分子熒光光譜法

關于分子熒光光譜法第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日分子熒光光譜法又稱分子發(fā)光光譜法或熒光分光光度法，即通常所謂的熒光分析法。該法是一種利用某一波長的光線照射試樣，使試樣吸收這一輻射，然后再發(fā)射出波長相同或波長較長的光線的化學分析方法。

定性定量第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日

分子吸收了紫外-可見光的輻射后，它的電子能級躍遷至激發(fā)態(tài)，然后以熱能形式將這一部分能量釋放出來，本身又回復到基態(tài)。如果吸收輻射能后處于電子激發(fā)態(tài)的分子以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，再發(fā)射的波長可以同分子所吸收的波長相同，也可以不同。熒光（Fluorescence）：當激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程幾乎立即停止（10-9——10-6秒）磷光（Phosphorescence）：將持續(xù)一段時間（10-3——10秒）一、光致發(fā)光（Photoluminescent）第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、熒光、磷光產(chǎn)生原理

1、分子的激發(fā)態(tài)——單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)

大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，在基態(tài)時，這些電子成對地存在于能量最低的各個原子或分子軌道中，根據(jù)Pauli不相容原理，一個給定軌道中的兩個電子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子數(shù)分別為1/2、-1/2，電子總自旋量子數(shù)等于零：S=?+(-?)=0，即基態(tài)沒有凈自旋，其電子能態(tài)的多重性

M=2S+1=1(M為磁量子數(shù))，因此，基態(tài)的多重性為1，分子是抗（反）磁性的，其能級不受外界磁場影響而分裂，稱“單重態(tài)”；單重態(tài)：第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日單重激發(fā)態(tài)：當基態(tài)分子的一個成對電子吸收光輻射后，被激發(fā)躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不改變，即兩個電子的自旋方向仍相反，總自旋量子數(shù)S=0，

M=2S+1=1，則分子處于的激發(fā)態(tài)仍是單重態(tài)，即“單重激發(fā)態(tài)”；第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日

如果電子在躍遷過程中，還伴隨著自旋方向的改變，這時便具有兩個自旋不配對的電子，即兩個電子的自旋量子數(shù)都為1/2，電子總自旋量子數(shù)不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1，其多重性：M=2S+1=3，即分子在磁場中受到影響而產(chǎn)生能級分裂，這種受激態(tài)稱為“三重激發(fā)態(tài)”；三重激發(fā)態(tài)：第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日2、分子去活化過程及熒光的發(fā)生

一個分子的外層電子能級包括S0（基態(tài)）和第1至第n的電子激發(fā)的單重激發(fā)態(tài)S1，S2，…..Sn

，第1至第n的電子激發(fā)的三重激發(fā)態(tài)T1…..Tn

，每個電子能級又包括一系列能量非常接近的振動能級。分子吸收了紫外-可見光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單重態(tài)的不同振動能級上，根據(jù)自旋禁律，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)的各個振動能級上。

處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，在較短的時間內(nèi)可通過不同途徑釋放多余的能量（輻射或非輻射躍遷）回到基態(tài)，這個過程稱為“去活化過程”。第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日1.振動弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一部分能量以熱的形式迅速傳遞給溶劑分子（環(huán)境）回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級。2.內(nèi)轉(zhuǎn)換：當激發(fā)態(tài)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上，這一無輻射過程稱為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。

3.系間跨躍：當電子單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級與電子三重激發(fā)態(tài)的較高振動能級相重疊時，發(fā)生電子自旋狀態(tài)改變的S—T躍遷，這一過程稱為“系間跨躍”。4.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用而以非輻射形式轉(zhuǎn)移掉能量回到基態(tài)的過程。5.熒光發(fā)射：當激發(fā)態(tài)的分子通過振動馳豫——內(nèi)轉(zhuǎn)換——振動馳豫到達單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時，單重激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子可通過發(fā)射輻射（光子）躍回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為

“熒光發(fā)射”。6.磷光發(fā)射：三重激發(fā)態(tài)最低振動能級的分子以發(fā)射輻射（光子）的形式回到基態(tài)的不同振動能級，此過程稱為“磷光發(fā)射”。第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日由于三重態(tài)壽命較長，因而發(fā)生振動弛豫及外轉(zhuǎn)換的幾率也高，失去激發(fā)能的可能性大，以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現(xiàn)象。因此，試樣采用液氮冷凍降低其它去活化才能觀察到某些分子的磷光。處于激發(fā)態(tài)的分子，可以通過上述不同途徑回到基態(tài)，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優(yōu)先發(fā)生。如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比較快，則熒光發(fā)生幾率高，強度大。如果發(fā)射熒光使受激分子去活化過程與其他過程相比較慢，則熒光很弱或不發(fā)生。第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、激發(fā)光譜與熒光光譜

