發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術

關于發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術第一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育一、工業(yè)微生物特點：個體小種類多繁殖快分布廣代謝能力強易變異改造帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置第二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日1、能在易得、價廉的原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高。2、可以在要求不高、易于控制的培養(yǎng)條件下迅速生長和發(fā)酵；3、生長速度快，發(fā)酵周期較短。發(fā)酵周期短的優(yōu)點在于感染雜菌的機會減少；提高設備的利用率。4、滿足代謝控制的要求：根據(jù)代謝控制要求，選擇單產(chǎn)高的營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株或野生突變株；5、抗噬菌體和雜菌能力強，不易被感染；6、菌種純粹，遺傳性狀穩(wěn)定（不易變異退化），以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。7、菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。二、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)對菌種的要求第三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日三、發(fā)酵工業(yè)用菌種的分離與篩選1、工業(yè)用菌種的來源：有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。經(jīng)過誘變的菌株；通過DNA重組的工程菌；原生質(zhì)體融合菌株。（一）微生物菌種分離第四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、菌株分離（separation）和篩選（screening）定義分離和篩選就是將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術區(qū)分開，并按照實際要求和菌株的特性采取迅速、準確、有效的方法對他們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。菌種純化是指在特定環(huán)境中只讓1種來自同一祖先的微生物群體生存的技術。菌株分離、篩選雖為兩個環(huán)節(jié)，但卻不能絕然分開，因為分離中的一些措施本身就具有篩選作用。工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進一步純化并進行代謝產(chǎn)物鑒別。第五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日3、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。第六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。4、新種分離與篩選的步驟第七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日菌種篩選主要步驟調(diào)查研究及查閱充分的資料設計實驗方案確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境采樣確定特定的增殖條件增殖培養(yǎng)確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的定性或半定量快速檢出法平板分離原種斜面確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎條件篩選初篩（1株1瓶）復篩（1株3～5瓶）結合初步工藝條件摸索再復篩（1株3～5瓶）3～5株單株純種分離生產(chǎn)性能試驗、毒性試驗菌種鑒定第八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）采樣A、采樣途徑向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。由自然界采集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選?？傮w來講土壤樣品的含菌量最多。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌，從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生菌等。第九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日從自然界篩選第十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日B、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。C、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。第十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）根據(jù)微生物生理特點采樣A、根據(jù)微生物營養(yǎng)類型（局部環(huán)境）每種微生物對碳\氮源的需求不一樣，分布也有差異。研究表明，微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長環(huán)境有著很大的相關性。如：纖維素酶產(chǎn)生菌：森林土；蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生菌：肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中；蛋白酶、糖化酶的菌株：在面粉加工廠、糕點廠、酒廠及淀粉加工廠等場所；第十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日以糖質(zhì)為原料的酵母菌：通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。果膠酶產(chǎn)生菌：柑橘、草莓及山芋等果蔬樣品的腐爛部分及果園土；篩選代謝合成某種化合物的微生物：從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品；利用碳氫化合物為碳源的菌株：在油田附近的土壤。第十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生物時，需根據(jù)該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣（極端環(huán)境）。如：高溫酶產(chǎn)生菌：溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品；低溫酶產(chǎn)生菌：寒冷的地方，如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣；耐壓菌：海洋底部采樣。耐高滲透壓酵母菌：通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。第十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）含微生物樣品的富集培養(yǎng)（優(yōu)化的過程）

----施加選擇性壓力分離法收集到的樣品，如含目標菌株較多，可直接進行分離。如果樣品含目標菌種很少，就要設法增加該菌的數(shù)量，進行增殖(富集)培養(yǎng)。富集培養(yǎng)就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其它菌型生長的條件，以促使目標菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。定義：利用不同種類的微生物其生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)要求的不同，如碳、氮源、pH、溫度、滲透壓、需氧等生理因素等，認為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長，而不利于其它種類微生物的生存，以達到使目的菌種占優(yōu)勢，而得以快速分離純化的目的。第十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日A、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分在分離該類菌株之前，可在增殖培養(yǎng)基中人為加入相應的底物作惟一碳源或氮源。如：篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時，以纖維素作為唯一碳源進行增殖培養(yǎng)；分離耐高滲酵母菌：首先要到含糖分高的花蜜、糖質(zhì)中去取樣。富集培養(yǎng)基為5%～6%的麥牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃溫度下進行培養(yǎng)，可以達到富集的目的。

