第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件

生化分離工程第四章細胞破碎和分離提取技術生化分離工程第四章細胞破碎和分離提取技術1破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細胞內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（還原型）酶抑制劑：針對性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸2細胞破碎（Celldisruption）細胞的結(jié)構(gòu)動物/植物和微生物：前者沒有細胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細胞膜，易于破碎細菌：革蘭氏陽性菌的細胞壁比陰性菌的細胞壁堅固Why？較難破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的胞壁厚細胞破碎（Celldisruption）細胞的結(jié)構(gòu)3G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)成分：細胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，其中葡聚糖主要維持細胞壁強度G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%細胞壁組成G+G44.1細胞破碎技術細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細胞破碎4.1細胞破碎技術細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同51、機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細胞器）的微生物細胞1、機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細62）高壓勻漿法

（high-pressurehomogenization）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用2）高壓勻漿法

（high-pressurehomoge73）超聲波破碎（ultrasonication）機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。3）超聲波破碎（ultrasonication）機理：高于28機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細胞、細胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細菌細菌機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的92、細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細胞破碎方法，適用于易于破碎的細胞，eg.動物細胞和革蘭氏陰性菌。細胞于高滲介質(zhì)中？脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復操作多次使細胞破壞，對于存在于細胞質(zhì)周圍靠近細胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效2、細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticsho103、化學法破碎用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。3、化學法破碎用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分利114、生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細胞需用不同的酶：酵母細胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細胞碎片等，不同的細胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶4、生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁124、生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應用，esp.G-的酶溶更受到了限制4、生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑135、超臨界細胞破碎技術超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細胞內(nèi)。突然降壓后，因細胞內(nèi)外較大的壓差使細胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細胞壁較厚的細胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果5、超臨界細胞破碎技術超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上14破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學法C、提取產(chǎn)物與細胞膜或細胞壁結(jié)合，可采用化學法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過程中應注意的問題154.2BuffersWhatisbuffer？Whyusebuffer？pH=pKa±0.5時，作為buffer，其緩沖能力最強補充14.2BuffersWhatisbuffer？pH=16磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpurposes,pKa2isofgreatestinterest－Why？磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpu17Howtomakingabuffer？溶液：1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4、pH7.5緩沖液含1mmol/LEDTA0.15mol/LNaCl2mol/L尿素3mmol/LGSH和0.6mmol/LGSSG1LHowtomakingabuffer？溶液：18方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：600mL1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）與400mL1/15mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4）混勻?！?L1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液、pH7.5bufferA另取一燒杯，分別稱取1mmolEDTA；0.15molNaCl；2mol尿素；3mmolGSH和0.6mmolGSSG用bufferA溶解并定容至1L方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：6019方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.0）：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與29.2mL0.1mol/L鹽酸混勻后，用去離子水定容至100mL。“x”mlsolutionofA＋

“y”mlsolutionofBWhy?ThepresenceofextrasaltsmaychangethepHormolarityofthebufferduetocommonioneffectsInvolvesextrawork（makinguptwosolutions）Waste（TheunusedvolumesofAandBarediscarded）Usuallyinaccurate缺點方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.20第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件21方案2Choosethebuffer（withapKaascloseaspossibletothedesiredpH）Indentifywhetherthebufferismadefromanacidorabase（buffer由哪種酸或堿構(gòu)成？）Choosethespeciesthatgivesno-productswhentitrated（選擇一種，使得其用HCl或NaOH滴定時無副產(chǎn)物出現(xiàn)）Calculatethemassrequiredtogivetherequiredmolarity計算并稱量配制溶液所需的質(zhì)量Addallcomponents,titratetothepHandmakeupthevolume（加入所有其它組分，用HCl或NaOH調(diào)至所需pH并定容）pH計工作原理及使用注意事項描述緩沖液的兩個指標：緩沖液的摩爾濃度緩沖液pH方案2Choosethebuffer（withapK22小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預期pH（pH±0.5）溫度改變、溶液稀釋及添加中性鹽的情況下，緩沖液pH變化盡可能小緩沖物質(zhì)不與實驗中其他物質(zhì)發(fā)生反應，不干擾實驗的檢測（eg.硼酸鹽/糖蛋白，280nm處有光吸收）一般常用的緩沖液都有現(xiàn)成的配方，可查閱相關參考書利用特定的緩沖液計算軟件或者網(wǎng)上緩沖液計算軟件：http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預期pH（pH±0.5）一般常23第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件24第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件254.3AssaysforactivityandconcentrationMostproteinshavesomeformofuniquefunctionalactivity（具有一種活性）,whichdefinesthespecificprotein.Beforetheproteincanbeisolated,itisnecessarytoconceiveof(確定)anactivityandtodevise（設計）anappropriateassay.補充2Theactivityassayshouldbe:specific,

