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絲狀真菌農桿菌遺傳轉化及染色技術商艷芳2015年7月23日農桿菌遺傳轉化第一部分農桿菌遺傳轉化原理農桿菌介導真菌遺傳轉化主要使用根癌農桿菌。根癌農桿菌細胞中含有Ti(Tumourinducing)質粒，其上有一段T-DNA(TransferringDNA)，農桿菌通過侵染受體真菌后，可將T-DNA插入到真菌基因組中，并且可以穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農桿菌介導真菌遺傳轉化的理論基礎。T-DNA的轉移和整合過程依賴于Ti質粒上一系列Vir基因（Virulencegenes）的激活表達協(xié)助完成。Vir基因的表達受到乙酰丁香酮（AS）等酚類物質的誘導。VirA識別AS發(fā)生自身磷酸化，然后將磷酸基團轉移給VirG使其活化，活化的VirG作為轉錄因子調控與T-DNA轉移相關的操縱子如VirB/C/D/E/F/H等的表達。另外，酸性pH更利于AS對Vir基因的誘導。農桿菌轉化載體系統(tǒng)分為一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，兩者區(qū)別在于T-DNA和Vir基因區(qū)是否在同一Ti質粒上。目前應用較多的是雙元載體，其構建方法較簡單，對外源基因的轉化效率也要高于一元載體。農桿菌遺傳轉化原理農桿菌介導真菌遺傳轉化步驟目的基因克隆與載體構建真菌轉化菌株確立目的載體轉入農桿菌真菌培養(yǎng)農桿菌誘導培養(yǎng)新鮮受體材料收集（真菌分生孢子等）農桿菌與真菌共培養(yǎng)目的基因在受體真菌中的整合和表達真菌轉化子篩選與驗證具體轉化步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）根癌農桿菌菌株AGL-1感受態(tài)的制備1.從YEB平板上挑取菌株AGL-1的單菌落到5mLYEB液體培養(yǎng)基中（含50μg/mLCarb），28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。2.取2mL上述菌液到50mLYEB（含50μg/mLCarb）中，28℃，220rpm搖床培養(yǎng)至菌液在600nm處的吸收值為0.5左右，約8h。3.將菌液倒入干凈的50mL聚丙烯管中，冰上冰浴30min后，4℃，8000rpm離心5min收集菌體。4.用10ml20mMCaCl2洗一次，4℃，8000rpm離心5min再次收集菌體。5.棄上清，用2mL20mMCaCl2懸浮菌體，加入無菌甘油至終濃度為15%～20%。每份100μL分裝，液氮速凍后于-80℃保存。質粒轉入根癌農桿菌AGL-11.將保存于-80℃的農桿菌感受態(tài)取出，置于冰上融化10min。2.加0.5～1μg目的質粒，移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min。3.液氮速凍5min，37℃溫育5min，立即冰浴2min。4.加入1mL液體YEB，28℃，150rpm培養(yǎng)3h。5.8000rpm離心2min，棄上清，收集菌體。6.用100μL液體YEB重懸菌體并均勻涂布在YEB平板上(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃靜置培養(yǎng)2天。7.挑取轉化子用5mL液體YEB(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。PCR驗證轉化子是否為陽性，最后將陽性菌液保存于-80℃（含15%的甘油）。真菌分生孢子孢懸液的制備1.從培養(yǎng)10天左右的PDA平板上刮取適量的真菌分生孢子到1mL無菌的含0.05%Tween-20水液中，渦旋2～3min。2.用玻璃絲棉過濾除去菌絲，濾液用1.5mLEpendorf管收集。3.12000rpm離心3min收集孢子。4.去上清，用1mL無菌生理鹽水（0.85%，w/v）重懸孢子，12000rpm離心3min再次收集孢子。重復本步驟一次。5.