第十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日B、控制培養(yǎng)條件通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達到有效的分離目的。如：細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。篩選極端微生物時，需針對其特殊的生理特性，設計適宜的培養(yǎng)條件，達到富集的目的。

第十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（4）微生物的純種分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。純種分離方法常選用單菌落分離法。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。第十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日A、稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋純種分離第十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法第二十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日a.連續(xù)劃線分離法b.分區(qū)劃線分離法B、平皿劃線分離法第二十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日5、篩選方法

利用特殊的分離培養(yǎng)基對大量混雜微生物進行初步分離；采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第二十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。（1）透明圈法用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株

羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物第二十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日淀粉酶產(chǎn)生菌的分離：分離淀粉酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。有機酸產(chǎn)生菌的分離在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時，由于乳酸是一種較強的有機酸，因此，在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。

第二十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如：果膠酶產(chǎn)生菌的分離篩選果膠酶產(chǎn)生菌時，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。（2）變色圈法第二十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日谷氨酸產(chǎn)生菌的分離在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.2～7.6，當pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。脂肪酶產(chǎn)生菌的分離為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，以吐溫為底物，尼羅藍（Nileblue）作為指示劑，根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測定。第二十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個混濁的生長圈。如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。（3）生長圈法第二十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日針對某些微生物的產(chǎn)物對產(chǎn)生菌的篩選沒有直接的選擇性指示作用，常采用隨機分離法進行分離常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選。抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。抗生素篩選（4）隨機分離方法------抑菌圈法第二十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日6、生產(chǎn)性能的測定由于純種分離后，得到的菌株數(shù)量非常大，如果對每一菌株都作全面或精確的性能測定，工作量十分巨大，而且是不必要的。一般采用兩步法，即初篩和復篩，經(jīng)過多次重復篩選，直到獲得1～3株較好的菌株，供發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗，進而作為育種的出發(fā)菌株。這種直接從自然界分離得到的菌株稱為野生型菌株，以區(qū)別于用人工育種方法得到的變異菌株（亦稱突變株）。第二十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日7、毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關的菌種，更應慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第三十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日典型的微生物新種分離篩選過程第三十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（二）微生物菌種的選育（育種）工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。選育目的：為生成提供各種類型的突變株大幅度提高菌種產(chǎn)生有價值代謝產(chǎn)物水平，還可以改進產(chǎn)品質(zhì)量，去除不需要的代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。第三十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日工業(yè)菌種育種的方法自然選育誘變選育抗噬菌體菌種的選育雜交育種原生質(zhì)體融合技術基因工程技術第三十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日1、自然選育定義：不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程。目的：純化菌種，防止菌種退化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量。缺點：效率低方法：將菌種制成菌懸液，用稀釋法在固體平板上分離單菌落，再分別測定單菌落的生產(chǎn)能力，從中選出高水平菌種。第三十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、誘變育種以微生物的自然變異作為基礎的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：利用各種產(chǎn)生誘發(fā)突變的物理因素和化學試劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。是目前國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變方法：物理、化學或生物誘變方法（1）誘變育種原理：利用誘變處理方法導致基因突變。第三十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。化學誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。（2）誘變劑和誘變處理第三十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機第三十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日誘變劑誘變劑的劑量處理時間緩沖劑中止反應方法亞硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸緩沖液pH8.6，0.07磷酸二氫鈉硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋亞硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液或Tris緩沖液大量稀釋亞硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸緩沖劑或Tris緩沖液大量稀釋氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀釋乙烯亞胺1:1000～1:1000030～60min

硫代硫酸鈉或大量稀釋羥胺（NH2OH?HCl）0.1～0.5％數(shù)小時或生長過程中誘變

大量稀釋氯化鋰（LiCl）0.3～0.5％加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變

大量稀釋秋水仙堿（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變

大量稀釋常用化學誘變劑誘變處理方法第三十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效?；瘜W誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射，設備費用大，并要注意安全性。大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：第三十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第四十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日A、出發(fā)菌株的選擇自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第四十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

