作第一章緒論為了進一步加強結(jié)核病控制工作，實現(xiàn)全國結(jié)核病防治規(guī)劃目標(biāo)，加強直接面視下短程化療的技術(shù)策略和結(jié)核病細菌學(xué)實驗室質(zhì)量控制，提高肺結(jié)核病人的發(fā)現(xiàn)率，通過實驗室細菌學(xué)診斷傳染性肺結(jié)核是實施DOTS策略的一個關(guān)鍵，而且對結(jié)核病控制項目的成功起著重要的影響作用。因此，在執(zhí)行國家結(jié)核病防治規(guī)劃中必須具備有效的結(jié)核病實驗室網(wǎng)絡(luò)。一個可信的實驗室必須符合成本-效益原則，并且提供準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，為此只有通過質(zhì)量保證（QualityAssurance，QA）才能實現(xiàn)。結(jié)核病實驗室質(zhì)量保證的一個重要組成部分就是室間質(zhì)量評估（ExternalQualityAssurance，EQA），即由上級參比實驗室通過一系列的規(guī)范性活動來監(jiān)督，不斷完善實驗室的質(zhì)量保證程序，其質(zhì)量保證有賴于國家結(jié)核病控制規(guī)劃對各級實驗室檢查工作的支持、培訓(xùn)和監(jiān)督，并逐步完善與國際接軌的質(zhì)量保證管理系統(tǒng)。第一節(jié)目的和任務(wù)在結(jié)核病控制工作中痰結(jié)核菌檢查對發(fā)現(xiàn)傳染源、確定診斷和化療方案、考核療效、評價防治效果具有重要意義。因此，結(jié)核病細菌檢查是國家結(jié)核病控制規(guī)劃（NTP）的重要組成部分，在現(xiàn)代結(jié)核病控制工作中起著不可缺少的重要作用。第二節(jié)一、實驗室網(wǎng)絡(luò)及職能實驗室網(wǎng)絡(luò)及職能圖1：實驗室室間質(zhì)量評估網(wǎng)絡(luò)圖（一）國家參比實驗室1.制定我國各級結(jié)核病實驗室痰涂片質(zhì)量保證指南與實施細則。2.收集、整理、統(tǒng)計、分析國家室間質(zhì)量保證信息資料。3.組織培訓(xùn)國家級質(zhì)控督導(dǎo)員。4.計劃、實施對下級實驗室的定期督導(dǎo)檢查。第2頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作5.指導(dǎo)、協(xié)調(diào)、評估各?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）參比實驗室室間質(zhì)量保證工作。6.開展我國結(jié)核病實驗室室間質(zhì)量保證方法的實施性研究。（二）省級參比室1.根據(jù)國家參比室和省結(jié)核病控制規(guī)劃的需要，制定本省痰涂片室間質(zhì)量保證實施計劃。2.收集、整理、統(tǒng)計、分析省內(nèi)室間質(zhì)量保證信息、資料，按要求定期上報國家參比實驗室。3.省級參比實驗室負責(zé)省內(nèi)質(zhì)量保證的技術(shù)支持與培訓(xùn)；組織、協(xié)調(diào)、評估本省各市、縣實驗室室間質(zhì)量保證工作。4.負責(zé)地（市）級和縣級結(jié)核病實驗室的現(xiàn)場評價(on-siteevaluation)、批量檢測（PanelTesting）、隨機抽樣和委托初次復(fù)驗者盲法復(fù)檢。5.承擔(dān)地（市）級結(jié)核病實驗室盲法復(fù)檢的再次復(fù)驗者復(fù)檢工作。6.指導(dǎo)、監(jiān)督地（市）級實驗室實施縣級實驗室室間質(zhì)量保證工作。（三）地（市）級結(jié)核病實驗室1.根據(jù)國家參比室和省參比室的要求，制定本地區(qū)痰涂片室間質(zhì)量保證實施計劃。2.收集、整理、統(tǒng)計、分析本地區(qū)內(nèi)室間質(zhì)量保證信息資料，定期上報省參比實驗室。3.負責(zé)轄區(qū)內(nèi)結(jié)核病實驗室質(zhì)量保證的技術(shù)支持與培訓(xùn)；組織、協(xié)調(diào)、評估各縣實驗室的室間質(zhì)量保證工作。4.做好本實驗室痰涂片鏡檢和室內(nèi)質(zhì)控工作，接受省參比室定期室間質(zhì)量保證督導(dǎo)。5.承擔(dān)同級間實驗室（地、市）初次復(fù)驗者盲法復(fù)檢工作。6.負責(zé)實施縣級結(jié)核病實驗室的現(xiàn)場評價、批量檢測、盲法復(fù)檢和再次復(fù)驗者的復(fù)檢工作。（四）縣級結(jié)核病實驗室1.做好本實驗室痰涂片鏡檢和室內(nèi)質(zhì)控工作，接受上一級參比室定期室間質(zhì)量保證督導(dǎo)。2.承擔(dān)同級間實驗室（縣級）初次復(fù)驗者盲法復(fù)檢工作。第二章痰涂片檢查第一節(jié)痰涂片的意義在當(dāng)前國家結(jié)核病控制措施的框架下，抗酸桿菌（acid-fastbacilli，AFB）鏡檢的目的是：一、傳染性結(jié)核病的診斷指標(biāo)：目前，控制結(jié)核病流行以發(fā)現(xiàn)和控制傳染源為主。現(xiàn)在認為，痰涂片AFB陽性的肺結(jié)核患者是傳染源，對未經(jīng)細菌檢查證實的肺結(jié)核患者成為“可第3頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作疑肺結(jié)核患者”；故痰涂片AFB鏡檢結(jié)構(gòu)對診斷傳染性肺結(jié)核是一項重要指標(biāo)。二、評價傳染性結(jié)核病的化療效果：由于目前結(jié)核病的藥物化療方案，其原理主要是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特征而制定的，所以對化療效果的評價，也必須以AFB細菌學(xué)檢查結(jié)果作為根據(jù)。三、為結(jié)核病疫情的流行病學(xué)統(tǒng)計服務(wù)：由于傳染性結(jié)核病在流行病學(xué)中有著特殊的意義，因此，在反映某一國家或地區(qū)結(jié)核病疫情的嚴(yán)重程度的指標(biāo)中，涂陽患者率、涂陽發(fā)病率被更多關(guān)注。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際防癆及肺部疾病聯(lián)合會（IUATLD）針對低收入且結(jié)核病疫情嚴(yán)重的發(fā)展中國家所制定的技術(shù)指南，痰涂片AFB鏡檢是相應(yīng)國家開展結(jié)核病控制項目時，非常符合成本效益原則的細菌實驗技術(shù)，相對于臨床和實驗室經(jīng)常采用的其它診斷和檢查項目，高質(zhì)量的AFB鏡檢方法有其特有的優(yōu)勢：1.作為診斷手段，對傳染性肺結(jié)核的診斷比X線的準(zhǔn)確性高；2.作為實驗方法，技術(shù)相對簡單，容易標(biāo)準(zhǔn)化和完成操作‘3.建立AFB檢查時所需設(shè)備投入少；4.檢查成本低，易于接受；5.從受到標(biāo)本到報告結(jié)果的時間短，能夠滿足臨床診斷的需要；6.對菌陽患者的治療效果，能夠作為及時和準(zhǔn)確的評價。第二節(jié)分枝桿菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)一、分枝桿菌的形態(tài)當(dāng)患者標(biāo)本直接進行涂片鏡檢時，能夠發(fā)現(xiàn)不同的分枝桿菌形態(tài)變化較多。結(jié)核分枝桿菌多數(shù)為桿狀、稍彎曲；菌體寬度0.3～0.6μm；菌體長度不一，在0.5～8μm之間，多數(shù)在1.5～3.5μm；少數(shù)菌體較長者可呈螺旋狀；染色良好的結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)，能夠發(fā)現(xiàn)著色較深的異染顆粒，含結(jié)核分枝桿菌較多的新鮮標(biāo)本經(jīng)萋爾-尼爾遜染色（Ziehl-Neelson，Z-N，簡稱萋-尼氏染色），100×油鏡觀察，能夠發(fā)現(xiàn)單個存在的細菌、也能看到聚集成簇或分枝狀排列的細菌，多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculosismycobacteria，NTM）的形態(tài)較結(jié)核分枝桿菌短且粗，呈棒狀、短棒狀甚至顆粒狀。