todefinetheproteinofinterestanddistinguishitfromallothersquantitative,

sothatthesuccessofthepurificationcanbemonitored

economical

intermsoftimeandmaterial.4.3Assaysforactivityandco26干擾素含量測定（MTT法生物學活性測定）

原理：干擾素能刺激某些指示細胞(如人羊膜上皮細胞Wish株、人喉癌細胞株Hep-2等)產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細胞免受水皰性口炎病毒(VSV)的攻擊，根據(jù)待測樣品不同稀釋度的保護能力，計算出干擾素生物學活性單位。材料：

VSV、Wish細胞、MTT、二甲亞砜(DMSO)、10％FCS

RPMI1640、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、CO2孵箱、超凈臺、酶標檢測儀?；钚远x：以保護半數(shù)(50％)Wish細胞免受病毒VSV損害的最高干擾素稀釋度為1個干擾素活性單位。干擾素含量測定（MTT法生物學活性測定）原理：干擾素能刺激27尿激酶活性測定尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物體內(nèi)，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。對合成底物的活性與胰蛋白酶和纖溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-賴氨酸甲酯。對血纖維蛋白、血纖維蛋白原等都有溶解作用，從而達到溶血栓、抗凝血作用，所以是一種十分有效的溶血劑。在臨床上，尿激酶已廣泛應用于治療各種新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。尿激酶活性測定尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原28尿激酶活性測定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在40-60oC迅速加入（牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液0.5mL，立即混勻，倒入平皿（直徑9cm），制成厚度約0.2cm的纖維膜。分別加入不同濃度的標準液及供試品液各10mL于膜上，蓋上蓋，于37oC培養(yǎng)箱保溫18h后取出，分別量出每個溶圈垂直的兩直徑。以溶圈直徑（平均）為縱坐標，標準品效價為橫坐標，做標準曲線尿激酶活性測定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在29胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對這些鍵的敏感性次序為：酯鍵>酰胺鍵>肽鍵?？衫煤羞@些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（簡稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡稱BANA）測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡稱BAEE）和對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡稱TAME）測定酯酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測定方法而異。胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基30ConcentrationassaysAnumberofmethodsareavailableformeasuringproteinconcentrationEachbeingbasedonaspecificpropertyofproteinsEachhavingcertainadvantagesanddisadvantages.ConcentrationassaysAnumbero311、AbsorptionofultravioletlightTheextinctioncoefficients(消光系數(shù))ofproteinsdifferUV-absorptionisusefulasaqualitative（定性）measure,fordetectingthepresenceofprotein（檢測蛋白質(zhì)是否存在）Butislessusefulforaccuratequantitativemeasurements（準確定量測定）Exceptforpureproteinsofknownextinctioncoefficient.Becauseofitssimplicity,UVabsorptionisthemethodfavoredforcontinuous(semi-quantitative)monitoringoftheproteinconcentrationintheeluatefromchromatographycolumns.1、Absorptionofultravioletli32OneofthelimitationsofUV-absorbanceUV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的非蛋白質(zhì)物質(zhì)）mayinterferewith（干擾）themeasurement.Anelegantmethodforeliminatingtheabsorptionduetonucleicacids,thusallowingameasurementofproteinmustbetakenNucleicacids,whichareubiquitously（無所不在的）presentinbiologicalmaterial,absorbUVradiationstrongly,withaprofileoverlappingthatofprotein,butwithamaximumat260nm.OneofthelimitationsofUV-a332、ThebiuretassayInalkalinesolution,proteins（withpeptidebonds）reduceCu2+toCu+togiveabluecolouredcomplex.Becausethereactioniswithpeptidebonds,thereislittlevariationinthecolourintensitygivenbydifferentproteins（不同蛋白質(zhì)的光吸收強度差別不大）.Thebiuretmethodcanbeusedforthemeasurementofproteinconcentration2、ThebiuretassayInalkaline34Adisadvantageofthebiuretmethod：

