實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)材料 -大腸菌群的測(cè)定課件

授課教師：汪清美3.食品中大腸菌群的測(cè)定（一）大腸菌群的定義及范圍

1.定義

指一群在37℃，24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

2.檢測(cè)范圍大腸菌群主要要是由腸桿菌科構(gòu)成埃希氏菌屬枸櫞酸桿菌屬克雷伯氏菌屬腸桿菌屬其生化特性分類見表++陽性，－陰性，+/－多數(shù)陽性，少數(shù)陰性

大腸埃希氏菌I型和ш型的特點(diǎn)：對(duì)靛基質(zhì)、甲基紅、v—P、枸櫞酸鹽利用四個(gè)項(xiàng)目的生化反應(yīng)結(jié)果均為“++－－”，通常稱為典型大腸桿菌。其它類大腸桿菌則被稱為非典型大腸桿菌。（二）大腸菌群作為糞便污染指標(biāo)菌的意義義

糞便污染食品，往往是腸道傳染病發(fā)生的主要原因，因此檢查食品中有無腸道菌，這對(duì)控制腸道傳染病的發(fā)生和流行，具有十分重要的意義。大腸菌群的檢出不僅反映檢樣受糞便污染的程度，也反映了食品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。義。（三）食品中大腸菌群的測(cè)定一、檢驗(yàn)前準(zhǔn)備(一)設(shè)備和材料溫箱、水浴、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、吸管、載玻片。(二)培養(yǎng)基及試劑

乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖發(fā)酵管、革蘭氏染液

檢樣

｜遞增稀釋｜乳糖膽鹽發(fā)酵管

｜｜37℃24h｜不產(chǎn)氣產(chǎn)氣｜｜大腸菌群陰性伊紅美蘭、遠(yuǎn)騰、MA瓊脂等｜｜報(bào)告｜37℃24h｜

革蘭氏染色

乳糖發(fā)酵管

｜

｜｜｜｜37℃24h｜

革蘭氏陽性

革蘭氏陰性

不產(chǎn)氣｜無芽孢桿菌

產(chǎn)氣｜

大腸菌群陰性

｜｜大腸菌群陰性｜｜大腸菌群陽性報(bào)告｜報(bào)告

②用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液lmL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，作成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上頂操作依次作10倍遞增稀釋液。每遞增一次換一只1ml滅菌吸管。(2)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

即通常所說的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在lmL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖鹽發(fā)酵管。每稀釋度接種3管，置36±1℃培養(yǎng)2h，如果所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如果有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。（4）證實(shí)實(shí)驗(yàn)

目的在于證明從乳糖初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)呈陽性的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。從上述選擇性瓊脂平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1－2個(gè)作革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸菌群陽性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽性，即報(bào)告為大腸菌群陰性。（5）報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100ml（g或cm2）食品中大腸菌群的最可能數(shù)。3．注意事項(xiàng)(1)檢驗(yàn)步序

大腸菌群的檢驗(yàn)步序采用三步法：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。第一步：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn)，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過平板分離和證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。

只做一步初發(fā)酵，對(duì)某些食品來說，誤差是比較大的。這樣做，會(huì)有相當(dāng)部分的合格樣品被作為不合格樣品處理，應(yīng)予注意。

(2)抑菌劑

大腸菌群檢驗(yàn)中經(jīng)常使用的抑菌劑有膽鹽、洗衣粉、十二烷基硫酸鈉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑可抑制雜菌，有利大腸菌群的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群的某些菌株也有一些抑制作用。

目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量(0.5％)是適宜的，在稱量時(shí)稍有差誤，亦不致影響大腸菌群的檢出。如果選用伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤，檢出率最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面(如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤(rùn)與干燥等)雖亦應(yīng)注意，但不如色澤方面更為重要。

另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系。在實(shí)際工作中，由于工作量較大，通常只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問題，很難避免假陰性的出現(xiàn)，尤其當(dāng)菌落呈不典型時(shí)。所以挑菌落一定要挑取