培養(yǎng)生長的菌落經(jīng)生理鹽水研磨、懸浮物稀釋后涂片鏡檢，結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)較標(biāo)本直接涂片的稍短且粗，常聚集而形成“索狀”；經(jīng)培養(yǎng)的NTM菌體形態(tài)與臨床標(biāo)本中的比較變化不大、且較少聚集。二、結(jié)核分枝桿菌的結(jié)構(gòu)第4頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作分枝桿菌由于細胞結(jié)構(gòu)和細胞成分的特殊性，具有經(jīng)堿性染料染色后，能夠耐受酸性介質(zhì)脫色的特征，具備相應(yīng)染色特征的細菌習(xí)慣上被稱為抗酸菌（acid-fastbacillus，AFB）。目前，除結(jié)核分枝桿菌以外（臨床上最為常見的分枝桿菌），發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌種類已達100余種。當(dāng)然，除分枝桿菌以外，還有少數(shù)細菌具有抗酸染色的特征。AFB菌體細胞結(jié)構(gòu)的完整性與其抗酸染色特性有著密切聯(lián)系。通過電子顯微鏡觀察分枝桿菌，完整的細胞結(jié)構(gòu)主要有以下部分組成：（一）細胞壁：分內(nèi)、中、外三層；外層細胞壁的主要成分－分枝菌酸，是造成分枝桿菌細胞抗酸染色特性的主要成分，中層細胞壁的只要成分有肽脂糖和磷脂蛋白，內(nèi)層細胞壁的主要成分是多糖體，分枝桿菌細胞壁的組分和結(jié)構(gòu)的完整性，對相應(yīng)細菌的抗酸染色特性起到關(guān)鍵作用。（二）細胞膜：主要由脂蛋白組成。部分細胞膜通過折疊、卷曲，能夠形成層狀結(jié)構(gòu)被稱為中介體（或間體）的細胞器。（三）細胞質(zhì)：本身致密性交叉。（四）核區(qū)：因遺傳物質(zhì)DNA和參與表達的RNA較密集而成。（五）細胞器：有主要成分為甘油三酯、抗酸染色的能力較差的脂質(zhì)空泡，和主要成分是聚磷酸鹽、具有較強的抗酸脫色性的異染小體（異染顆粒）等。第三節(jié)檢查對象根據(jù)《國家結(jié)核病防治規(guī)劃指南》的有關(guān)規(guī)定，檢查對象根據(jù)檢查目的分為兩類：一、確定診斷：凡因結(jié)核病癥狀求診及轉(zhuǎn)診的可疑結(jié)核患者，均應(yīng)進行直接涂片檢查。一般包括持續(xù)咳嗽、咳痰超過3周；咯血或伴有血痰；發(fā)熱或胸痛超過2周；胸部X線異常。確定診斷的涂片檢查應(yīng)采集3個合格的痰標(biāo)本。就診當(dāng)時在門診留一份“即時痰”標(biāo)本，同時給患者2個痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗。二、療效評價：凡已確診、登記、治療的肺結(jié)核患者，在化療期間按照規(guī)定應(yīng)定期查痰：（一）初次涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)結(jié)束時，復(fù)治涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)期結(jié)束時，各查一次晨痰。（二）初、復(fù)治涂陽患者在療程強化期接受時，痰菌仍為陽性者，應(yīng)在1個月時增加晨痰檢查一次；若復(fù)治涂陽患者治療滿3個月時痰菌仍陽性，應(yīng)在治療滿5個月增加晨痰檢查一次。（三）確診、登記的涂陰肺結(jié)核患者，即使患者因故未接受治療，也應(yīng)在登記后滿2和6個月時進行痰菌檢查。第5頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作第四節(jié)一、標(biāo)本采集：（一）用于采集標(biāo)本的容器：采用WHO推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶（見圖2），或可密封塑料盒、蠟紙盒收集痰標(biāo)本（參考規(guī)格：直徑4cm，高2cm）。痰容器上應(yīng)標(biāo)明病人的姓名、編號（初診病人門診序號或隨訪病人登記號）、檢查項目、容器序號1、2、3（1＝當(dāng)日即時痰，2＝夜間痰，3＝次日晨痰）。痰標(biāo)本的采集圖2（二）標(biāo)本的性狀：標(biāo)本容器合格的痰標(biāo)本應(yīng)是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物。1、干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色（或奶酪色）膿樣、團塊狀的肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可見大量膿性炎癥細胞、肺上皮脫落細胞。由于此類標(biāo)本是由肺部深處咳出，對肺結(jié)核的診斷最有價值，故AFB的檢出率較高。2、血痰：此類標(biāo)本是因粘液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰的細胞特征外，含新鮮血液的標(biāo)本中還可見到被染色的紅細胞。由于含血標(biāo)本易干擾AFB鏡檢的結(jié)果，故在制片時應(yīng)盡量避免挑取含血標(biāo)本。3、粘液痰：標(biāo)本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片時需仔細涂抹；涂片染色后鏡檢時，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細胞（細胞較長且形態(tài)不規(guī)則、細胞核和細胞質(zhì)著色均較深，細胞一端可見著色較淺的纖毛），伴有少量肺上皮脫落細胞（多數(shù)為圓形，細胞核較小，且著色較細胞質(zhì)深，核質(zhì)比＞1:3）、膿性炎癥細胞（卵圓形、細胞核占細胞比例較大且著色較深，核質(zhì)比＜1:1）、口腔脫落細胞及口腔寄生菌。此類標(biāo)本的AFB檢出率較唾液高。4、唾液：目視觀察標(biāo)本外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時伴有氣泡；涂片染色鏡檢時，鏡下可見少量口腔上皮脫落細胞（形態(tài)不規(guī)則、細胞核第6頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作著色較細胞質(zhì)深，核質(zhì)比接近或＞1:2）和口腔內(nèi)寄生菌，有時可見食物殘渣。由于此類標(biāo)本進行AFB檢查時的檢出率很低，用于患者確定診斷時是不合格的標(biāo)本。（三）標(biāo)本采集：根據(jù)痰標(biāo)本采集的時間，可將標(biāo)本分為三類：即時痰：就診時深呼吸后咳出的痰液。晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出的痰液。進行AFB檢查的醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)提供符合要求的標(biāo)本收集容器，醫(yī)務(wù)人員在容器上應(yīng)注明患者姓名、編號（門診序號或登記號）、檢查項目、痰標(biāo)本序號，然后交給患者。對疑似肺結(jié)核病者，臨床醫(yī)護人員應(yīng)通過解釋，使其充分了解標(biāo)本質(zhì)量對相應(yīng)檢查項目的重要性，示范并指導(dǎo)其掌握從肺部深處咳痰的方法；如患者識字，可提供宣教材料。（注意：由于當(dāng)患者咳嗽、咳痰時，易于產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠，感染周邊人群的機率較高，故采集痰標(biāo)本時應(yīng)在遠離人群的開放空間進行，或在通風(fēng)良好的室內(nèi)進行。）