1、激發(fā)光譜

將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強度(F)，以激發(fā)光的波長為橫座標，熒光強度為縱座標作F—l光譜圖，便可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。

從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強度最強的激發(fā)波長lex，選用lex可得到強度最大的熒光。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日2、熒光光譜

如果保持激發(fā)光的波長和強度不變，測量不同波長處熒光的強度分布，將熒光的波長為橫座標，熒光強度為縱座標作F-l

光譜圖便得到熒光光譜或稱發(fā)射光譜。

倍頻峰

熒光光譜中熒光強度最強的波長為lem

。第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、溶液熒光光譜特征斯托克斯位移在溶液熒光光譜中，熒光波長總是大于激發(fā)光波長。激發(fā)與發(fā)射之間存在著一定的能量損失。熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關系第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日物質(zhì)分子結(jié)構與熒光的發(fā)生及熒光強度緊密相關，根據(jù)物質(zhì)的分子結(jié)構可判斷物質(zhì)的熒光特性。分子能產(chǎn)生熒光或磷光，首先要求分子結(jié)構能吸收紫外和可見輻射。通常，分子吸收輻射的能力愈強，則產(chǎn)生的熒光或磷光也愈強。熒光體系：幾乎都是含有一個或幾個苯環(huán)的復雜的有機化合物。在這些化合物中能產(chǎn)生最強熒光的吸收過程通常包含有ππ*躍遷而達到電子激發(fā)態(tài)的。五、熒光與分子結(jié)構的關系

第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日六、分析方法

波長掃描

時間掃描

3-D掃描

第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日1、波長掃描

給定發(fā)射波長，在激發(fā)波長的某一范圍內(nèi)進行掃描。給定激發(fā)波長，在發(fā)射波長的某一范圍內(nèi)進行掃描。

EX波長：200-900nmEM開始波長：200~890nmEM結(jié)束波長：210~900nm

EM波長：200-890nmEX開始波長：200~890nmEX結(jié)束波長：210~900nm第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日2、時間掃描EX波長：200-900nmEM波長：200-900nm給定激發(fā)波長和發(fā)射波長，掃描一段時間。第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日3、3-D掃描

EX開始波長：200~850nmEX結(jié)束波長：200~900nmEX采樣間隔：1~50nm

EM開始波長：200~850nmEM結(jié)束波長：200~900nmEM采樣間隔：1~10nm

等高線的間隔：0.01~1000在激發(fā)波長和發(fā)射波長的給定范圍內(nèi)進行掃描。

第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日七、熒光強度與溶液濃度的關系

(一)定量依據(jù)If=2.3φfI0εbc（熒光物質(zhì)濃度很?。┦街校害說為熒光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程，c為熒光物質(zhì)的濃度。在一定條件下，φf、I0、ε、b均為常數(shù)：

If=Kc

第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日（二）定量方法1.標準曲線法

配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出未知試樣的濃度。2.比較法在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較：第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日（3）熒光定性分析

將實驗測得樣品的熒光激發(fā)光光譜和熒光發(fā)射光譜與標準熒光光譜圖進行比較來鑒定樣品成分。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日七、熒光分析法的應用

目前熒光分析大多用于定量分析，由于自身發(fā)射熒光的化合物不多，因此往往利用有機試劑與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)結(jié)合形成發(fā)熒光的配合物來進行測定。(1)無機化合物的分析與有機試劑形成配合物后測量；可測量約60多種元素。第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日（2）有機化合物的分析芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構，多能發(fā)生熒光，可以直接進行熒光測定；而脂肪族化合物的分子結(jié)構較簡單，本身能發(fā)熒光的很少，須與某些試劑反應后才能進行分析。第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日

由于分子熒光分析法的選擇性和靈敏性好，常應用于醫(yī)藥、食品、生物化學和天然產(chǎn)物的分析。在有機物分析方面應用較多。應用：第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日八、磷光分析法及應用

與熒光相比，磷光具有兩個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長；（2）磷光的壽命比熒光長。1.磷光強度與磷光物質(zhì)濃度的關系當磷光物質(zhì)濃度很小時，磷光強度Ip與磷光物質(zhì)濃度c之間的關系式為：Ip=2.3φpI0εbc式中：φp為磷光效率，I0為激發(fā)光的強度，ε磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，b為試樣池的光程。在一定條件下，φp、I0、ε、b均為常數(shù)，所以上式可寫成：

Ip=Kc第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.溫度對磷光強度的影響

隨著溫度的降低，磷光逐漸增強。3.低溫磷光

用液氮作冷卻劑。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日九、儀器介紹F-