基因工程菌的發(fā)酵課件

第十四章基因工程菌的發(fā)酵第一節(jié)工程菌的來源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。二、工程菌的獲得確定目的產(chǎn)物。找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞。將細(xì)胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的合成信息。利用基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR），找出所需的目的基因。將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。將重組后DNA分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖。根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。三、工程菌應(yīng)具備的條件發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時(shí)是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。代謝控制容易進(jìn)行。能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。四、工程菌的應(yīng)用1，基因藥物紅細(xì)胞生成素胰島素干優(yōu)素乙肝疫苗生長激素粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子2，其它發(fā)酵產(chǎn)品酶制劑氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）抗生素一、安全問題關(guān)于基因工程的社會(huì)問題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20L以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分B1和B2級(jí)，B2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。三、工程菌的培養(yǎng)工程菌的營養(yǎng)控制質(zhì)粒穩(wěn)定性重組質(zhì)?？截悢?shù)的控制及表達(dá)效率1，底物濃度的控制在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循PI級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定，因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。2，質(zhì)粒穩(wěn)定性（1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型分離性不穩(wěn)定：這是由于在細(xì)胞分裂過程中質(zhì)粒缺失分配到子細(xì)胞中而導(dǎo)致整個(gè)質(zhì)粒丟失。結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化。（2）影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對(duì)其穩(wěn)定性的影響宿主對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)?？截悢?shù)重組質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響（3）使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施組建合適載體選擇適當(dāng)宿主施加選擇壓力抗生素添加法抗生素依賴變異法營養(yǎng)缺陷型法控制基因過量表達(dá)控制培養(yǎng)條件假定在分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期每次分裂時(shí)，其質(zhì)粒丟失率為P，則Fn為3，表達(dá)效率及質(zhì)?？截悢?shù)控制在工程菌培養(yǎng)過程中，表達(dá)效率與質(zhì)?？截悢?shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒拷貝數(shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時(shí)拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)粒拷貝數(shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。所以對(duì)于底物對(duì)于產(chǎn)物第四節(jié)培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時(shí)，當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)?，F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長良好。二、工程菌外漏的防范首先應(yīng)了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來有：排氣，機(jī)械密封，接種，取樣，培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)，排液(輸至下一工序)。1，排氣2，機(jī)械密封考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因工程菌時(shí)，以用上部攪拌的雙機(jī)械密封為好。4，培養(yǎng)后的滅菌培養(yǎng)后對(duì)培養(yǎng)液和管道等進(jìn)行滅菌時(shí)，一開始流出的末滅菌排水有可能存在活的重組菌。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便排放污水。5，接種向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。簡(jiǎn)單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無菌空氣加壓壓入的方法。另一種方法是先把種子液在安全柜內(nèi)移至供接種用的小罐內(nèi)，再將其與培養(yǎng)罐連接，用蒸汽對(duì)連接部分滅菌后，把種子罐中的種子液接入培養(yǎng)罐內(nèi)。6，排液培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時(shí)也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴(kuò)散。安全的方法是在培養(yǎng)開始前就將排液口與下段工序相連接并進(jìn)行滅菌，這樣培養(yǎng)一結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。三、培養(yǎng)罐的管道布局下圖表示重組菌培養(yǎng)罐(P2、P3級(jí))的整體流程圖。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制

傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面：傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高，提取方法較簡(jiǎn)單)，其理化性能，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)?；蚬こ坍a(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了很多困難。另外，對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全(biosafety)問題