B、處理菌懸液的制備這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi)，加無菌水第四十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日C、誘變處理誘變劑的選擇遺傳不穩(wěn)定的菌株，采用溫和的誘變劑，或采用已見效果的誘變劑；遺傳上較穩(wěn)定的菌株則采用強烈的、不常用的、誘變譜廣的誘變劑。不應常采用同一種誘變劑反復處理，以防止誘變效應飽和；但也不要頻頻變換誘變劑，以避免造成菌種的遺傳背景復雜，不利于高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定?？紤]誘變劑本身的特點。例如紫外線主要作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸則主要作用于DNA分子的嘌呤堿基。紫外線和亞硝酸復合使用，突變譜寬，誘變效果好。第四十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日②誘變條件的選擇僅僅采用誘變劑的理化指標控制誘變劑的用量常會造成偏差，不利于重復操作。例如：同樣功率的紫外線照射誘變效應還受到紫外燈質(zhì)量及其預熱時間、燈與被照射物的距離、照射時間、菌懸液的濃度、厚度及其均勻程度等諸多因素的影響。另外，不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。致死率表示誘變劑造成菌懸液中死亡菌體數(shù)占菌體總數(shù)的比率。第四十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日③誘變劑劑量的確定誘變處理劑量的選擇是一個比較復雜的問題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負突變則較多地出現(xiàn)于偏高劑量中。對于經(jīng)過多次誘變而提高了產(chǎn)量的菌株，在較高劑量負突變率更高。因此，目前處理量已從以前采用的死亡率90％～99％減低為死亡率70％～80％。第四十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日B.megateriumMPF-906的致死率曲線第四十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日④復合誘變誘變育種中還常常采取誘變劑復合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應。復合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可用同一誘變劑重復使用。因為每種誘變劑有各自的作用方式，引起的變異有局限性，復合處理則可擴大突變的位點范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大，因此，誘變劑復合處理的效果往往好于單獨處理。第四十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

D、中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。此過程稱為中間培養(yǎng)。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。第四十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日D、分離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異。

第四十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。搖床復篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑第五十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日實例1：紫外線的誘變育種紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。第五十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個/ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個/ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。第五十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。（2）將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。（3）取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。

操作步驟第五十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（4）取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。（5）取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。（6）取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。（7）挑取菌落進行篩選。第五十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日實例2：亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。第五十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.0的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。（2）MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。操作步驟第五十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計數(shù)。（4）死亡率計算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。（5）挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．第五十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日3、基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)粒或其他載體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉移給另—個細胞的方法。第五十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日一個完整的基因克隆過程包括以下步驟（1）獲得待克隆的DNA片段（基因）；（2）目的基因與載體在體外連接；（3）重組DNA分子導入宿主細胞；（4）篩選、鑒定陽性重組子；（5）重組子的擴增與／或表達。第五十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日第六十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日4、原生質(zhì)體育種定義：通過酶解作用將兩個親株的細胞壁去除，在高滲條件下釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體，將兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件下進行混合，加入融合促進劑聚乙二醇、仙臺病毒或電融合等助融，使他們相互凝集。通過細胞質(zhì)融合，促使兩套基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在適宜的條件下使細胞壁再生，在再生的細胞中獲得重組體。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體育種技術主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉化技術，原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合一般包括標記菌株的篩選、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、融合子的選擇、實用性菌株的篩選等。第六十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

（1）原生質(zhì)體融合育種的特點雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。有助于建立工業(yè)微生物轉化體系。第六十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）原生質(zhì)體融合育種步驟標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。原生質(zhì)體制備。等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。生產(chǎn)性能篩選。第六十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日原生質(zhì)體融合的基本過程第六十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）原生質(zhì)體融合育種的要點標記菌種的選擇獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。第六十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日原生質(zhì)體的制備：原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。放線菌和細菌制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。有時需結合其它一些措施，如在生長培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細胞壁對酶解的敏感性。

第六十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日對于不同微生物，原生質(zhì)體的高滲穩(wěn)定液組成也是不同的。如：細菌的穩(wěn)定液常用SMM液(用于芽孢桿菌原生質(zhì)體制備和融合，其主要成分是蔗糖0.5M，順丁烯二酸0.02M，MgCl20.02M)和DF液(用于棒狀桿菌原生質(zhì)體制備和融合，主要成分是蔗糖0.25M，琥珀酸0.25M，EDTA0.001M，K2HPO40.02M，KH2PO40.11M，MgCl20.01M)。在鏈霉菌中用得較多的是P液(主要成分蔗糖0.3M，MgCl20.01M，CaCl20.25M及少量磷酸鹽和無機離子)。真菌中廣為使用的是0.7MNaCl或0.6MMgSO4溶液，高滲穩(wěn)定液使原生質(zhì)體內(nèi)空泡增大，浮力增加，易與菌絲碎片分開。第六十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

