五胚胎工程課件

第14章胚胎工程

2013.10

胚胎工程是指以動(dòng)物胚胎為研究對(duì)象而產(chǎn)生的一系列技術(shù)操作，它主要包括胚胎移植技術(shù)、胚胎冷凍保存技術(shù)、體外受精技術(shù)、胚胎分割技術(shù)和性別控制技術(shù)等。在畜牧業(yè)生產(chǎn)和臨床上具有廣泛的應(yīng)用，近30年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，胚胎工程技術(shù)也日新月異，在促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展及其相關(guān)領(lǐng)域研究中取得了令人矚目的成就。理論基礎(chǔ)：哺乳動(dòng)物的受精卵和早期胚胎的發(fā)育規(guī)律.

主要內(nèi)容胚胎發(fā)育的基本過程（※）胚胎移植的意義及原則（※）胚胎移植技術(shù)胚胎冷凍保存技術(shù)體外受精技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)

一、精卵發(fā)生哺乳動(dòng)物的生殖是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生命現(xiàn)象，在胚胎早期，生殖細(xì)胞首先與體細(xì)胞分離，形成的細(xì)胞為原生殖細(xì)胞(PGCs),其后，經(jīng)過性別決定和將要進(jìn)行的性別分化，形成兩種生殖細(xì)胞。生殖細(xì)胞經(jīng)過增殖期、生長期和成熟期,最終形成精子和卵子。1、精子的發(fā)生3）過程：1）場所:2）時(shí)期:睪丸的曲細(xì)精管初情期生殖機(jī)能衰退分三個(gè)階段第１階段—初級(jí)精母細(xì)胞的形成精原細(xì)胞大量精原細(xì)胞多個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞

數(shù)次有絲分裂第２階段：精子細(xì)胞的生成初級(jí)精母細(xì)胞次級(jí)精母細(xì)胞精子細(xì)胞MⅠMⅡ減數(shù)分裂第３階段：精子細(xì)胞變形成精子3）過程：精子細(xì)胞精子

1.細(xì)胞核2.高爾基體3.中心體4.線粒體5.細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)精子頭的主要部分頭部的頂體精子的尾線粒體鞘膜(尾的基部)

原生質(zhì)滴(球狀,最后脫落)精子細(xì)胞變形總結(jié)4)精子的結(jié)構(gòu)頭部：頂體、細(xì)胞核尾部：頸、中段、主段和末端。頂體內(nèi)部含有水解酶，能協(xié)助精子穿入卵周圍的卵膜。精子質(zhì)膜外表面存在有多種凝集素受體。鞭毛為9＋2微管結(jié)構(gòu)2.卵子的發(fā)生卵子的發(fā)生與精子不同。在哺乳類，所有卵原細(xì)胞成熟后和卵原細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)卵母細(xì)胞是在胎兒分娩前完成。卵母細(xì)胞形成階段是從胎兒誕生開始一直到性成熟排卵為止。直到青春期卵母細(xì)胞才進(jìn)行生長，以后每個(gè)性周期后有一批新的卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，而多數(shù)卵母細(xì)胞在每個(gè)周期發(fā)育中未成熟就退化。卵母細(xì)胞的成熟過程受MPF(成熟促進(jìn)因子）和CSF（細(xì)胞生長抑制因子）的相互調(diào)節(jié)。1)場所：卵巢2、過程卵原細(xì)胞發(fā)生時(shí)間：胎兒期，地點(diǎn)：卵巢多個(gè)卵原細(xì)胞初級(jí)卵母細(xì)胞ＭⅠ在雌性動(dòng)物排卵前后完成次級(jí)卵母細(xì)胞和第一極體ＭⅡ在受精過程中完成地點(diǎn)：輸卵管卵子和兩個(gè)極體有絲分裂

卵子的形成增殖期生長期成熟期

3）卵子的結(jié)構(gòu)卵細(xì)胞內(nèi)部物種空間結(jié)構(gòu)排列具有極性，卵內(nèi)組分沿著卵的主軸分布不均勻，形成動(dòng)物級(jí)和植物級(jí)。卵黃積聚在植物級(jí)。卵細(xì)胞分布在兩個(gè)固定的區(qū)域，質(zhì)膜下細(xì)胞質(zhì)稱為皮層，皮層是高度粘滯、半硬的凝膠狀，內(nèi)含有皮層顆粒和色素顆粒。大部分卵細(xì)胞質(zhì)——內(nèi)質(zhì)是液體狀態(tài)，內(nèi)含線粒體和生殖質(zhì)。卵細(xì)胞排出卵巢后，有卵膜包被。二、受精作用受精(fertilization)

精子與卵子的融合形成受精卵，這個(gè)過程就是受精。精子和卵子的質(zhì)膜融合，但精子細(xì)胞核還未與卵子的核發(fā)生融合，這時(shí)卵子被激活，繼續(xù)II減數(shù)分裂的后期，變成卵原核，之后精原核和卵原核發(fā)生融合產(chǎn)生合子。標(biāo)志:在卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個(gè)極體時(shí).場所:輸卵管