用適量的生理鹽水（或無菌水）重懸孢子，血球計數(shù)板計算孢子數(shù)目，將孢子懸液稀釋至106conidia/mL濃度，水懸液一般現(xiàn)配現(xiàn)用，生理鹽水懸液可于4℃保存，一周內使用。真菌轉化1.接種成功轉入目的基因載體的AGL-1農桿菌單菌落到4ml液體YEB中（含50g/mlCarb和50g/mlKan），28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。2.8000rpm離心3min收集菌體，去上清用適量的IM液體（200μMAS，40mM嗎啉乙磺酸）培養(yǎng)基重懸菌體，并將菌液濃度調到在OD600為0.15。3.28℃，220rpm培養(yǎng)6h左右，菌液OD600達到0.5～0.8。4.取農桿菌菌液及制備好的孢懸液各100μL，充分混和均勻后涂布于IM（200μMAS，40mMMES）平板（10mL），25℃靜置培養(yǎng)48h。5.取與共培養(yǎng)的IM平板等體積（10mL）的M-100培養(yǎng)基（1%Agar，600μg/ml噻孢霉素和400μg/ml草胺膦）覆蓋于IM平板上。6.25℃培養(yǎng)5～10天至抗性菌落出現(xiàn)。7.挑取抗性菌落并轉移到同樣的抗性培養(yǎng)基平板上，進行第二次篩選。8.從二篩平板上挑出抗性菌落（轉化子），抽提基因組并進行PCR驗證。影響農桿菌轉化效率的因素1.受體類型：新鮮萌發(fā)的分生孢子效果較其他組織好；2.農桿菌菌株：AGL1>LBA4404，LBA1100，EHA105等3.AS濃度：20-200M為宜；4.共培養(yǎng)時間和溫度：球孢白僵菌72h，羅伯茨綠僵菌48h等；農桿菌最適28℃，羅伯茨綠僵菌25℃等；5.農桿菌與受體菌株濃度；6.篩選標記的選擇（潮霉素、草胺磷、苯菌靈等）。農桿菌遺傳轉化的優(yōu)點1.受體材料范圍廣：除原生質體外還可以是孢子、菌絲體和子實體等；2.轉化效率高：研究表明農桿菌介導真菌轉化方法的轉化效率為傳統(tǒng)遺傳轉化方法的100~1000倍；3.轉化子能夠穩(wěn)定遺傳：選擇單核的分生孢子作為初始材料可以獲得后代不分離的轉化子，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定遺傳性；4.T-DNA多為單拷貝插入：對于缺少有性生殖階段的真菌，單拷貝插入有利于目的基因的分離和克?。?.農桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易于推廣。真菌染色技術NucleusstainingCellwallstainingLipiddropletsstainingMitochondriastaining第二部分NucleusstainingDAPI即4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡下細胞核觀察。染色原理DAPI可以穿透完整的細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合，從而發(fā)揮標記作用，其產生的熒光強度是自身的20多倍。DAPI是利用紫外光波長的光線激發(fā)。當DAPI與雙股DNA結合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和RNA結合，但產生的熒光強度不及與DNA結合的結果，其發(fā)散光的波長范圍約在400nm左右。DAPI的發(fā)散光為藍色，且DAPI和綠色熒光蛋白或紅色熒光染劑的發(fā)散波長僅有少部分重疊，因此可以在單一的樣品上進行多重熒光染色觀察。染色步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）1.收集生長14天的綠僵菌孢子或SDB液體培養(yǎng)4天的綠僵菌菌絲，并用PBS洗滌1-2次；2.用3.7％的甲醛（PBS配制）固定30min后，PBS洗滌2-3次；（此步驟亦可省去）3.將樣品轉移到棕色1.5mL離心管中，加入1mLPBS；