患者留取的痰標(biāo)本，應(yīng)由檢驗人員或經(jīng)培訓(xùn)的專人目視檢查標(biāo)本質(zhì)量（特別是用于初次診斷的痰標(biāo)本）：標(biāo)本量一般在3～5ml，標(biāo)本性狀屬于干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰者為合格的標(biāo)本；痰標(biāo)本不合格者，應(yīng)予以進一步指導(dǎo)并要求其重新送檢。進行細菌學(xué)檢查時，應(yīng)在登記本和檢驗報告單上注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時參考。第五節(jié)涂片抗酸染色檢查方法抗酸染色的基本原理：抗酸菌具有耐受酸性介質(zhì)脫色的生物性狀，此類細菌在石炭酸（苯酚）的協(xié)同作用下，被復(fù)紅染色劑著色，能夠耐受酸性酒精脫色，顯微鏡觀察時保持紫紅色；而其它脫落細胞或標(biāo)本中的非抗酸菌被酸性酒精脫色后，可被復(fù)染劑亞甲藍染為藍色。一、玻片的制備：（一）用于AFB檢查的載玻片要求：1.一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。2.每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片檢查；3.應(yīng)使用以95%乙醇擦拭（浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無油污、無劃痕的新玻片制備涂片，在玻片背面一端的1/3處注明實驗室序號及標(biāo)本序號（如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。第7頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作（二）制備涂片：小心打開留取痰標(biāo)本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢（最好在超凈工作臺中操作）。仔細觀察標(biāo)本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1ml，于玻片正面右側(cè)2/3，處均勻涂抹成10mm×20mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置，自然干燥后（一般約需要30分鐘）進行染色鏡檢。涂抹完畢后的痰標(biāo)本，在報告結(jié)果前應(yīng)暫時保留。為保證檢驗人員的安全，嚴(yán)禁在涂抹痰標(biāo)本的同時，對載玻片進行加熱。二、萋爾－尼爾遜染色法（Ziehl-Neelson，Z-N，簡稱萋－尼氏染色）：（一）試劑的配制1．石炭酸復(fù)紅染液：（1）儲存液①堿性復(fù)紅液：堿性復(fù)紅8g，加95%乙醇至100ml，充分振蕩使復(fù)紅溶解。堿性復(fù)紅乙醇儲存液應(yīng)避光保存，為保證染液的質(zhì)量，建議儲存液保存不超過6個月。②5%石炭酸水溶液：40～50℃水浴加熱石炭酸使之融解，取液態(tài)石炭酸5g溶于90ml熱蒸餾水中，待溶液冷卻至室溫時，補充蒸餾水至100ml。（2）石炭酸復(fù)紅工作液：經(jīng)定性濾紙過濾的堿性復(fù)紅儲存液10ml與5%石炭酸水溶液90ml充分振蕩、混合均勻后，用定性濾紙過濾。堿性復(fù)紅（或稱為堿性品紅，basicfuchsin，orpararosanilinechloride，分子式為C19H18NCl）用于AFB染色時，必須使用染料最低含量超過88%的生物染色劑，合格產(chǎn)品一般在試劑包裝上注明相應(yīng)含量。如果標(biāo)注的染料含量低于88%，則在配制時需調(diào)整稱取量。例如，染料含量標(biāo)注為75%的產(chǎn)品，配制100ml儲存液時實際的稱取量應(yīng)是8/0.75=10.7g。②石炭酸（苯酚，phenol，分子式為C6H6O）:應(yīng)使用熔點為40.5℃的分析純試劑。2．5%鹽酸乙醇脫色液：35%濃鹽酸5ml與95%乙醇95ml混合。3．亞甲藍復(fù)染液：（1）儲存液：亞甲藍0.3g溶于95%乙醇50ml中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。（2）亞甲藍復(fù)染液：以蒸餾水5倍稀釋0.3%亞甲藍儲存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲藍的終濃度為0.06%，使用定性濾紙過濾，即得亞甲藍染液。亞甲藍（methylenebluechloride，ormethylthioninechloride，分子式為C16H18ClN3S）：染色時必須使用染料含量超過82%的生物染色劑。第8頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作4．萋－尼氏染色步驟：1.涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上的距離；火焰固定（在5秒鐘內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。2.滴加石炭酸復(fù)紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液。加溫時勿使染色液沸騰。3.流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標(biāo)本上剩余的水。4.自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色1分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。5.流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。6.滴加亞甲藍復(fù)染液，染色30秒鐘。7.流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復(fù)染液，然后瀝去標(biāo)本上剩余的水，待玻片干燥后鏡檢。一張染色合格的玻片，由于被亞甲藍染色而呈亮藍色。將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，表明該玻片涂抹過厚。三、熒光染色法：AFB采用熒光染色法鏡檢，只限于那些日常工作量較大（日讀片數(shù)超過25張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員閱讀熒光染色玻片具有豐富經(jīng)驗的實驗室開展。（一）試劑配制1.染色劑（金胺O染液）金胺O☆石炭酸乙醇補蒸餾水至☆1501001000gmlmlml金胺O（auramineO，分子式為C17H21N3·HCl）：用于AFB染色時必須使用最低染料含量約80%的生物染色劑。2.3.脫色劑：3%鹽酸乙醇（配制方法參照萋尼氏染色）。復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。（二）染色步驟：1.玻片經(jīng)火焰固定，滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。第9頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作2.自痰膜上端外緣滴加染色劑，布滿痰膜，脫色3分鐘或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。3.滴加復(fù)染劑復(fù)染2分鐘，瀝去復(fù)染劑，自然至干燥，準(zhǔn)備鏡檢。四、鏡檢讀片：（一）萋－尼氏染色玻片鏡檢使用10×目鏡雙目顯微鏡讀片。