2、卵子的成熟與排放哺乳動(dòng)物的卵發(fā)育與卵母細(xì)胞的周圍卵泡細(xì)胞的有密切關(guān)系。卵母被卵泡細(xì)胞包被，成熟在卵泡腔。后卵泡破裂，卵細(xì)胞、透明帶等隨卵泡液一起排出經(jīng)腹膜腔到輸卵管。在排卵到輸卵管前，完成I減，產(chǎn)生卵母細(xì)胞和一個(gè)小的第一極體，隨后終止在II中期。卵泡細(xì)胞發(fā)育為黃體釋放孕酮促使胚胎發(fā)育，如果未完成受精，則促使黃體退化，如果完成受精則在下丘腦分泌的促性腺激素等的作用下使得子宮發(fā)生改變，有利于子宮著床。3、精子的行進(jìn)在正常生殖過程中，精子在陰道和子宮內(nèi)的運(yùn)動(dòng)速度很快，十幾分鐘即達(dá)到輸卵管，積聚在輸卵管峽部下2－3cm處，在此停留十幾到幾十個(gè)小時(shí)，然后繼續(xù)上行，只有少數(shù)精子可以達(dá)到卵管壺峽連接部，在此與剛排出的卵相遇，完成受精過程5、精卵融合過程A頂體反應(yīng)后，精子穿過透明帶進(jìn)入卵周隙B以赤道段與卵質(zhì)膜相融合C融合后卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒（CGs）胞吐，核開始去致密D精子頭部完全入卵，將一部分卵質(zhì)膜帶入。6、卵子的激活精子一旦與卵子接觸，卵子本身就開始發(fā)生一系列深刻的變化，即卵子的激活。卵子激活時(shí)，皮層顆粒首先于接觸點(diǎn)發(fā)生破裂，然后波及整個(gè)卵子的皮層，發(fā)生皮層反應(yīng)。皮層顆粒內(nèi)含物被排出，一部分與卵外的卵黃膜一起形成受精膜，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜間的卵周隙中，吸收水分，結(jié)果使受精膜逐漸與卵子分開而舉起。另外，皮層顆粒排放出的粘多糖形成一種粘性的透明膜物質(zhì)，與卵表面緊密相粘，作用是保持隨后的分裂球聚集在一起。7、透明帶的形成阻斷了其他精子的進(jìn)入第一個(gè)精子進(jìn)入到卵子后，刺激卵子在質(zhì)膜的下層顆粒釋放到質(zhì)膜外側(cè)，質(zhì)膜的外層包被與質(zhì)膜間產(chǎn)生透明帶。透明帶將阻止其他精子的進(jìn)一步進(jìn)入卵子。胚泡：哺乳動(dòng)物的胚胎處于16細(xì)胞期的桑椹期時(shí)，胚胎是球型細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞之間形成充滿液體的腔隙，然后它們聯(lián)合形成一個(gè)大腔位于胚胎的一端，即為胚泡結(jié)構(gòu)。囊胚：桑椹胚隨著卵裂出現(xiàn)充滿液體的囊胚腔，圍繞囊胚腔的細(xì)胞組成囊胚層原腸胚：囊胚繼續(xù)發(fā)育、分化，形成雙胚層或三胚層的原腸胚。外層為外胚層、遷到里面的稱為內(nèi)胚層和中胚層。早期胚胎發(fā)育早期胚胎發(fā)育卵裂：合子發(fā)生分裂形成無數(shù)小細(xì)胞。卵裂細(xì)胞不生長而連續(xù)分裂。主要是卵裂球的有絲分裂器與表層胞質(zhì)變化的過程。桑椹胚：卵裂數(shù)次后，出現(xiàn)實(shí)心細(xì)胞團(tuán)，形似桑椹得名哺乳動(dòng)物胚泡著床

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：在胚泡胚極一端，能夠發(fā)育成為胚胎主體的一團(tuán)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞：外層發(fā)育成為胎盤的細(xì)胞。著床：胚泡和子宮壁相互接觸并侵入子宮組織的過程。

第一節(jié)胚胎移植的意義及原則一、胚胎移植的意義二、胚胎移植發(fā)展簡史三、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)及原則一、胚胎移植的意義及原則（一）定義

胚胎移植(embryotransfer，ET)：是指對(duì)優(yōu)良雌性動(dòng)物進(jìn)行超數(shù)排卵處理，在其發(fā)情配種后一定時(shí)間內(nèi)，從其生殖道取出早期胚胎，移植到同期發(fā)情的普通雌性動(dòng)物生殖道的相應(yīng)部位，讓其生產(chǎn)后代的技術(shù)。

(二)胚胎移植的意義

1.提高優(yōu)良母畜繁殖力，加快優(yōu)良品種改良和動(dòng)物育種步伐

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞多達(dá)幾十萬個(gè)，但在正常情況下，大部分卵泡在發(fā)育中閉鎖，只有一部分能夠形成胚胎，最終發(fā)育成個(gè)體。采用超數(shù)排卵(superovulation)技術(shù)可以使將要閉鎖的卵泡內(nèi)的卵子得以利用,增加正常排卵數(shù)和胚胎數(shù),再把胚胎移植到代孕受體，獲得優(yōu)良個(gè)體，提高優(yōu)良動(dòng)物的繁殖力。

2.瀕危動(dòng)物的拯救與保護(hù)瀕危動(dòng)物的種群數(shù)量急劇下降，近親繁殖嚴(yán)重，繁殖力及生活力減退。采取超數(shù)排卵的方法，使有限的雌性動(dòng)物獲得較多的卵子，輔以體外受精，得到較多胚胎。再將這些胚胎移入同種或近緣種生殖體內(nèi)，以獲得存活動(dòng)物。以改善目前瀕危動(dòng)物的現(xiàn)狀。

3.使不孕母畜獲得生育能力對(duì)部分因器質(zhì)性或內(nèi)分泌缺陷而不能妊娠的母畜,可以根據(jù)情況專門作為供體或受體,繼續(xù)發(fā)揮其繁殖作用。

4.保存品種資源胚胎長期保存是保存動(dòng)物品種資源的理想方法。冷凍胚胎還可以和冷凍精液共同構(gòu)成動(dòng)物優(yōu)良性狀的基因庫。5.胚胎移植是胚胎工程操作的重要步驟胚胎移植是動(dòng)物胚胎工程操作的最終目的和必要的技術(shù)手段。胚胎工程技術(shù)，如卵母細(xì)胞及胚胎冷凍保存、體外受精、性別控制、胚胎分割、嵌合、細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等，目的均在于改良動(dòng)物品種，擴(kuò)大動(dòng)物種群，造福于人類，所有這些技術(shù)最終都必須通過胚胎移植手段，以獲得活的目的動(dòng)物。

二、胚胎移植發(fā)展簡史人們研究胚胎移植的歷史已有100多年。1、研究初始階段：

1890年，英國劍橋大學(xué)WalterHeape將4-細(xì)胞期的安哥拉兔胚胎，移植到一只已交配過的比利時(shí)野兔的輸卵管內(nèi)，這只受體兔共產(chǎn)出6只仔兔，其中2只是移植的安哥拉兔胚胎發(fā)育的仔兔。該實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了受精卵在受體母畜體內(nèi)發(fā)育的可能性。