影響原生質(zhì)體制備的因素菌體的前處理：為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。菌體的培養(yǎng)時間：為了使細胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。酶濃度：對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。第六十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日酶處理溫度破壁時的pH值滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。穩(wěn)定劑的使用濃度一般為0.3～0.8mol／L。第六十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日微生物細胞壁主要成分去壁方法革蘭氏陽性菌

芽孢桿菌

葡萄球菌

鏈霉菌小單胞菌肽聚糖溶菌酶處理溶葡萄球菌素處理溶菌酶處理(菌絲生長時補充0.5～5.0%甘氨酸或10～34%蔗糖)溶菌酶處理(菌絲生長時補充0.2～0.5%甘氨酸)革蘭氏陰性菌

大腸桿菌堿性普羅委登斯菌

黃色短桿菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和EDTA處理溶菌酶和EDTA處理溶菌酶處理(生長時補充0.41M蔗糖及0.3u/ml青霉素)霉菌纖維素和幾丁質(zhì)纖維素酶或真菌中分離的溶壁酶酵母菌葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶一些微生物的去壁方法第七十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（4）原生質(zhì)體的融合影響原生質(zhì)體融合的因素不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同，甚至一些非常接近的種，最適再生條件也往往有所差別；再生培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)溫度。最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。能再生細胞壁的原生質(zhì)體只占總量的一部分。細菌一般再生率為3-10%。有資料報道，在再生培養(yǎng)基中添加牛血清白蛋白，可使枯草桿菌原生質(zhì)體的再生率達100%。真菌再生率一般在20-80%。鏈霉菌再生率最高可達50%。菌體的前處理、菌體的培養(yǎng)時間；融合劑的濃度、融合劑作用的時間；陽離子的濃度、融合的溫度及體系的pH值等。

第七十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（5）原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁，恢復完整的細胞形態(tài)結構。影響原生質(zhì)體再生的因素有：菌種自身的再生性能、原生質(zhì)體制備的條件、再生培養(yǎng)基成分、再生培養(yǎng)條件等。