Itisrelativelyinsensitive(靈敏度低),sothatlargeamountsofproteinarerequiredfortheassay（每次蛋白質(zhì)含量測定時所需蛋白質(zhì)量要很大）.Anotherlimitationisthataminobuffers,suchasTris,whicharecommonlyusedinthepHrange8-10,caninterferewiththereaction.Adisadvantageofthebiuretm353、TheLowryassayMaybeconsideredasanextensionofthebiuretassay.Initially,aCu+-proteincomplexisformed,asinthebiuretassay.Cu+（orprotein中Phe、Tyr）thenreducetheso-calledFolin-Ciocalteureagent(福林-酚試劑),toyieldanintensebluecolour.AnadvantageoftheLowryoverthebiuretassay：

muchmoresensitive,andthusconsumesmuchlessoftheproteinsample.Disadvantage：moresensitivetointerference對很多干擾試劑敏感,aconsequenceofthemorecomplicatedchemistryinvolved需要配置很多種復雜試劑.3、TheLowryassayMaybeconsid364、Thebicinchoninicacid(BCA)assayBicinchoninicacid（二喹啉甲酸）formsa2:1complexwithCu+formedinthebiuretreactionresultinginastable,highlycolouredchromophore（高吸收特性的生色團）withanabsorbancemaximumat562nm.TheBCAassayismoresensitivethantheLowrymethodandisalsolesssubjecttointerferencebyanumberofcommonlyencounteredsubstances.Sensitivetointerferencebystrongreducingagents（強還原劑Why？）,e.g.ascorbicacid（抗壞血酸）.4、Thebicinchoninicacid(BCA)375、TheBradfordassay

thedye-bindingmethodCoomassieblueG-250,dissolvedinacidsolution（酸性溶液中）,belowpH1,isared-browncolour（紅褐色）regainsitscharacteristicbluecolourwhenitbecomesboundtoaprotein（與蛋白質(zhì)形成復合物后）.Theconcentrationofproteincanthereforebemeasuredbytheextenttowhichthebluecolour,measuredat595nm,isrestored.Advantages:Simplicity,sensitivityandresistancetointerference.5、TheBradfordassay

thedye-b385）TheBradfordassay

thedye-bindingmethodG-250bindslargelytobasicandaromaticaminoacids.Differentproteinswilldifferintheircontentoftheseaminoacidsandso,ideally,astandardcurveshouldbeelaboratedforeachspecificprotein.Disadvantage：thereagenttendstosticktoglassandplasticware塑料器材.Forthisreason,theuseofdisposablecuvettes一次性試管isrecommended.OrthedyecanberemovedfromsurfacesbyusingSDS.5）TheBradfordassay