20世紀(jì)30年代后，先后在山羊(Wariwick,1934年)、綿羊（Lopyrin,1950年)、豬(,Kvansnickii,1951年)、牛(Willett,1953年）、馬、小鼠、大鼠、人(體外受精胚胎)、貓和犬等多種動(dòng)物中獲得胚胎移植后代。2、發(fā)展階段：。

3、實(shí)用化階段：20世紀(jì)70年代，胚胎移植開始被應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

1971年，首家商業(yè)性胚胎移植公司(Alberta公司)成立。

1973年，牛凍胚移植成功。（英）

1974年國際胚胎移植協(xié)會(huì)(IETS)成立。80年代以后，一些國家的胚胎移植應(yīng)用研究發(fā)展極為迅速，如澳大利亞的安哥拉山羊胚胎移植、日本的奶牛和肉牛胚胎移植等。發(fā)展到目前，一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家已建立了完整的經(jīng)營性胚胎移植的企業(yè)和公司，并向國外出售胚胎。

我國的情況：

我國家畜胚胎移植研究始于20世紀(jì)70年代,先后獲得兔、綿羊、牛、山羊、馬和豬的胚胎移植成功。

80年代末期以來，胚胎移植生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，奶牛、肉牛及一些優(yōu)秀品種的山羊和綿羊的胚胎移植開始逐漸在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，并已在這些優(yōu)良品種的引種、快速擴(kuò)繁、品種改良工作中發(fā)揮了巨大的作用。三、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)及原則

（一）胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)

1.供體與受體的同步化供體(受孕)與受體(不受孕)在胚胎移植之前，生理生化狀態(tài)一致,處于相同時(shí)期，進(jìn)行胚胎移植較為適宜。

2.胚胎的游離狀態(tài)胚胎在發(fā)育早期有相當(dāng)一段時(shí)間(附植前)是游離于輸卵管和子宮腔內(nèi)，其發(fā)育靠本身卵胞質(zhì)和吸收子宮乳提供營養(yǎng)。所以在離體的培養(yǎng)液環(huán)境下可以存活，當(dāng)移植回與供體相同的環(huán)境中時(shí)又會(huì)繼續(xù)發(fā)育。

3.胚胎與受體的關(guān)系以及胚胎移植中的免疫問題胚胎必須和受體的子宮內(nèi)膜建立起生理上和組織上的聯(lián)系才能保證其以后的發(fā)育。一般認(rèn)為，在同一物種之間移植的胚胎沒有免疫排斥現(xiàn)象，所以當(dāng)胚胎由供體轉(zhuǎn)移到受體時(shí)可以存活下來。但在生產(chǎn)實(shí)際中，移植的胚胎有時(shí)不能存活，這除了其他因素之外，可能還涉及復(fù)雜的妊娠免疫問題，仍然值得進(jìn)一步研究闡明。(二)胚胎移植的原則

1.胚胎移植的同一性（1）供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性

二者屬于同一個(gè)物種；

不同種之間(在動(dòng)物進(jìn)化史上血緣關(guān)系較近，生理和解剖特點(diǎn)相似)。

（2）分類關(guān)系較遠(yuǎn)的不同種動(dòng)物間存在很大差異，它們之間的胚胎移植不能存活或只能存活很短時(shí)間。

差異點(diǎn)：胚胎組織結(jié)構(gòu)發(fā)育條件(營養(yǎng)、環(huán)境)

發(fā)育速度(附植的時(shí)間和妊娠期)

例如：

綿羊、山羊、牛的幼齡胚胎，移植到兔輸卵管內(nèi)，可以存活數(shù)日并能夠發(fā)育，但最終不能發(fā)育為個(gè)體。

2.供體和受體生理狀態(tài)及解剖部位的一致性

發(fā)情時(shí)間同期性；空間環(huán)境相似性。受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性才能保證受體和供體生理一致性，而且移植后的胚胎應(yīng)與其在供體所處的空間環(huán)境相似。發(fā)育著的胚胎對(duì)母體生殖道的環(huán)境變化非常敏感，而生殖道又在卵巢類固醇激素等多種因素作用下，處于時(shí)刻變化的動(dòng)態(tài)之中。一旦胚胎發(fā)育與生殖道環(huán)境的協(xié)調(diào)一致性發(fā)生脫節(jié)和錯(cuò)亂，即意味著相互關(guān)系的破壞，導(dǎo)致胚胎死亡。

3.胚胎發(fā)育的期限

(1)從生理學(xué)上講，胚胎采集和移植的期限（胚胎的日齡)不能超過母畜發(fā)情周期黃體的壽命，須在受體周期黃體退化之前數(shù)日進(jìn)行移植；

(2)不能在胚胎開始附植之時(shí)進(jìn)行,通常在供體發(fā)情配種后3-8d內(nèi)收集胚胎,受體也在相同時(shí)間接受胚胎移植。如果超過周期的黃體期進(jìn)行胚胎移植，由于受體的子宮內(nèi)環(huán)境發(fā)生未孕的退行性變化，胚胎不能存活。4.胚胎的質(zhì)量

在整個(gè)胚胎移植操作中，胚胎不應(yīng)受到任何不良因素(物理、化學(xué)、微生物)的影響而危及生命力。

移植的胚胎經(jīng)過鑒定必須是確認(rèn)發(fā)育正常者。

第二節(jié)胚胎移植技術(shù)

供體和受體的選擇供體的超數(shù)排卵處理受體的同期發(fā)情處理供體胚胎回收胚胎檢查及質(zhì)量鑒定胚胎移植一、供體和受體的選擇

1.供體的選擇（1）具有遺傳學(xué)價(jià)值；應(yīng)選擇生產(chǎn)性能優(yōu)良的無遺傳缺陷的品種或個(gè)體；（2）最好有一胎以上的正常繁殖史，既往繁殖力記錄較高的母畜，或已充分發(fā)育成熟的后備母畜；（3）健康狀況良好，無生殖器官疾病，發(fā)情周期正常。

2.受體的選擇

1)健康狀況良好、無生殖器官疾病、發(fā)情周期正常的適繁母畜；2)體型過小的母畜不宜作受體。二、供體的超數(shù)排卵

超數(shù)排卵（superovulation）：在動(dòng)物發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)期，用促性腺激素進(jìn)行處理，誘發(fā)其卵巢上大量卵泡同時(shí)發(fā)育并排出具有受精能力的卵子的技術(shù)稱為超數(shù)排卵，簡稱超排（superovulation）。（一）供體超排中常用的生殖激素