取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40×物鏡，轉(zhuǎn)動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調(diào)節(jié)至適當(dāng)亮度，調(diào)節(jié)焦距至可見細胞形態(tài)；移開40×物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100×油鏡進行細致觀察。在淡藍色背景下，抗酸菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。為防止AFB的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。由于香柏油（cedarwoodimmersionoil）能溶解復(fù)紅染料，使萋-尼氏染色退色，并且容易干燥凝結(jié)，對油鏡頭造成損害，故推薦使用專門用于100×油鏡、不干燥、不變硬的鏡油（immersionoil）。讀片時，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰的視野，當(dāng)玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉(zhuǎn)換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推。通常10mm×20mm的痰膜，使用100×油鏡，每行可觀察約100個視野。仔細觀察完300個視野，一般需要5分鐘以上；每個工作日，一位鏡檢人員的玻片閱讀量不要超過25張，且連續(xù)閱讀10～12張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。圖3（二）熒光染色玻片鏡檢：鏡檢讀片移動方式玻片放置在載片臺上并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑似為AFB的桿狀熒光顆粒時，使用40×物鏡確認。在暗背景下，抗酸桿菌發(fā)出桿狀熒光。第10頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作相應(yīng)波長光線激發(fā)染料產(chǎn)生可視光的能力，隨著時間而衰減。故熒光染色后的涂片應(yīng)于當(dāng)日鏡檢；如果玻片數(shù)量過多，應(yīng)將涂片放置于4℃避光保存，次日必須完成鏡檢。五、鏡檢結(jié)果報告：由于與疾病傳染性的程度及其相應(yīng)嚴(yán)重程度密切相關(guān)，故鏡檢時發(fā)現(xiàn)細菌的數(shù)量是非常重要的參考依據(jù)。因此痰涂片鏡檢的結(jié)果報告，不僅是對疾病的定性，也是對疾病嚴(yán)重程度的半定量。（一）萋－尼氏染色鏡檢結(jié)果分級報告標(biāo)準(zhǔn)：抗酸桿菌陰性（－）：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條/300視野?？顾釛U菌陽性（1+）：3～9條/100視野?？顾釛U菌陽性（2+）：1～9條/10視野?？顾釛U菌陽性（3+）：1～9條/每視野?？顾釛U菌陽性（4+）：≥10條/每視野。（二）熒光染色鏡檢結(jié)果分級報告標(biāo)準(zhǔn)：熒光染色抗酸桿菌陰性（－）：0條/50視野。熒光染色報告抗酸桿菌陽性（報告抗酸菌數(shù)）：1～9條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10～99條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/每視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（3+）：10～99條/每視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（4+）：≥100條/每視野。六、抗酸染色玻片的保存：閱讀完萋－尼氏染色玻片后，應(yīng)及時用浸滿二甲苯（分析純）的擦鏡紙揭取數(shù)次，徹底去除玻片上的鏡油。經(jīng)脫油、干燥后的玻片，按實驗室序號及涂片編號放置在玻片盒中，存放在陰涼干燥的環(huán)境中，以備復(fù)檢或質(zhì)控抽檢。熒光染色的玻片，玻片盒中放置干燥劑后密封放置在4℃冰箱保存。熒光染色涂片質(zhì)控時，應(yīng)首先將復(fù)檢涂片進行萋－尼氏染色后，重新閱讀。七、痰涂片抗酸染色檢查注意事項（一）AFB痰檢假陽性結(jié)果的預(yù)防措施1.2.必須使用新的載玻片進行痰涂片檢查。每個標(biāo)本均使用一個新竹簽完成制片涂抹。第11頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作.7.8.9.所有染液均經(jīng)過過濾。染色時玻片彼此之間保持一定距離，相互徹底分隔開。嚴(yán)禁使用染色缸將玻片放置一起染色。染色時勿使玻片上的染液干燥。滴加鏡油時，嚴(yán)禁容器滴口直接接觸玻片痰膜。嚴(yán)禁物鏡鏡頭直接接觸玻片痰膜。完整、準(zhǔn)確的標(biāo)注痰盒、玻片和實驗室登記本的各項內(nèi)容。10.登記前、后對檢驗單和標(biāo)本盒上的標(biāo)注進行仔細核對。11.準(zhǔn)確記錄和報告結(jié)果。（二）AFB痰檢假陰性結(jié)果的預(yù)防措施..9.確認標(biāo)本是痰而非唾液。確認每份標(biāo)本至少有3ml。選擇膿樣、干酪樣、粘液分泌物涂抹制備玻片。制備玻片時標(biāo)本涂抹均勻，不要太厚或太薄。使用高質(zhì)量染料、嚴(yán)格按照配方配制染液。嚴(yán)格按照操作程序完成染色過程。判斷結(jié)果為“陰性”前，必須閱讀規(guī)定要求的視野數(shù)。作為對照，可采用已知結(jié)果為陽性的玻片，完成染色鏡檢過程。完整、準(zhǔn)確地標(biāo)注痰盒、玻片和實驗室登記本。10.登記前對檢驗單和標(biāo)本盒上的標(biāo)注進行仔細核對。11.準(zhǔn)確記錄和報告結(jié)果。第六節(jié)涂片抗酸染色檢查材料管理一、顯微鏡日常維護顯微鏡作為發(fā)現(xiàn)涂片陽性病人的重要設(shè)備，實驗室工作人員應(yīng)正確使用并給予正確維護，以保證其正常工作和延長使用壽命。在使用和維護顯微鏡時應(yīng)特別遵守下列要點：1.顯微鏡應(yīng)放置在干燥、無塵和通風(fēng)的環(huán)境中。如果顯微鏡一段時期內(nèi)停止使用，應(yīng)拆開并放置在原包裝盒內(nèi)，并放置有效的干燥劑。2.使用前和使用后必須使用擦鏡紙徹底清潔物鏡。3.嚴(yán)禁物鏡鏡頭直接接觸玻片上痰膜。4.使用油鏡時，只能使用細螺旋調(diào)節(jié)焦距。第12頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作5.使用電光源顯微鏡時，注意電壓和電流是否與儀器要求相匹配。二、AFB鏡檢耗材管理:為保障痰涂片檢查工作能夠連續(xù)不斷開展，應(yīng)儲存一定數(shù)量的實驗耗材和相應(yīng)試劑，儲備量可根據(jù)既往每季度工作量來進行評估，一般應(yīng)準(zhǔn)備比平均工作量高20%的相應(yīng)耗材和試劑。每個查痰點每檢查1000份痰標(biāo)本所消耗的材料列表如下表1實驗室準(zhǔn)備耗材材料、試劑名稱痰盒竹簽載玻片鏡油復(fù)紅金胺O（如使用熒光染色）石炭酸亞甲藍濃鹽酸☆用量（每檢查1000份痰標(biāo)本）1100110011001104052501.5500個個張mlggggml備注每張玻片染色使用兩種染液各約5ml、脫色液約10ml95%酒精☆10000ml6110110張ml本個定性濾紙二甲苯擦鏡紙載玻片盒(100張/盒)☆鹽酸、酒精的消耗量根據(jù)脫色情況可能需要調(diào)整。參考文獻：1.《全國結(jié)核病防治工作手冊》，衛(wèi)生部疾病控制司、衛(wèi)生部醫(yī)政司編，1999。