第七十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（6）檢查原生質(zhì)體形成和再生的指標原生質(zhì)體形成率和再生率：將用酶處理前的菌體經(jīng)無菌水系列稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，計出原菌數(shù)，設該數(shù)值為A。將用酶處理后得到原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個過程的處理。用無菌水適當稀釋，在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù)，由于原生質(zhì)體在低滲透壓條件下會破裂失活，所以生長出的菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)，設該值為B。用高滲透壓液適當稀釋，在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計數(shù)，生長出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生的菌數(shù)和未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)之和，設該數(shù)值為C。以原生質(zhì)體形成率和再生率為指標，可確定原生質(zhì)體制備最佳條件。第七十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（7）篩選優(yōu)良性狀融合重組子重組子的檢出方法有兩種：直接法和間接法。直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出重組子；間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。由于原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生兩種情況：一種是真正的融合，即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體，較穩(wěn)定遺傳；另一種是暫時的融合，形成異核體。不穩(wěn)定，會分離成親本類型，有的甚至可以異核狀態(tài)移接幾代。因此，要獲得真正融合子，必須在融合體再生后，進行幾代自然分離、選擇，才能確定。第七十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日5、新型微生物育種技術（1）離子注入法（2）激光誘變技術（3）微波育種技術（4）Genomeshuffling（基因組重排）技術第七十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）離子注入法離子注入法是利用離子注入設備產(chǎn)生高能離子束(40-60kev)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)的永久改變，然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株的方法。離子注入裝置—離子注入機：由離子源、質(zhì)量分析器、加速器、四極透鏡、掃描系統(tǒng)和靶室組成，可以根據(jù)實際需要省去次要部位。離子源是離子注入機的主要部件，作用是把需要注入的元素電離成離子，決定注入離子的種類和束流強度。第七十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日H+、N+、Ar+離子是常用的誘變劑，其中N+最常用。注入能量為20kev-30kev，注入劑量0(對照)-1016ion/cm2之間，脈沖式注入，每次連續(xù)注入的時間和間隔時間因處理的種類不同而各異，溫度應控制50℃以下，真空度為10-3Pa。這只是常用量，針對不同菌種要進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)。1996年，離子束誘變用于右旋糖酐產(chǎn)生菌，得到產(chǎn)量提高3615%的突變株。第七十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）激光誘變技術國內(nèi)外進行激光誘變的激光器有多種，波長從遠紅外11818μm、1016μm到可見光694.4nm、632.8nm、530nm、441.6nm至紫外線337.1nm、265nm。幾乎所有頻率的激光都有誘導的效果，照射劑量一般采用1-50J/cm2，處理時間可以縮短到秒，也可以延長至數(shù)小時不等。常用的激光器有CO2、He-Ne、N分子、銨玻璃、紅寶石Ar+和YAG等。其中以CO2和He-Ne激光器最為常用。第七十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日激光誘變機理：國內(nèi)外普遍認同的解釋是在激光輻照機體時產(chǎn)生光照活化效應，使核仁器抑制解除而被活化；使DNA、RNA和蛋白質(zhì)系統(tǒng)活性提高，核糖體上蛋白質(zhì)合成作用的活性增強，使機體內(nèi)的生物合成增強，特別是三羧酸酶和細胞色素氧化酶活性提高，從而提高細胞利用氧的能力并增強細胞合成ATP的能力。第七十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日大量的試驗資料表明，激光育種是一種行之有效的育種新技術。如：華僑大學彭益強與張文珍教授，利用激光誘變成功篩選出高產(chǎn)植酸酶黑曲霉菌株“ASP2L211”，比原始菌株的植酸酶活力提高了3.75倍。浙江省微生物所吳振倡采用銅蒸氣激光選育成“天蘭紅鏈霉菌”及其原生質(zhì)體再生菌，其發(fā)酵單位，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高12.9%-14.4%，已推廣應用。第八十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）微波育種技術微波輻射屬于一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz-300GHz，對生物體內(nèi)有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升，從而引起生理生化反應，非熱效應指在微波作用下，生物體會產(chǎn)生非溫度關聯(lián)的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。第八十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日微波輻射屬于一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz-300GHz，對生物體內(nèi)有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升，從而引起生理生化反應，非熱效應指在微波作用下，生物體會產(chǎn)生非溫度關聯(lián)的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。第八十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日4.Genomeshuffling技術Genomeshuffling(基因組改組，也有人稱為“基因組重排”)技術是微生物育種的新技術，也是各國爭相研究的新技術。Genomeshuffling只需在進行首輪改組之前，通過經(jīng)典誘變技術獲得初始突變株，然后將包含若干正突變的突變株作為第一輪原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株，此后經(jīng)過遞推式的多輪融合，最終使引起正性突變的不同基因重組到同一個細胞株中。第八十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日基因組改組技術的重組對象是整個基因組，可以同時在整個基因組的不同位點重組，將多個親本的優(yōu)良表型通過多輪的重組集中于同一株菌株，不必了解整個基因組的序列數(shù)據(jù)和代謝網(wǎng)的信息。與經(jīng)典的誘變方法相比，基因組改組技術可以快速、高效地篩選出優(yōu)良菌株，而且這些菌株集多種正突變于一體，因此在很大程度上彌補了經(jīng)典誘變方法的缺陷。第八十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)菌種保藏與復壯

菌種是一種極其重要和珍貴的生物資源，菌種保藏的意義在于保持保持優(yōu)良菌種的優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，提高菌種的存活率，減少菌種的變異，滿足生產(chǎn)的實際需要這對于成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。菌種保藏原理：根據(jù)菌種的生理生化特點，人為創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。第八十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日理想的菌種保藏方法應具備的條件經(jīng)長期保藏后菌種存活健在。保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第八十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日一、微生物菌種保藏在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、穩(wěn)定基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥第八十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應性，因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。

對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失。第八十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日二、國際重要菌種保藏機構第八十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日三、中國菌種保藏單位第九十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日四、工業(yè)微生物菌種保藏技術(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍干燥或真空干燥保藏(3)

轉接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第九十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日菌種保藏方法暫時保藏法

斜面?zhèn)鞔ù┐谭ㄩL期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法

第九十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日(一）低溫定期移植法將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏。特點：此法最為簡單和經(jīng)濟，且不要求任何特殊的設備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。原理：保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。第九十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日將菌種轉接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。（4℃菌種不能休眠，僅是抑制微生物的生命活動）