促性腺激素孕激素前列腺素1．促性腺激素（1）促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)

（2）促黃體素(luteinazinghormone,LH)（3）孕馬血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin,PMSG）（4）人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)（5）促排卵3號(hào)(luteinizinghormonereleasinghormoneA3，LRH-A3)：國內(nèi)人工合成的一種促性腺激素釋放素的類似物。（1）促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)

由動(dòng)物腺垂體嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白激素。主要生理作用：刺激有腔卵泡發(fā)育至成熟。進(jìn)口FSHDSCN0480國產(chǎn)FSHDSCN0494（2）促黃體素(luteinazinghormone,LH)

是腺垂體分泌的另外一種糖蛋白激素。LH與FSH協(xié)同促進(jìn)卵泡生長成熟、粒膜增生，并參與顆粒細(xì)胞合成分泌雌激素，觸發(fā)排卵和黃體形成，使粒膜細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體細(xì)胞。

LHDSCN0500LRHA3DSCN0493（3）孕馬血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin,PMSG）

是馬懷孕時(shí)子宮內(nèi)膜壁產(chǎn)生的一種糖蛋白激素。作用類似于FSH和LH。（4）人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)

是婦女妊娠早期的絨毛膜滋養(yǎng)層合胞體細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白激素，對(duì)母畜的生理作用與LH類似。（5）促排卵3號(hào)(luteinizinghormonereleasinghormoneA3，LRH-A3)

是人工合成的一種促性腺激素釋放激素(GnRH)的類似物，為10個(gè)氨基酸組成的肽類激素，可使血中FSH和LH水平升高，促進(jìn)LH排卵峰提前，有增加排卵數(shù)和改善胚胎質(zhì)量的作用。2．孕激素人工合成的孕酮(progesterone)或其類似物甲基炔諾酮（norgestrel)。

由黃體分泌抑制母畜發(fā)情抑制性中樞通過對(duì)丘腦下部或垂體前葉的負(fù)反饋?zhàn)饔茫种艶SH和LH的釋放；在黃體萎縮之前，卵巢中雖有卵泡生長，但孕酮存在使其不能迅速發(fā)育，從而抑制母畜發(fā)情；抑制性中樞，使母畜不表現(xiàn)發(fā)情；一旦黃體停止分泌孕酮，F(xiàn)SH就迅速釋放，從而引起卵泡發(fā)育和發(fā)情前期的到來，并隨之出現(xiàn)發(fā)情。3．前列腺素（prostaglandin，PG）為長鏈不飽和羥基脂肪酸。在胚胎移植中，與促性腺激素配合進(jìn)行供體的超排處理。前列腺素的作用是參與卵巢排卵過程，腦垂體促性腺激素的作用是使卵泡成熟、分泌雌激素及前列腺素，當(dāng)LH高峰出現(xiàn)時(shí)，局部會(huì)產(chǎn)生較多濃度前列腺素，促使卵巢間質(zhì)內(nèi)平滑肌纖維收縮，導(dǎo)致卵泡破裂，從而發(fā)生排卵。常用人工合成的PGF2α類似物：

a.15-甲基-前列腺素F2α(15-methyl-prostaglandinF2α)b.氯前列烯醇(cloprostenol,ICI-80996)，其活性相當(dāng)于天然PGF2α的100～200倍。PGDSCN0485PGDSCN0486（二）超數(shù)排卵的基本原理1.維持正常排卵數(shù)的內(nèi)分泌基礎(chǔ)--FSH和LH

卵巢中原始卵泡在胎兒時(shí)期或出生后短時(shí)間內(nèi)就已形成，以后不再增加。這些原始卵泡在一生中先后不斷地開始生長，大部分（99.9%）在發(fā)育至某一階段即退化閉鎖，僅有少數(shù)（0.1%）發(fā)育至成熟卵。若外源施加性激素，能改變卵泡閉鎖現(xiàn)象。2.卵泡生長發(fā)育不同階段的內(nèi)分泌基礎(chǔ)在卵泡開始生長到排卵的整個(gè)過程，依賴FSH、LH；FSH在卵泡腔形成中起重要作用，F(xiàn)SH含量與卵泡閉鎖率有關(guān)。3.卵母細(xì)胞成熟的內(nèi)分泌基礎(chǔ)卵母細(xì)胞的成熟過程受FSH、LH調(diào)節(jié)，如果在卵泡閉鎖開始之前，給予大量FSH，可挽救將要退化閉鎖的卵泡。適時(shí)給予排卵激素，F(xiàn)SH可使正常發(fā)育的卵泡進(jìn)一步發(fā)育并排卵，達(dá)到超數(shù)排卵的目的。（三）超排處理的一般程序

1．已知發(fā)情周期的母畜超排（1）在下一次發(fā)情開始前4～5d開始注射促性腺激素進(jìn)行超排。（2）在超排程序中使用前列腺素溶解黃體而使發(fā)情時(shí)間整齊一致。2．未知發(fā)情周期的母畜超排（1）放置孕激素陰道栓處理9～15d后，開始注射促性腺激素進(jìn)行超排，在孕激素撤除的同時(shí)配合使用前列腺素，孕激素撤除后即可引起發(fā)情和超數(shù)排卵。（2）注射前列腺素或其類似物后，開始注射促性腺激素進(jìn)行超排。

（四）超排舉例

——小鼠的超排小鼠體成熟一般在60～90日齡。因性成熟小鼠超排的排卵數(shù)多于成年鼠，故常用4～6周齡、體重22～25g的性成熟青年鼠進(jìn)行；小鼠性周期為4～5d。于實(shí)驗(yàn)開始的0d下午4:00，在雌鼠腹腔注射PMSG（孕馬血清促性腺激素）5～10IU；48～50h后，腹腔注射hCG（人絨毛膜促性腺激素）5～10IU；小鼠注射hCG后10～13h排卵，于注射hCG后將雌鼠（1～2只）與雄鼠合籠過夜；超排后第3d上午7:00，觀察配種雌鼠是否有陰道栓形成，有表明配種成功。