2.TechnicalGuide.SputumExaminationforTuberculosisbyDirectMicroscopyinLowIncomeCoutries.5thedition,IUATLD,2000.3.TheMicoscope.APracticalGuide.WHOProject:ICPTUB001.NewDelhi,India:WHORegionalOfficeforSouth-EastAsia,1999.4.LaboratoryBiosafetyManual.2ndedition.Geneva:WHO,1993:60-61.第13頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作附件1：檢驗單參考樣式結(jié)防所（科）痰結(jié)核桿菌檢驗單姓名(初診病人)門診序號：痰涂片檢查結(jié)果：送檢醫(yī)生：報告人：送檢日期：報告日期：性別年齡實驗序號：(隨訪病人)登記號：附件2：結(jié)核病細菌學(xué)實驗室登記本痰標(biāo)本來源實驗日姓性年初診病人初診病人隨訪病人序號期名別齡住址(門診序號)(登記號)123123說明：痰性質(zhì)按照痰標(biāo)本為：干酪痰、血痰、粘液痰分別填寫，唾液為不合格痰，應(yīng)囑病人重新送合格的痰標(biāo)本。標(biāo)本性質(zhì)結(jié)果日期簽名備注標(biāo)本鏡檢結(jié)果第14頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作第三章痰涂片實驗室質(zhì)量保證按照世界衛(wèi)生組織（WHO）和國家結(jié)核病防治規(guī)劃（NTP）的要求，在我國已全面推行DOTS策略或DOTS策略得到良好貫徹執(zhí)行的地區(qū)，為了持續(xù)提高結(jié)核病實驗室痰涂片檢查的工作效率和可靠性，必須建立我國結(jié)核病實驗室質(zhì)量保證系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，在實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實驗室間質(zhì)量檢查和評估方法，進行實驗室檢查系統(tǒng)的評價，并通過采取一系列措施改經(jīng)和不斷提高實驗室業(yè)務(wù)總體水平。第一節(jié)室內(nèi)質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制（QualityControl，QC）是指實驗室內(nèi)部的操作規(guī)程、設(shè)備和耗材、痰標(biāo)本收集、染色劑制備、涂片制備和染色、顯微鏡維護、顯微鏡鏡檢、結(jié)果登記和報告、以及痰片保存等整個過程中的內(nèi)部檢查和監(jiān)測。一、痰標(biāo)本收集（一）容器：采用WHO推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶，或可密封塑料盒、蠟紙盒收集標(biāo)痰本（參考規(guī)格：直徑4cm，高度2cm）。痰容器應(yīng)標(biāo)明病人姓名、日期、編號（初診病人門診序號或隨訪病人登記號）和容器序號1、2、3（1＝當(dāng)日即時痰，2＝夜間痰，3＝次日即時痰）。（二）痰標(biāo)本性質(zhì)：干酪痰、血痰、粘液痰為合格標(biāo)本；唾液或口水為不合格標(biāo)本，除照常進行涂片檢查外，應(yīng)要求患者重新送檢。（三）初診病人應(yīng)收集3份痰標(biāo)本（當(dāng)日即時痰、夜間痰和次日晨痰）、治療中或復(fù)診隨訪病人安裝每次收集2份痰標(biāo)本（當(dāng)日即時痰、當(dāng)日或次日晨痰）。（四）對當(dāng)日不能進行涂片檢查的標(biāo)本，須置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。二、抗酸染色液制備（一）有染色液制備配方和配置記錄。（二）染色液試劑瓶須表明染色液名稱、濃度和制備時間。（三）染色液置于棕色瓶內(nèi)存放，避光保存。三、載玻片（一）新載玻片應(yīng)經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹1份痰標(biāo)本。（三）載玻片只允許一次使用，嚴(yán)禁清洗后重復(fù)使用。（四）載玻片正面左側(cè)1/3處標(biāo)注實驗室序號（如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。第15頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作（五）載玻片正面右側(cè)2/3中央處均勻涂抹成面積為10×20mm的卵圓形痰膜。四、染色（一）肉眼觀察染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。（二）將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚。（三）染色后的痰膜脫離部分應(yīng)小于整個涂抹面積的10%。五、鏡檢要求（一）為防止抗酸菌的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡頭直接接觸涂片上的痰膜。（二）仔細觀察300個視野。（三）每個工作日，一名鏡檢人員的涂片閱讀量不應(yīng)超過25張。（四）連續(xù)閱讀10～12張涂片后，應(yīng)休息20分鐘左右。（五）采用自查和互查方式，至少抽查復(fù)檢當(dāng)日10%涂片，并填寫室內(nèi)質(zhì)控登記表（表2）。表2室內(nèi)質(zhì)量控制每日涂片抽查復(fù)檢登記表20日期合計鏡檢涂片數(shù)陰性陽性初檢者簽名抽查復(fù)檢涂片數(shù)痰涂片符合數(shù)年月復(fù)檢者簽名第16頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作合計六、登記報告（一）登記前后應(yīng)對檢驗單、標(biāo)本盒、涂片上的標(biāo)注進行反復(fù)核對。（二）檢查后的每一張涂片結(jié)果，應(yīng)按規(guī)定準(zhǔn)確記錄在“結(jié)核病細菌學(xué)實驗室登記本”上。（三）鏡檢結(jié)果報告應(yīng)及時發(fā)出，以便盡早為臨床提供診斷依據(jù)。七、痰涂片保存（一）鏡檢后的涂片應(yīng)及時用浸滿二甲苯（分析純）的擦鏡紙揭取數(shù)次，徹底祛除涂片上的鏡油。（二）涂片脫去鏡油后，必須再次核對實驗室登記本與每張涂片實驗序號。（三）涂片上嚴(yán)禁標(biāo)記鏡檢的陰、陽性結(jié)果。（四）全部涂片按實驗室登記本序號連續(xù)排列，存放于玻片盒內(nèi)。第17頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作（五）涂片保存與實驗室登記本記錄應(yīng)一致。初診病人每一張涂片存入涂片盒后需預(yù)留出兩個空位置，以備第二張、第三張涂片檢查后放入；隨訪病人第一張涂片存入涂片盒后需要預(yù)留出1個空位置，以備第二張涂片檢查后放入。（六）按規(guī)定數(shù)量保存的用于室間質(zhì)量評估的涂片，未經(jīng)上級質(zhì)控單位準(zhǔn)許不能自行銷毀。（七）裝滿涂片的玻片盒，需用標(biāo)簽注明涂片實驗序號區(qū)間和日期區(qū)間，以便日后盲法復(fù)檢或現(xiàn)場評價時抽樣。第二節(jié)室間質(zhì)量評估室間質(zhì)量評估是根據(jù)與其它網(wǎng)絡(luò)實驗室（中間級實驗室和中心實驗室）比較批量測試和盲法復(fù)檢結(jié)果評價基層實驗室能力的過程。EQA包括實驗室現(xiàn)場評估以評價操作質(zhì)量并且也包括現(xiàn)場對涂片的復(fù)讀。EQA是國際肺病和防癆聯(lián)合會描述的熟練度檢測的擴大。一、現(xiàn)場評價（一）要求：1.現(xiàn)場評價之前首先建立下級實驗室技術(shù)檔案，由被督導(dǎo)實驗室填寫附件1"結(jié)核病實驗室基本情況登記表"，每次現(xiàn)場評價時需重新核實登記內(nèi)容。2.國家參比室每年對省級參比室至少進行1次現(xiàn)場評價，同時每省至少抽查一個市、縣級結(jié)核病實驗室。3.