1、斜面保藏法第九十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、穿刺保藏法將含0.6-0.8%的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌，直立冷凝后，用接種針尖挑去少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當溫度下培養(yǎng)，待培養(yǎng)好后用膠塞封嚴，置4℃冰箱存放。缺點：易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌。貴重菌株及優(yōu)良菌株不易用此法。第九十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日原理：將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，使菌種與空氣隔絕，菌處于生長和代謝停止狀態(tài)，同時石蠟油還可防止水分蒸發(fā)，在低溫下達到較長期保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4℃-4℃，適用于不產(chǎn)孢子的菌種。方法：斜面菌種，純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油置三角瓶121℃滅菌1-2h，放入烘箱中（160℃）干熱處理，待石蠟油清澈透明后加入斜面，其用量以高出斜面頂端1CM為準。將試管直立，置低溫下保存。特點：此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細菌也可保藏1年左右。3、液體石蠟保藏法第九十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預防不測，一般保藏株2～3年也應做一次存活試驗。第九十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（二）冷凍保藏法

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結果，通常應在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應認真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍保藏種類普通冷凍保藏技術(-20℃)超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)液氮冷凍保藏技術第九十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日1、普通冷凍保藏技術(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。第九十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞；用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

第一百頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日3、液氮冷凍保藏技術

特點：目前廣泛應用的菌種長期保藏方法，適用于大多數(shù)微生物的保藏原理：微生物在-130℃以下溫度時，其新陳代謝作用停止，化學反應消失，液氮溫度-196℃，這種條件下可長期保藏菌種。冷凍保護劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。其次根據(jù)菌種不同還可選用葡萄糖、蔗糖、PVP、乳糖、脫脂乳粉作為抗凍劑。第一百零一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日待冷凍保藏菌種懸液的制備從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。

液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟第一百零二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30℃)；補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細胞在凍結點時盡可能快地發(fā)生相變；細胞凍結后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達-50℃；將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存?？厮倮鋬龅谝话倭闳?，共一百五十一頁，2022年，8月28日從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解凍；用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉接入瓊脂斜面上。復蘇第一百零四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（三）干燥保藏法（載體法）實驗原理：使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。第一百零五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日1、砂土管保藏法河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。砂土混合處理妥當?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。第一百零六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、濾紙保藏法將保藏的微生物細胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后保藏。方法：將3#濾紙剪成5mm*50mm的小紙條放入干燥飛培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或乳粉復原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準備好的濾紙條在滅菌操作條件下加入菌懸液中，充分吸附菌孢子，取出后放入滅菌小試管或安瓿瓶中，在真空干燥機上抽干，真空條件下火焰熔封、冷藏。第一百零七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日3、凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。第一百零八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）培養(yǎng)物的凍干過程第一百零九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標簽加棉塞預凍真空干燥測定水分熔封管口檢查真空度保藏第一百一十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）凍干菌種的保藏與再生保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。復蘇：在超凈工作臺中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿。在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。第一百一十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日4、基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)。建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第一百一十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日不同菌種保藏方法比較第一百一十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日5、微生物活力和穩(wěn)定性測定

所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實際保藏過程中出現(xiàn)的細胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標)應在保藏后加以檢測和確定。第一百一十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日加速保藏試驗可用于預測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括：在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)、細胞群體的形態(tài)學特征或一些特別的生化特征應在菌種保藏前后保持同一性，以及實驗室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品的穩(wěn)定性，后者極為重要。第一百一十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日五、

菌種的退化（衰退）與復壯

在生物進化的歷史長河中，遺傳性的變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性反而是相對的；退化性的變異是大量的，而進化性的變異卻是個別的。在自然情況下，個別的適應性變異通過自然選擇就可保存和發(fā)展，最后成為進化的方向；在人為條件下，人們也可以通過人工選擇法去有意識地篩選出個別的正變體用于生產(chǎn)實踐中。相反，如不自覺、認真地去進行人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會趁機泛濫，最后導致菌種的衰退（degeneration）。

第一百一十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日在長期接觸菌種的實際工作人員中，都有這樣的體會，即如果對菌種工作長期放任自流，不搞純化、復壯（rejuve-nation）和育種，則菌種就會對你進行“懲罰”，反映到生產(chǎn)上就會出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說明菌種的生產(chǎn)性狀也是不進則退的。第一百一十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日菌種退化：指在長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。1、