----母牛超排用前面所述的超數(shù)排卵技術(shù)，在母牛發(fā)情期（發(fā)情期當(dāng)天為零天）的第九天開始肌肉注射FSH（促卵泡激素），以遞減劑量連續(xù)注射4天，每天注射兩次（間隔12h），總劑量為300~400U；第三天的上下午，在注射FSH的同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇（PGF2α的類似物）各兩支（0.2mg/支）。三、受體的同期發(fā)情處理同期發(fā)情，包括自然同期發(fā)情和人工同期發(fā)情。（一）同期發(fā)情處理的必要性

1.供體和受體發(fā)情時(shí)間相同或相近，移植后的胚胎才能存活；2.自然生產(chǎn)中很難選擇到與供體發(fā)情時(shí)間相同、且能滿足生產(chǎn)需要的足夠數(shù)量的自然發(fā)情的受體，需對(duì)受體進(jìn)行同期發(fā)情處理。（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠受體的同期發(fā)情用小于超排劑量的PMSG誘導(dǎo)發(fā)情；注射hCG；將人工超排（或自然排卵）的小鼠與結(jié)扎輸精管的公鼠交配，造成假孕。子宮移植時(shí)，一般選用假孕2.5天的母鼠。（因?yàn)樾∈箅m為自發(fā)排卵動(dòng)物，但如無交配刺激，排卵后形成的黃體則會(huì)發(fā)育不良，而不適于做胚胎移植受體)。受體動(dòng)物假孕動(dòng)物---利用人為的激素刺激使母畜產(chǎn)生子宮的變化以利于受精卵或囊胚的著床，這種處理得到的受體動(dòng)物稱為假孕動(dòng)物.綿羊供體放置孕激素陰道栓綿羊供體超排注射山羊供體超排注射四、胚胎回收

（一）胚胎回收(embryocollection)：也稱采卵，是把胚胎從供體的生殖道中沖洗出來，提供移植或其它胚胎工程研究應(yīng)用。（二）胚胎操作液(沖卵液)

采用含血清2%～5%的改良杜氏磷酸鹽緩沖液(phoaphatebuffersolution,PBS)。鮮胚體外保存血清濃度：15%～20%。商品化沖卵液DSCN1454（三）胚胎回收階段配種后3～8d，胚胎發(fā)育至4～8細(xì)胞以上為宜。（四）胚胎回收的方法

手術(shù)回收：羊、豬或其它中小動(dòng)物，采用手術(shù)回收法。

非手術(shù)回收：牛等大家畜，采用非手術(shù)回收法。

1．牛的胚胎回收于牛發(fā)情后6～8d進(jìn)行，此時(shí)大部分胚胎處于桑椹胚和囊胚階段，并且大都在子宮角。具體操作步驟如下。（1）麻醉用2%利多卡因（5mL/頭）在薦椎和第一尾椎結(jié)合處或第一尾椎和第二尾椎結(jié)合處施行尾椎硬膜外麻醉。（2）消毒固定牛尾，清除糞便，用清水、酒精棉球沖洗消毒會(huì)陰部等，最后用生理鹽水棉球擦試干燥。（3）用沖卵管打開子宮角①用擴(kuò)宮棒擴(kuò)張子宮頸，插入宮頸粘液器抽出粘液；②把帶內(nèi)芯的沖卵管緩慢插入子宮；③當(dāng)沖卵管達(dá)到子宮角彎曲處時(shí)，拔出內(nèi)芯5cm左右，再把沖卵管向子宮角前端推進(jìn)；④當(dāng)內(nèi)芯再次到達(dá)子宮角彎曲處時(shí)，再向外拔出內(nèi)芯5～10cm，直到?jīng)_卵管到達(dá)子宮角前端為止。（4）通過氣囊導(dǎo)管打入一定量空氣，使氣囊膨脹以固定導(dǎo)管在子宮角內(nèi)的位置和防止沖洗液倒流。（5）抽出沖卵管內(nèi)芯。（6）連接沖胚和三通導(dǎo)管（圖14-2）。圖14-2三通路非手術(shù)胚胎回收(引自日本畜產(chǎn)技術(shù)協(xié)會(huì)編，牛的受精卵移植技術(shù)，平成7年)（7）回收受精卵用50mL注射器每次吸取30～40mL沖卵液，鉗住三通導(dǎo)管的輸出管，將沖卵液從輸入管注入子宮角，然后鉗住輸入管，使回收液從輸出管流到集卵杯（500mL容量），反復(fù)10余次。（8）鏡檢把集卵杯內(nèi)的回收液在溫室下，用集卵漏斗過濾，最后保留10mL左右液體，倒入Ф100mm培養(yǎng)皿中，進(jìn)行鏡檢。（9）消炎處理兩側(cè)子宮角沖卵完成后，將氣囊空氣放出，沖卵管抽至子宮體，灌注抗生素或預(yù)防子宮炎的藥物。2．羊手術(shù)法胚胎采集（1）麻醉肌注2%的靜松靈全身麻醉，局部注射5%鹽酸普魯卡因封閉麻醉。（2）手術(shù)部位可選擇的手術(shù)部位有3處，分別為乳房前的腹中線部或左右腹下股內(nèi)側(cè)與乳房之間。（3）常規(guī)消毒（4）用手術(shù)刀或手術(shù)剪切口，依次牽引出子宮角、輸卵管、卵巢。（5）沖卵

①輸卵管沖胚（回收進(jìn)入子宮前的胚胎）時(shí)間：在超排羊發(fā)情后66～72h從輸卵管采集2～8細(xì)胞胚胎。方法：用6#～8#沖卵針（具乳膠管）從宮管連接部的子宮端導(dǎo)入到輸卵管峽部，將回收針（具乳膠管）從輸卵管喇叭口插入2cm左右，回收管遠(yuǎn)端與Ф120mm表面皿相接，事先用10mL注射器抽取5～8mL沖卵液，與沖卵針連接，把沖卵液緩緩?fù)迫耄咛ゼ赐ㄟ^輸卵管回收到表面皿中。另一側(cè)輸卵管沖胚操作同前（圖14-3）。