省級參比室每年對所轄市級實驗室至少進行1次現(xiàn)場評價，同時每地（市）抽查1～2個縣級實驗室；必要時，對批量檢測或盲法復(fù)檢存在問題的市、縣實驗室，適當(dāng)增加現(xiàn)場評價頻率。4.市（地）級實驗室每年對所轄縣（區(qū)）實驗室每年至少進行2次現(xiàn)場評價。5.對批量檢測或盲法復(fù)檢存在問題的縣級實驗室必須盡快查找原因，提高涂片鏡檢質(zhì)量。6.現(xiàn)場督導(dǎo)員應(yīng)由經(jīng)驗豐富的實驗室技術(shù)人員擔(dān)任，必須經(jīng)高一級實驗室有資格督導(dǎo)員培訓(xùn)后方可上崗。7.現(xiàn)場評價要按本操作細則所列項目順序進行，評價結(jié)果可結(jié)合當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病控制工作考核評比給分。8.現(xiàn)場督導(dǎo)員的主要責(zé)任是通過現(xiàn)場評價發(fā)現(xiàn)問題，提出正確的建議解決問題，提高痰涂片鏡檢質(zhì)量。9.上級實驗室對下級進行督導(dǎo)的時候，應(yīng)當(dāng)核對調(diào)查表和評估實驗室實際情況，為此各級調(diào)整表應(yīng)當(dāng)保存五年以上。（二）檢查步驟：現(xiàn)場評價操作步驟第18頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作1.試劑檢查的問題試劑名稱現(xiàn)在的染色劑是否都可使用？最近3個月是否試劑短缺？使用試劑是否在有效期內(nèi)？鏡油粘度是否合適？石炭酸復(fù)紅亞甲藍5％鹽酸乙醇鏡油二甲苯如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：指可用性是是是是是否否否否否標(biāo)足夠用量是是是是是否否否否否2.供應(yīng)檢查的問題原料玻片儲片盒標(biāo)準(zhǔn)痰盒下列原料可以是否得到？痰盒規(guī)格是否標(biāo)準(zhǔn)？是否供應(yīng)存放的儲存片盒符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)？是否數(shù)量足夠？近3個月是否供應(yīng)短缺？有否蒸餾水？水是否保存在無菌瓶子里？玻片記號筆竹（木）簽漏斗濾紙染色架燈或燃器燈用燃料擦鏡紙玻璃刻刀供水天平指可用性是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否標(biāo)質(zhì)量是否優(yōu)良是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否充分供應(yīng)是是是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否第19頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：3.實驗室安全檢查的問題痰涂片檢查在哪里進行？指標(biāo)結(jié)果是否在一個與其它實驗室隔開的地方進行有保證涂片和鏡檢獨立操作的桌子是否是否實驗室是否通風(fēng)？如果在打開的窗前涂片，技術(shù)員是否知道氣流方向和潛在的危險？用哪種消毒劑？近3個月有消毒劑的短缺嗎？實驗室多長時間消毒一次？用過的玻片怎樣處理？是否可重復(fù)使用？有充分的安全通風(fēng)系統(tǒng)使用針對TB的消毒劑消毒劑供應(yīng)充足工作的地方應(yīng)當(dāng)每天清潔消毒已經(jīng)涂抹過標(biāo)本的玻片不允許重復(fù)使用是否是否是否是否用過的痰容器怎樣處理？是否可重復(fù)使用？痰容器為一次性使用，用過的痰容器應(yīng)銷毀是否是否有生物危害廢物桶？是否有實驗室防護服？離開實驗室前是否應(yīng)該脫掉試驗服？實驗室是否使用手套？使用是否合適？使用有蓋的生物危害廢物桶在實驗室應(yīng)穿好防護服試驗服不能穿出實驗室以外應(yīng)戴防護手套，手套的種類應(yīng)符合所從事安全工作的要求是否是否是否是否試驗結(jié)束后是否洗手？實驗室是否有上下水？實驗室是否潔凈有序？下班后，是否關(guān)閉實驗室門窗？是否例行安全檢查？如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：遵守正確的洗手程序?qū)嶒炇覒?yīng)當(dāng)有上下水干凈整潔，物品擺放有序關(guān)閉好門窗，巡視檢查。確保安全后離去是否是否是否是否第20頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作4.顯微鏡檢查的問題是否有顯微鏡？數(shù)量是否充分？顯微鏡功能是否正常？指標(biāo)結(jié)果是否至少有一臺專用于分枝桿菌的顯微鏡。還有另外的顯微鏡備用。隨機鏡檢，通過顯微鏡能觀察到清晰的視野、機械調(diào)節(jié)性能良好。是否顯微鏡工作場所合適嗎？是否有充足的光源？場所能夠適當(dāng)變更具備功能良好的燈泡和電源，或顯微鏡放置在適當(dāng)?shù)墓庠刺幨欠袷欠袷欠癯Ｒ?guī)維護顯微鏡？有油鏡頭，且功能完好整機干凈清潔，有專人負責(zé)常規(guī)檢查維護是否是否雙目顯微鏡？是雙目顯微鏡是否如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：5.用于室間質(zhì)量評估的玻片儲存檢查的問題所有保存的玻片，是否符合室間質(zhì)量評估計劃的要求？所有玻片是否保存在玻片盒內(nèi)？玻片盒上是否有標(biāo)記？所有玻片保存之前是否經(jīng)二甲苯脫油？玻片盒內(nèi)玻片有無交叉污染？指標(biāo)結(jié)果是否玻片保存符合室間質(zhì)量評估規(guī)定，所有玻片保存與結(jié)核病實驗室登記本一致。玻片保存在玻片盒內(nèi)，玻片盒上應(yīng)按室內(nèi)質(zhì)控要求，標(biāo)記實驗序號和時間。玻片保存之前必須經(jīng)二甲苯處理，玻片之間無重疊污染。是否是否如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：第21頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作6.涂片、染色和鏡檢檢查的問題痰盒上病人標(biāo)記是否完善？是否使用新的玻片進行抗酸桿菌痰涂片？所有的玻片，使用前是否清潔？涂片上是否有標(biāo)記？石炭酸復(fù)紅多長時間過濾一次？亞甲藍多長時間過濾一次？指標(biāo)結(jié)果是否是否痰盒上標(biāo)記有病人姓名及痰盒序號使用新的玻片進行抗酸桿菌痰涂片，玻片使用前要清潔處理涂片按要求標(biāo)記實驗序號石炭酸復(fù)紅至少每周過濾一次亞甲藍至少每月過濾一次，如果涂片上見到沉淀物及時過濾是否是否是否涂抹一張涂片是否使用一個新木簽？固定以前，涂片是否在空氣中干燥？涂片是否經(jīng)過加熱固定？通常一批染色多少張涂片？每張涂片使用一個新木簽固定以前，涂片在空氣中要干燥完全經(jīng)火焰3～5次加熱固定一批最多10～12張涂片石炭酸復(fù)紅熱染5分鐘，染色劑不允許是否是否是否是否染色過程是如何進行的？用石炭酸復(fù)紅和亞甲藍染色要多久？怎么脫色？在玻片上干燥，鹽酸酒精脫色一分鐘，僅必要時重復(fù)脫色，不要脫色過度，亞甲藍復(fù)染1分鐘是否染色劑做質(zhì)量檢測嗎？試劑必須用已知陽性玻片進行檢驗，至少每月一次是否顯微鏡用多久用擦鏡紙清理一次？報告一個陰性結(jié)果要觀察多少個視野？報告一個陽性結(jié)果要觀察多少個視野？檢查完每張涂片后，均擦干物鏡300個視野應(yīng)當(dāng)檢查足夠的視野以提供精確的數(shù)量等級。菌量少時至少100個視野是否是否是否是否掌握陽性涂片的分級報告標(biāo)準(zhǔn)？準(zhǔn)確掌握陽性結(jié)果的分級報告標(biāo)準(zhǔn)是否如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：第22頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作7.