4.在暗室中加入細胞核染料DAPI（使用濃度為0.5-10μg/mL），置于脫色搖床上反應30min；5.12000rpm離心2min，棄上清，用PBS清洗樣品2-3次；6.熒光顯微鏡下觀察。染色圖片展示細胞核常用熒光染料有還有：吖啶橙（AcridineOrange，AO）、溴化乙錠（EthidiumBromide，EB）、Hoechst染料、碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）、EthDIII等。AO：具有膜通透性，能透過細胞膜，將核DNA和RNA分別染成綠色和紅色，因此使細胞核呈綠色或黃綠色熒光。EB：一種高度靈敏的熒光染色劑，在標準302nm處激發(fā)出橙紅色信號。Hoechst染料：最常見的兩種是Hoechst33342和Hoechst33258。這兩種染料都在紫外350nm處被激發(fā)，在461nm處最大發(fā)射光附近發(fā)射青/藍色熒光。與DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更強的親脂性，因此能更好的透過完整的細胞膜，并且細胞毒性更小。PI：不能穿過活細胞膜，但卻能穿過凋亡中晚期的細胞和死細胞的膜而對核染色。PI作為紅色熒光復染劑首選，PI經常與Calcein-AM或者FDA等熒光探針合用，區(qū)分死/活細胞。EthDIII：不能透過細胞膜，但能將壞死細胞區(qū)分開來，更適合凋亡壞死實驗的檢測；

Cellwallstaining真菌細胞壁主要由多糖和糖蛋白組成，多糖主要包括幾丁質，β-1,6-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖等組成。CalcofluorWhite(CFW)對幾丁質中β-1,4-糖苷鍵具有高度親和性，因而可以作為絲狀真菌細胞壁的標記染料。在一定的長波紫外光下,被CFW染色的真菌會發(fā)出很強的亮藍色熒光。染色步驟將待染樣品置于載玻片上，滴入一滴細胞壁染料Calcofluorwhite(4μg/mL)，并滴入一滴30%的KOH，靜止兩分鐘，即可在熒光顯微鏡下進行觀察。染色圖片展示另外，常用的真菌細胞壁染料還有ConA、GSII、GNL等。其中ConA（刀豆素A）主要標記葡萄糖苷和甘露糖苷，GSII（加納籽素）主要標記幾丁質，GNL（雪花蓮凝集素）主要標記甘露糖。脂滴是細胞內中性脂（neutrallipids）的主要貯存場所，廣泛存在于細菌、酵母、植物、昆蟲以及動物細胞中。脂滴的大小差別很大，直徑從40nm至100um不等。BODIPY是一類親脂性的染料，其中D-3922(4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene(BODIPY?493/503))可特異結合中性脂，從而可以標記脂滴發(fā)出綠色熒光。Lipiddropletsstaining1.收集真菌孢子或菌絲，并用PBS洗滌一次。2.用3.7％的甲醛（PBS配制）固定30min后，PBS洗滌2-3次。（此步驟亦可省去）3.將樣品轉入到棕色1.5ml離心管中，加入1mlPBS。4.在暗室中加入終濃度為10μg/ml的熒光染料BODIPY（1mg/mlinethanol母液），置于脫色搖床上染色30min-1hour。5.12000rpm離心2分鐘，棄去上清，加入500μlPBS懸浮樣品。同樣方法清洗2-3次。6.熒光顯微鏡觀察。染色步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）染色圖片展示另外，尼羅紅染色劑（9-diethylamino-5H-benzo[alpha]-phenoxazine-5-one，Nile

red）也是一種親脂性的惡嗪類熒光染料。與脂類物質包括臘酯（wax

ester）和三酰甘油（triacylglycerol）以及各種脂肪酸結合后，在激發(fā)波長543nm的激發(fā)下，顯示強烈桔紅色熒光（散發(fā)波長598nm），在紫外光的照射下顯示紅色。與尼羅紅相比，BODIPY染料更加特異地標記脂滴，且操作簡單，圖像更清晰。MitochondriastainingMitoTracker是專門標記活體細胞線粒體的一類熒光探針。此類熒光探針與傳統(tǒng)線粒體標記探針如tetramethylrosamine和rhodamine123相比