圖14-3輸卵管手術(shù)回收胚胎回收針表面皿沖卵針注射器阻血鑷固定②子宮沖胚(回收進(jìn)入子宮角的胚胎)時(shí)間：在超排羊發(fā)情后5.5～7.0d，從子宮采集發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段的胚胎。方法：用8#～10#回收針在子宮角基部插入，用腸鉗固定，回收管遠(yuǎn)端與Ф180mm表面皿相接。在宮管連接部用6#～8#沖卵針插入子宮角，用20mL注射器把沖胚液注入子宮腔，胚胎即通過子宮角回收到表面皿中。另一側(cè)子宮角沖胚方法同前（圖14-4）。(5)向子宮內(nèi)注入氯霉素注射液，將子宮送回腹腔，整理傷口皮膚，縫合傷口。圖14-4子宮角手術(shù)回收胚胎回收針腸鉗注射器阻血鑷五、胚胎檢查及質(zhì)量鑒定鑒定程序：從沖卵液中將胚胎撿出、清洗質(zhì)量鑒定胚胎保存(一)撿胚與胚胎凈化技術(shù)1.撿胚將手術(shù)獲得的胚胎回收液收集到集卵杯中，迅速于15～80X實(shí)體顯微鏡下?lián)斐雠咛?，移入含有胚胎培養(yǎng)液的撿卵杯中。非手術(shù)回收的沖卵液量大，在室溫下靜置后，棄去上部液體，將下部回收液放入集卵杯中撿出胚胎。2.胚胎凈化（1）必要性回收的沖胚液中含有生殖道分泌物及脫落下來的上皮細(xì)胞、污染的微生物、子宮內(nèi)感染的病原等。（2）凈化處理沖洗：把撿出的胚胎移入含胚胎培養(yǎng)液的撿卵杯中沖洗2～3次；貯存：貯存在含新鮮胚胎培養(yǎng)液的撿卵杯中；保鮮：在移植前貯存時(shí)間如超過2h，應(yīng)每2h更換一次新鮮培養(yǎng)液。（二）胚胎質(zhì)量鑒定形態(tài)學(xué)法染色檢查體外培養(yǎng)法1．形態(tài)學(xué)鑒定

在50～160X的生物顯微鏡下觀察：①卵子是否受精：未受精卵的特點(diǎn)是透明帶內(nèi)分布有均勻的顆粒，無卵裂球（胚細(xì)胞）；②透明帶的規(guī)則性，即形狀、厚度、有無破損等；③胚胎的色調(diào)和透明度；④卵裂球的致密程度，細(xì)胞大小是否有差異以及變性情況；⑤卵周隙是否有游離細(xì)胞或細(xì)胞碎片；⑥胚胎本身的發(fā)育階段與胚胎日齡是否一致。圖14-5不同發(fā)育階段的正常牛胚胎2．染色檢查

(1)熒光染色檢查二乙酸熒光素（3,6-Diacetyl-Fluorescin,FDA）是一種熒光原物質(zhì)，游離狀態(tài)下為一種基礎(chǔ)熒光染料，酯化狀態(tài)下無色，酯化物在酶作用下水解后會(huì)出現(xiàn)熒光產(chǎn)物產(chǎn)生熒光。未受損害的細(xì)胞，酶活性強(qiáng)，細(xì)胞膜完整，進(jìn)入細(xì)胞的熒光素在酶作用下，酯化物水解顯示熒光，由于細(xì)胞膜完整，熒光物質(zhì)不會(huì)很快從細(xì)胞中游離出來，熒光顯微鏡下活力愈強(qiáng)的細(xì)胞顯示出淡綠色的熒光愈強(qiáng)。死亡或活力降低的細(xì)胞不發(fā)熒光或僅有微弱熒光。

染色方法:在有蓋的小撿卵杯中，加入PBS約2mL，并放入胚胎，加入1%FDA丙酮溶液1μL，在37℃下培養(yǎng)5～10min；將胚胎移入新鮮的PBS中洗滌一次。再在清潔的凹面玻璃片上滴2～3滴PBS，在熒光顯微鏡下觀察。(2)臺(tái)盼藍(lán)染色檢查

胚胎用0.5%的臺(tái)盼藍(lán)溶液染色3～5min，清潔后在顯微鏡下觀察。有活力的細(xì)胞不著色，死亡的細(xì)胞充滿著臺(tái)盼藍(lán)著色顆粒。3．體外培養(yǎng)法

方法是把被鑒定的胚胎在一定條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，如果進(jìn)一步發(fā)育，說明胚胎是活的，如果不發(fā)育則可認(rèn)為培養(yǎng)前的胚胎是死的。（三）胚胎的分級(jí)

形態(tài)學(xué)分級(jí)：A級(jí)(優(yōu)秀胚)B級(jí)(良好胚)C級(jí)(一般胚)D級(jí)(不良胚)A級(jí)（可用）：形態(tài)正常，卵裂球致密、整齊、清晰，發(fā)育階段與日齡一致，無游離的細(xì)胞和液泡或很少，變性細(xì)胞比例＜10%。B級(jí)（可用）：卵裂球稍顯不勻，致密、整齊，有游離細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞占10%～30%。C級(jí)：卵裂球不勻稱，變形，發(fā)育較慢，游離細(xì)胞或液泡較多，變性細(xì)胞達(dá)30%～50%。D級(jí)：卵裂球多數(shù)變形、異常，發(fā)育緩慢，變性細(xì)胞占胚胎大部分，約75%。

六、胚胎移植

手術(shù)法移植非手術(shù)法移植（一）牛的胚胎移植

1．手術(shù)移植

先將受體母牛做好術(shù)前準(zhǔn)備。在右腹部切口，找到有黃體側(cè)子宮角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宮角前端，注入胚胎，然后將子宮復(fù)位，縫合切口。2．非手術(shù)移植一般于在發(fā)情后第6～9d進(jìn)行，過早移植會(huì)影響受胎率。工具：胚胎移植槍