菌種的退化

第一百一十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（1）菌種衰退的表現(xiàn)對產(chǎn)量性狀來說，菌種的負變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時，也是衰退。最易覺察到的是菌落和細胞形態(tài)的改變。生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力的下降。抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱等。第一百一十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）菌種衰退的原因（A）基因突變:有關基因的負突變?？刂飘a(chǎn)量基因突變控制孢子生成突變優(yōu)良性狀的回復突變。（B）變異菌株性狀分離菌株優(yōu)良性狀不穩(wěn)定，在篩選或者傳代中逐步丟失和衰退。第一百二十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（C）連續(xù)傳代：（D）其它因素T、RH、培養(yǎng)基成分等培養(yǎng)條件引起的基因突變。第一百二十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（3）菌種衰退的實質(zhì)菌種的衰退是發(fā)生在細胞群體中的一個由量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在一個大群體中僅個別細胞發(fā)生負變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采取有效措施，而一味移種傳代，則群體中這種負變個體的比例逐步增大，最后讓它們占了優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的衰退。所以，在開始時所謂“純”的菌株，實際上其中已包含著一定程度的不純因素；同樣，到了后來，整個菌種雖已“衰退”了，但也是不純的，即其中還有少數(shù)尚未衰退的個體存在著。第一百二十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（4）防止菌種衰退的方法（A）控制傳代次數(shù):斜面移植一代：霉菌、芽孢桿菌、放線菌低溫保藏半年；酵母保藏3個月；無芽孢細菌1個月。（B）選擇合適的培養(yǎng)條件：一個適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退。如改變培養(yǎng)基成分、改變培養(yǎng)溫度等（C）利用不同類型的細胞進行傳代：對于霉菌和放線菌，利用孢子接種傳代，可防止衰退，利用菌絲接種傳代易出現(xiàn)衰退和不純的子代。（D）選擇合適的保藏方法：保藏方法的選擇和優(yōu)化第一百二十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、菌種的復壯（1）復壯的概念：使衰退的菌種重新恢復原來的優(yōu)良性狀。狹義的復壯僅是一種消極的措施，它指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產(chǎn)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的一種措施；而廣義的復壯則應是一項積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以，這實際上是一種利用自發(fā)突變（正變）不斷從生產(chǎn)中進行選種的工作。

第一百二十四頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日從衰退的菌種群體中把少數(shù)個體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。純種分離通過寄主體進行復壯（對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種到相應昆蟲或動物寄主體內(nèi)以提高菌株毒性。如經(jīng)過長期人工培養(yǎng)的殺螟桿菌，會發(fā)生毒力減退、殺蟲率降低等現(xiàn)象，這時可將退化的菌株去感染菜青蟲的幼蟲，然后再從病死的蟲體內(nèi)重新分離菌株。如此反復多次，就可提高菌株的殺蟲率）有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護工作中不斷篩選“正變”個體。（2）菌種復壯方法：第一百二十五頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日（2）菌種復壯方法

純種分離：通過純種分離，可把退化菌種的細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，經(jīng)過擴大培養(yǎng)，就可恢復原菌株的典型性狀。

第一百二十六頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日通過宿主體內(nèi)生長進行復壯。對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種至相應的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的致病性。淘汰已衰退的個體，如低溫抗性篩選。第一百二十七頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)微生物種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實例種子制備的技術概要第一百二十八頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。一、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求1、種子擴大培養(yǎng)的概念:第一百二十九頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日2、種子擴大培養(yǎng)的方法:

液體培養(yǎng)法：包括液體試管、三角瓶搖床振蕩或回旋式培養(yǎng)。搖瓶通氣量大小與搖瓶機型式、轉數(shù)、振程(或偏心距)、三角瓶容量、裝料量有關。表面培養(yǎng)法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)。固體培養(yǎng)法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。第一百三十頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日3、種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平第一百三十一頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日4、種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定，能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染第一百三十二頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日二、種子制備的技術概要1、種子制備的過程沙土管孢子冷凍干燥孢子斜面孢子培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)三級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐（1）種子制備的工藝流程第一百三十三頁，共一百五十一頁，2022年，8月28日第一百三十四頁，共一百五十一頁，2022年，8