現(xiàn)場復(fù)檢7A現(xiàn)場評價時督導(dǎo)員至少要抽查3張陽性涂片試驗序號＋＋＋7B痰片復(fù)檢評價復(fù)督導(dǎo)結(jié)果與實驗室的結(jié)果一致嗎?抗酸桿菌染色和背景染色可以接受嗎？背景材料顯示，是痰嗎？涂片厚度適當(dāng)嗎？涂片面積大小合適嗎？如有填寫“否”的項目，請簡要說明原因：檢評價是否是否是否是否是否自檢結(jié)果督導(dǎo)結(jié)果抗酸桿菌染色背景染色痰或唾液涂片厚度和大小8.督導(dǎo)小組檢查和/或復(fù)檢印象（1）現(xiàn)場督導(dǎo)和復(fù)檢結(jié)果按國家結(jié)核病防治規(guī)劃要求是可以接受的嗎？（2）如果不是，通過現(xiàn)場督導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的問題需要糾正嗎？請解釋糾正措施的必要性：是否是否9.盲法復(fù)檢痰片抽樣（詳見“盲法復(fù)檢”）10.現(xiàn)場評估概述第23頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作列出現(xiàn)場檢查鐘的主要問題，并提出解決的辦法：A.操作問題：B.技術(shù)問題：C.設(shè)備及供應(yīng)問題：現(xiàn)場評估人簽名：第24頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作二、盲法復(fù)檢（一）盲法復(fù)檢原則1.從各個實驗室抽取的涂片樣品必須是隨機選出，并能代表整個實驗室的操作水平。2.負責(zé)抽樣的督導(dǎo)員（再次復(fù)驗者），必須保證復(fù)檢技術(shù)人員（初次復(fù)驗者）不知道初檢結(jié)果，以確保盲法復(fù)檢真實性。3.按隨機原則選出的涂片，無論涂片質(zhì)量或鏡檢結(jié)果如何，都應(yīng)包括在樣本中，保證抽取的樣本在統(tǒng)計學(xué)上真正代表被評估的實驗室的總體水平。4.涂片初檢結(jié)果與初次復(fù)驗者盲法復(fù)檢結(jié)果之間的分歧，由再次復(fù)驗者復(fù)檢后最終確定。5.被督導(dǎo)的實驗室必須能夠得到及時的復(fù)檢結(jié)果反饋，以有利于涂片技術(shù)與質(zhì)量的不斷提高。（二）各級實驗室盲法復(fù)檢分工盲法復(fù)檢需要一個有效的結(jié)核病實驗室質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)支持，網(wǎng)絡(luò)中的各個實驗室承擔(dān)的工作如下：1.省參比室為再次復(fù)驗者，負責(zé)實施地（市）和部分縣級實驗室涂片現(xiàn)場抽樣，安排初次復(fù)驗者之間的盲法復(fù)檢；對涂片初檢結(jié)果和盲法復(fù)檢結(jié)果的分歧進行復(fù)檢，并將質(zhì)控結(jié)果及時反饋給被督導(dǎo)實驗室和初次復(fù)驗者。2.市（地）實驗室承擔(dān)初次復(fù)驗者和再次復(fù)驗者雙重責(zé)任。作為初次復(fù)驗者需完成省參比室下發(fā)涂片樣本的盲法復(fù)檢；作為再次復(fù)驗者要負責(zé)實施縣級實驗室涂片樣本現(xiàn)場抽樣，安排初次復(fù)驗者之間的盲法復(fù)檢，對涂片初檢結(jié)果和盲檢結(jié)果的分歧進行復(fù)檢，并將質(zhì)控結(jié)果及時反饋給被督導(dǎo)實驗室和初次復(fù)驗者。3.縣級實驗室為初次復(fù)驗者，負責(zé)完成市（地）實驗室下發(fā)涂片樣本的盲法復(fù)檢，復(fù)檢完成后，結(jié)果和涂片樣本需及時上交。4.省參比室對市（地）級實驗室的盲法復(fù)檢，每半年應(yīng)進行1次；市（地）級實驗室對縣級實驗室的盲法復(fù)檢，每季度進行1次。5.抽樣由上一級實驗室督導(dǎo)員現(xiàn)場評價時完成，或在國家規(guī)劃人員進行常規(guī)督導(dǎo)時，可以完成痰涂片抽樣的任務(wù)。（三）涂片樣本量1.樣本量估算：盲法復(fù)檢的關(guān)鍵是復(fù)檢結(jié)果能否真正代表被督導(dǎo)實驗室的實際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性（針對陰性涂片）、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復(fù)檢在統(tǒng)計學(xué)意義上可以代表被評估第25頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作實驗室的總體水平（見表3）。表3樣本量計算表上一年陰性涂片的總數(shù)30040050070010002000500010000200002.5%1852172432813183764234414505.0%1291431541671801972082132157.5%101108114121128135141142143涂片陽性率10.0%808689929610010310410413.0%67707175767980808215.0%59616265666869696918.0%505152545556575757說明：a涂片陽性率：指所有檢測的涂片中陽性涂片的比例（平均陽性率）。b前一年陰性涂片總數(shù)：每年涂片的總數(shù)減去全年陽性涂片數(shù)。c抽樣時，當(dāng)上一年陰性涂片數(shù)量和涂片陽性率不在選擇點，陰性涂片數(shù)值選擇采用區(qū)間上限和涂片陽性率采用區(qū)間下限。2.保存樣本量的要求：根據(jù)結(jié)核病實驗室登記本記錄，按照棄前留后的原則，保存近期3個月全部痰涂片待檢（如果年涂片量不足500張，必須全部保存待檢）。每次抽樣后按照督導(dǎo)員的要求，再繼續(xù)留存今后待查涂片。抽樣后剩余痰涂片的銷毀應(yīng)在督導(dǎo)員監(jiān)督下進行。（四）抽樣量與抽樣方法1.根據(jù)樣本量表，核實被督導(dǎo)實驗室“上一年陰性涂片數(shù)”和“涂片陽性率”，確定一年應(yīng)復(fù)檢的痰片量。如：該實驗室前一年陰性涂片總數(shù)為3000張、涂片陽性率為9%，一年抽樣復(fù)檢涂片量為141張。2.確定本次現(xiàn)場涂片抽樣量，如：按每季度計算應(yīng)抽樣36張，按每半年計算應(yīng)抽樣72張。第26頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作3.通過實驗室登記本核實保存涂片數(shù)量并確定如何抽樣，如：經(jīng)核實上一季度留存涂片790張，用790/36=21.9，確定每隔22張選取一張涂片（不按實驗室登記本序號抽取，按序號內(nèi)實際檢測涂片量計數(shù)選?。?。4.根據(jù)以上計算，按實驗室登記本選取涂片，如果抽樣片丟失或損壞，選擇下一張，如：實驗序號93-3丟失，選擇94-1；再從94-2開始計算間隔抽取下一張涂片。5.取出涂片按順序擺放在玻片盒6.填寫表二“復(fù)檢質(zhì)控記錄”中實驗室序號和自檢結(jié)果，表三“初檢質(zhì)控記錄”實驗室序號。（五）復(fù)檢步驟1.表4由再次復(fù)驗者留存。在到達另一個實驗室現(xiàn)場抽樣時，將表5與抽樣涂片同時交給該實驗室（初次復(fù)驗者），限期一個月完成盲法復(fù)檢。如果抽檢涂片是熒光染色，應(yīng)先使用5%鹽酸乙醇脫去熒光劑，再用萋尼氏染色法染色后，進行復(fù)檢。2.再次復(fù)驗者收到初次復(fù)驗者交回的復(fù)檢結(jié)果和抽樣涂片后，核對盲法復(fù)檢結(jié)果和表4中的初檢結(jié)果，首先對兩者間存在分歧的涂片進行復(fù)檢，然后再復(fù)檢10%涂片樣品；肉眼觀察部分以初次復(fù)驗者結(jié)果為參考，全部重新復(fù)檢，以再次復(fù)驗者結(jié)果為準(zhǔn),并將最終結(jié)果記錄在表6中。3.再次復(fù)驗者完成復(fù)檢后，填寫表6“痰涂片盲法復(fù)檢結(jié)果登記表”。