0.25mL細(xì)管方法：將細(xì)管截去適量，吸入少許保存液，吸一個(gè)氣泡，然后吸入含胚胎的少許保存液，再吸入一個(gè)氣泡，最后再吸取少許保存液（培養(yǎng)液-氣泡-含胚胎培養(yǎng)液-氣泡-培養(yǎng)液）將裝有胚胎的細(xì)管裝入移植槍內(nèi)，通過子宮頸插入子宮角深部，注入胚胎。圖14-6牛非手術(shù)胚胎移植裝置示意圖A.移植槍塑料外套鈍金屬頭(兩側(cè)帶孔)；B.移植槍塑料外套；C.移植槍套管；D.移植槍套芯；E.液段；F.含胚胎的液段；G.液段；H.胚胎細(xì)管；I，J.氣泡；K.胚胎細(xì)管棉塞。ABCDEFGIJHK牛胚胎移植用人工受精管，通過子宮頸進(jìn)入子宮體，然后注入胚胎

第三節(jié)胚胎冷凍保存技術(shù)一、胚胎保存的含義及歷史

1.胚胎保存指將胚胎在正常發(fā)育溫度下暫時(shí)儲(chǔ)存于體內(nèi)或體外而不使其失去活力；或者將其保存于低溫或超低溫情況下，使細(xì)胞處于新陳代謝和分裂速度減慢或停止的狀態(tài)，一旦恢復(fù)正常發(fā)育溫度時(shí)，又能繼續(xù)發(fā)育。2.胚胎冷凍保存的研究歷史始于20世紀(jì)50年代，當(dāng)時(shí)Smith用甘油作防凍劑，保存兔胚胎獲得成功。1971年Whittingham用慢速冷凍法獲得小鼠胚胎成功保存。1978年Willadsen建立了快速冷凍方法。1984年Takeda等采用一步冷凍法首次冷凍小鼠胚胎獲得成功。1985年RaU和Fahy用高濃度的DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分別組成玻璃化溶液，對(duì)8細(xì)胞期的小鼠胚胎進(jìn)行一步冷凍試驗(yàn)，獲得87.5％的凍后發(fā)育率。之后，牛、綿羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后應(yīng)用玻璃化冷凍法獲得成功。目前胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。3.胚胎冷凍技術(shù)的意義可用于建立胚胎庫、保存動(dòng)物品種資源，簡化胚胎移植過程，降低引種費(fèi)用并防止因引進(jìn)活畜而傳播疫病。二、胚胎冷凍保存的原理

胚胎細(xì)胞內(nèi)水分含量達(dá)80%以上，在冷凍過程中有90%的水分形成游離水，而游離水在低溫下易形成冰晶，破壞蛋白質(zhì)硫氫鍵，發(fā)生不可逆變化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護(hù)劑如甘油或蔗糖，改變細(xì)胞膜滲透性和溶液滲透壓，防止溶液效應(yīng)和滲透壓差異，讓細(xì)胞在保護(hù)劑中平衡并適當(dāng)脫水，將凍傷降到最低程度。減少降溫和復(fù)溫過程中冰晶的形成。胚胎在冷凍過程中，大約在-10℃以上時(shí)細(xì)胞內(nèi)不結(jié)冰，在-10℃以下時(shí)，胞質(zhì)形成冰晶。胚胎在冷凍過程和解凍過程中兩次通過易形成冰晶的危險(xiǎn)溫區(qū)(-15～-50℃)。采取適當(dāng)?shù)睦鋬龇椒ê偷蜏乇Ｗo(hù)劑(抗凍保護(hù)劑，cryoprotectiveagents），可使胚胎安全通過危險(xiǎn)溫區(qū)。三、胚胎冷凍方法

(一)抗凍保護(hù)劑①低分子量可滲透性保護(hù)劑：如甘油、乙二醇、二甲基亞砜等；②小分子不可滲物質(zhì)：如海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等；③大分子保護(hù)劑：如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylprolidone,PVP)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)等；④混合保護(hù)劑:如甘油、乙二醇、丙二醇和二甲基亞砜等。（二）常規(guī)冷凍解凍

——冷凍保存時(shí)緩慢降溫脫水，解凍時(shí)快速復(fù)溫到常溫

凍存：1．將胚胎依次放入含0.7mol／L甘油的PBS液和含1.4mol／L甘油的PBS液中，各平衡7～10min；2．將平衡后的胚胎裝入0.25mL細(xì)管中，細(xì)管兩端均為冷凍液，中間段為含胚胎的冷凍液，每段之間用氣泡隔開；3．將細(xì)管放入預(yù)先冷卻至-7℃的冷凍儀中，平衡10min后，用液氮中預(yù)冷過的醫(yī)用鑷子植冰；4．以0.3℃／min的速度，降溫至-35℃；將細(xì)管投入液氮。解凍：1.解凍從液氮中取出細(xì)管，在空氣中平衡10～20s，投入35℃水浴中，至冰晶融解；2．脫除冷凍保護(hù)劑從細(xì)管中推出冷凍液及胚胎，撿胚，移入含1.0mol/L蔗糖的PBS中10min，一步脫除冷凍保護(hù)劑，再用PBS洗滌胚胎2～3次，用于移植。（三）一步冷凍法利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水，從而減少冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。其特點(diǎn)是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序，能在很短的時(shí)間內(nèi)完成冷凍過程，實(shí)用價(jià)值高。操作程序：1．將胚胎移入含1.4mol／L甘油的PBS中平衡20min；2．再移入含2.1mol／L甘油和0.25mol／L蔗糖的PBS中平衡7min，裝管；4．將細(xì)管在液氮罐內(nèi)頸部處(溫度為-23～-25℃)預(yù)冷5min后投入液氮中保存。5．解凍時(shí)從液氮中取出細(xì)管，在空氣中平衡10s，置于37℃水浴解凍；6．脫除冷凍保護(hù)劑

操作如常規(guī)冷凍法

也可采取在裝管時(shí)，將含1.0mol／L蔗糖的PBS裝入細(xì)管兩端，這樣便可省去脫除保護(hù)劑的程序，解凍后的細(xì)管直接用于移植。（四）玻璃化法玻璃化法(vitrification)是近年來發(fā)展起來的一種新方法。玻璃化溶液的組成是25％甘油、25％1,2-丙二醇或25％乙二醇。高濃度的滲透保護(hù)劑組成的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態(tài)物質(zhì)，低溫時(shí)它不結(jié)晶就可固化。胚胎在這種溶液中脫水一定程度，可引起內(nèi)源性大分子和已滲入的保護(hù)劑濃縮，從而使細(xì)胞在急劇降溫過程中得以保護(hù)。玻璃化法程序：

1．于室溫下將胚胎移入含10％甘油的PBS中平衡10min；2．將胚胎轉(zhuǎn)移到含10％甘油和20％乙二醇的PBS中；3．將胚胎移入含25％甘油和25％乙二醇的PBS中，立即裝管；4．把細(xì)管在液氮罐內(nèi)頸部處預(yù)冷5min后投入液氮保存或直接投入液氮；5．解凍時(shí)從液氮中取出細(xì)管，在空氣中平衡7s，迅速投入20℃溫水中，搖動(dòng)細(xì)管使其解凍均勻；6．收集胚胎，將撿出的胚胎移入含1.0mol／L蔗糖的PBS中平衡10min，一步脫除保護(hù)劑；再用PBS洗滌胚胎2～3次后用于移植。玻璃化法優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速，防止了冰晶對(duì)胚胎造成的損傷。缺點(diǎn)：由于玻璃化溶液的濃度極高且溶質(zhì)存在毒性，會(huì)使胚胎的成活率降低。解決辦法：①通過兩步平衡胚胎；②縮短平衡時(shí)間；③降低平衡溫度；④使用蔗糖、海藻糖等抗毒性物質(zhì)。四、冷凍效果的鑒定冷凍胚胎解凍后，要對(duì)其活力進(jìn)行鑒定，才能確定是否適于移植，并對(duì)其冷凍和解凍方法做出評(píng)價(jià)。(一)形態(tài)學(xué)鑒定

胚胎解凍后在實(shí)體顯微鏡下觀察，能恢復(fù)到凍前的形態(tài)，透明度適中，胚內(nèi)細(xì)胞致密，細(xì)胞間界限清晰，可認(rèn)為是存活的胚胎，適于移植。如果透明帶有輕度破損，但胚胎細(xì)胞基本保持完整，或胚內(nèi)大部分細(xì)胞形態(tài)正常，可觀察出細(xì)胞間的界限，僅有極少數(shù)細(xì)胞崩解成小顆粒，這類胚胎仍可移植，其中一部分仍可能發(fā)育為正常胎兒。若透明帶破裂、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)松散、胚內(nèi)細(xì)胞變暗或變亮呈玻璃狀，以及進(jìn)入解凍液后不能擴(kuò)張恢復(fù)到凍前大小或整個(gè)胚胎崩解，均是由于胚胎在冷凍或解凍過程中受到嚴(yán)重?fù)p害而失去活力。在100～200倍的相差顯微鏡進(jìn)行暗視野檢查，存活的胚胎呈球形，透明度高，細(xì)胞膜光滑，胞質(zhì)內(nèi)有很少的反光微粒，有時(shí)可見較暗的細(xì)胞核。熒光檢查細(xì)胞均發(fā)強(qiáng)熒光。活力降低的胚胎，胚胎內(nèi)變得渾濁，透明度降低，胞質(zhì)內(nèi)反光顆粒增大增多，熒光微弱。死亡的胚胎中細(xì)胞無定形，變成一堆反光性很強(qiáng)的大顆粒。這種顆?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)變性凝結(jié)成不可溶的物質(zhì)而形成的，因而使反光性增強(qiáng)而透明度變差。（二）染色檢查可采用熒光染色檢查和臺(tái)盼藍(lán)染色檢查進(jìn)行解凍后胚胎的質(zhì)量鑒定。（三）培養(yǎng)鑒定

1.體外培養(yǎng)冷凍胚胎解凍后，在37℃條件下培養(yǎng)6～12h，能繼續(xù)發(fā)育者為存活胚胎。2.異體培養(yǎng)將解凍后的胚胎置于結(jié)扎的兔輸卵管內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)12～24h。再從輸卵管內(nèi)沖出來，檢查發(fā)育情況，存活的胚胎能進(jìn)一步發(fā)育。（四）移植檢驗(yàn)

將解凍后的胚胎移植給受體動(dòng)物，根據(jù)受體的妊娠率和產(chǎn)仔率計(jì)算胚胎的存活率是最直接可靠的檢驗(yàn)方法。輕度受損的胚胎用間接檢查法檢查時(shí)，可能表現(xiàn)為存活的胚胎，但發(fā)育潛力可能已受到損害，這種胚胎移植后也可能妊娠，但當(dāng)胚胎發(fā)育到某一階段時(shí)就可能死亡，造成妊娠中斷。五、存在問題

冷凍胚胎法雖然在大多數(shù)家畜已獲得成功，但目前應(yīng)用較廣泛的是牛。凍胚移植的妊娠率比鮮胚低，影響因素包括冷凍保護(hù)液的種類、冷凍和解凍方法、胚胎發(fā)育階段以及操作者的技術(shù)熟練程度等。生產(chǎn)中主要采用形態(tài)學(xué)方法鑒定凍胚質(zhì)量，對(duì)其移植后的發(fā)育能力無法判斷。冷凍解凍程序復(fù)雜，保護(hù)液和冷凍程序未規(guī)范化，使用的冷凍防護(hù)劑對(duì)胚胎尚有一定毒性。從理論上講，冷凍胚胎可長期保存，但對(duì)于保存過程中是否發(fā)生老化的問題還缺乏直接的實(shí)踐證據(jù)。期待隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展和冷凍技術(shù)研究的深入，胚胎冷凍技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)和其他生物技術(shù)研究中發(fā)揮更好的作用。

復(fù)習(xí)題1.名詞解釋：胚胎移植，超數(shù)排卵，同期發(fā)情，胚胎冷凍。2.超數(shù)排卵常用的激素有哪些？3.胚胎移植的原則是什么？4.簡述胚胎移植的方法、程序及操作過程。5.簡述胚胎的質(zhì)量鑒定及分級(jí)方法。6.常用的胚胎采集方法有哪些？7.常用的胚胎冷凍方法有哪些，之間有什么區(qū)別？8.冷凍胚胎的質(zhì)量如何判定？試管嬰兒制作流程

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四、體外受精

體外受精