表4再次復(fù)驗質(zhì)控記錄鏡檢復(fù)驗結(jié)果試驗序號初檢結(jié)果結(jié)果痰細胞（>10個/視野）大小肉眼觀察厚薄染色脫落（<10%）受檢單位：合計日期：負責(zé)人簽名：第27頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作表5初次復(fù)驗質(zhì)控記錄鏡檢復(fù)驗結(jié)果試驗序號結(jié)果痰細胞（>10個/視野）大小肉眼觀察厚薄染色脫落（<10%）符合率日期：復(fù)驗者簽名：第28頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作表6痰涂片盲法復(fù)檢結(jié)果登記表單位名稱：質(zhì)控次數(shù)登記日期初檢結(jié)果（＋）（－）計初次復(fù)驗單位復(fù)檢結(jié)果（＋）（－）再次復(fù)驗單位復(fù)檢結(jié)果痰細胞涂抹大小合格數(shù)厚薄合格數(shù)染色合格數(shù)痰膜脫落合格數(shù)定性錯誤假陰假陽（＋）（－）合格數(shù)1234合計評價及建議：簽名：日期：第29頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作（六）復(fù)檢結(jié)果評價盲法復(fù)檢不是為了驗證單個病人診斷正確與否,而是評價整個實驗室操作水平。評價的內(nèi)容除了涂片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括涂片樣品的質(zhì)量（痰液與唾液的比例）、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，改善實驗室工作質(zhì)量。1.誤差分類（1）定性錯誤包括高假陽性和高假陰性◆高假陽性（HighFalsePositive，HFP）：陰性片被錯誤地判讀為2＋～4＋陽性?！舾呒訇幮裕℉ighFalseNegative，HFN）：2＋～4＋陽性涂片被錯誤地判讀為陰性。（2）定量錯誤包括量化誤差、低假陽性和低假陰性◆量化誤差（QuantificationError，QE）：同一張陽性涂片受檢方和控制方陽性判斷級別的差異?！舻图訇栃裕↙owFalsePositive，LFP）：陰性涂片被錯誤地判斷為低陽性（1＋以下）?！舻图訇幮裕↙owFalseNegative，LFN）：低陽性（1＋以下）涂片被錯誤地判斷為陰性。2.常見“誤差”原因誤差類型可能原因1)假象（例如著色沉淀或結(jié)晶）被誤識為抗假陽性（FP）酸桿菌2)抗酸桿菌來自以前陽性涂片的鏡油3)原始報告后著色的抗酸桿菌退色1）觀察涂片的視野數(shù)量不足2）顯微鏡檢查技術(shù)能力差假陰性（FN）3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對比不足或過高）4）顯微鏡存在問題5）染液質(zhì)量查1）觀察涂片時間不足量化誤差（QE）2）陽性涂片的分級報告標(biāo)準(zhǔn)掌握差3）顯微鏡檢查技術(shù)能力差4）顯微鏡存在問題1.2.3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)1、2、3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡5）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液建議1、2）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。3）對假陽性涂片重新著色并復(fù)檢第30頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作（七）復(fù)檢結(jié)果反饋1.盲法復(fù)檢的最終目的是提高實驗室涂片鏡檢的質(zhì)量，必須按規(guī)定、持續(xù)和及時地向下級實驗室反饋復(fù)檢結(jié)果。2.復(fù)檢發(fā)現(xiàn)的假陽性或假陰性涂片，由復(fù)檢單位保存，以便最初的檢驗人員了解自己的失誤，查找原因提高檢測質(zhì)量。3.初次復(fù)驗者對最初的涂片結(jié)果并不清楚,應(yīng)當(dāng)將再次復(fù)驗者的結(jié)果反饋給初次復(fù)驗者，使其有機會了解自身水平。4.5.反饋內(nèi)容應(yīng)包括造成失誤可能存在的原因，和技術(shù)改進建議。對存在嚴(yán)重誤差（定性錯誤和頻繁的定量錯誤）的實驗室，再次復(fù)驗者應(yīng)及時反饋信息，并進行現(xiàn)場調(diào)查，協(xié)助查找原因解決問題。6.按統(tǒng)一要求填寫反饋報告。盲法復(fù)檢結(jié)果反饋報告受檢單位：表7復(fù)檢記錄（按表4統(tǒng)計下列結(jié)果）初檢結(jié)果陰性1～2條1＋2＋3＋4＋涂片數(shù)陰性1～2條復(fù)檢結(jié)果1＋2＋3＋4＋表8統(tǒng)計誤差：按表7統(tǒng)計高假陽性低假陽性高假陰性低假陰性量化誤差合計評價與建議：第31頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作盲法復(fù)檢舉例：以某市結(jié)防機構(gòu)，對縣級結(jié)防機構(gòu)現(xiàn)場抽樣為例。步驟第一步根據(jù)上一年結(jié)核痰檢情況，需了解：上一年鏡檢的所有涂片數(shù)、陰性涂片數(shù)、陽性涂片數(shù)舉例實驗室A縣涂片數(shù)/年1534陽性片數(shù)/年224陰性片數(shù)/年1310步驟第二步計算每個實驗室的陽性率（SPR）并精確至0.1%SPR=（每年的陽性涂片數(shù)/每年涂片總數(shù)）×100%最好根據(jù)上一年的實驗室記錄來計算應(yīng)包括初診和隨訪的所有涂片舉例實驗室A縣涂片數(shù)/年1534陽性片數(shù)/年224SPR14.6%第32頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作步驟第三步根據(jù)表一：標(biāo)本量計算表在表的左邊，從表一行往下找到本縣每年檢測的陰性涂片的平均工作量。在表的頂端，找到本縣相應(yīng)的SPR。在表鐘相應(yīng)位置查出需抽檢樣本量的大小本例中全年陰性涂片數(shù)為1310張樣本量表中選取陰性涂片2000張一欄本例中全年SPR為14.6%樣本量表中選取SPR13.0%一欄抽檢樣本量＝79注：抽樣時，當(dāng)上一年陰性涂片數(shù)量和涂片陽性率不在選擇點，陰性涂片數(shù)值采用區(qū)間上限，涂片陽性率采用區(qū)間下限舉例步驟第四步確定抽取涂片的適宜的時間間隔如果按每年四次，則一季度一次。確定每次需抽檢的涂片數(shù)舉例74/4＝19.75即每個季度所需的涂片數(shù)為20步驟第五步根據(jù)實驗室記錄抽取標(biāo)本按時間間隔季度內(nèi)的涂片數(shù)，確定抽樣間距若保存的涂片丟失，則選用下一張保存的涂片（不論結(jié)果如何）舉例上一個季度保存的涂片數(shù)為384張。抽樣間距的計算：384/20＝19.2則每隔19張涂片抽取一個樣本第33頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作步驟第六步采用隨機方法，確定抽樣的第一張涂片抽樣人員隨機取出一張錢幣，以錢幣號碼的最后兩位數(shù)，作為抽取第一張涂片的序號。假定本例中第一張涂片序號為21舉例步驟第七步抽取涂片舉例以第21號涂片為第一張涂片，以后每間隔19張涂片抽取一張涂片，以下標(biāo)虛線紅圈的涂片，為第一張涂片，其它紅圈為按間隔抽取的涂片。第34頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作實驗室登記本第35頁共40頁《中國結(jié)核病防治規(guī)劃―痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》☆電子版LIBAIWA獨家制作第八步：抽取完涂片后，將涂片交于同級實驗室盲法復(fù)檢，上級實驗室對兩者間存在分歧的涂片進行復(fù)檢，然后再復(fù)檢10%涂片樣品；并根據(jù)誤差分類表