thedye-b39蛋白質(zhì)分析作業(yè)若想分析破胞后所得粗酶液（或發(fā)酵液離心后上清液）的蛋白質(zhì)含量，可采用哪些分析方法？實驗室在分離純化基因重組E.coli所表達的γ-干擾素含量時，當分離的初級階段，測定蛋白質(zhì)濃度時建議采用哪種？當進行多步色譜法純化之后，電泳檢驗為單一條帶，此時建議采用哪種蛋白質(zhì)分析方法來確定含量？蛋白質(zhì)含量的諸多分析方法中，哪種適用于混合蛋白質(zhì)含量的測定？各有何優(yōu)缺點？哪種適用于純度較高的蛋白質(zhì)含量測定？各有何優(yōu)缺點？蛋白質(zhì)分析作業(yè)若想分析破胞后所得粗酶液（或發(fā)酵液離心后上清液40生化分離工程第四章細胞破碎和分離提取技術生化分離工程第四章細胞破碎和分離提取技術41破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細胞內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（還原型）酶抑制劑：針對性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸42細胞破碎（Celldisruption）細胞的結(jié)構(gòu)動物/植物和微生物：前者沒有細胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細胞膜，易于破碎細菌：革蘭氏陽性菌的細胞壁比陰性菌的細胞壁堅固Why？較難破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的胞壁厚細胞破碎（Celldisruption）細胞的結(jié)構(gòu)43G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)成分：細胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，其中葡聚糖主要維持細胞壁強度G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%細胞壁組成G+G444.1細胞破碎技術細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細胞破碎4.1細胞破碎技術細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同451、機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細胞器）的微生物細胞1、機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細462）高壓勻漿法

（high-pressurehomogenization）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用2）高壓勻漿法

（high-pressurehomoge473）超聲波破碎（ultrasonication）機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。3）超聲波破碎（ultrasonication）機理：高于248機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細胞、細胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細菌細菌機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的492、細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細胞破碎方法，適用于易于破碎的細胞，eg.動物細胞和革蘭氏陰性菌。細胞于高滲介質(zhì)中？脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復操作多次使細胞破壞，對于存在于細胞質(zhì)周圍靠近細胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效2、細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticsho503、化學法破碎用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。3、化學法破碎用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分利514、生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細胞需用不同的酶：酵母細胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細胞碎片等，不同的細胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶4、生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁524、生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應用，esp.G-的酶溶更受到了限制4、生物法破碎自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑535、超臨界細胞破碎技術超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細胞內(nèi)。突然降壓后，因細胞內(nèi)外較大的壓差使細胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細胞壁較厚的細胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果5、超臨界細胞破碎技術超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上54破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學法C、提取產(chǎn)物與細胞膜或細胞壁結(jié)合，可采用化學法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過程中應注意的問題554.2BuffersWhatisbuffer？Whyusebuffer？pH=pKa±0.5時，作為buffer，其緩沖能力最強補充14.2BuffersWhatisbuffer？pH=56磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpurposes,pKa2isofgreatestinterest－Why？磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpu57Howtomakingabuffer？溶液：1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4、pH7.5緩沖液含1mmol/LEDTA0.15mol/LNaCl2mol/L尿素3mmol/LGSH和0.6mmol/LGSSG1LHowtomakingabuffer？溶液：58方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：600mL1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）與400mL1/15mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4）混勻?！?L1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液、pH7.5bufferA另取一燒杯，分別稱取1mmolEDTA；0.15molNaCl；2mol尿素；3mmolGSH和0.6mmolGSSG用bufferA溶解并定容至1L方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：6059方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.0）：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與29.2mL0.1mol/L鹽酸混勻后，用去離子水定容至100mL?！皒”mlsolutionofA＋

“y”mlsolutionofBWhy?ThepresenceofextrasaltsmaychangethepHormolarityofthebufferduetocommonioneffectsInvolvesextrawork（makinguptwosolutions）Waste（TheunusedvolumesofAandBarediscarded）Usuallyinaccurate缺點方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.60第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件61方案2Choosethebuffer（withapKaascloseaspossibletothedesiredpH）Indentifywhetherthebufferismadefromanacidorabase（buffer由哪種酸或堿構(gòu)成？）Choosethespeciesthatgivesno-productswhentitrated（選擇一種，使得其用HCl或NaOH滴定時無副產(chǎn)物出現(xiàn)）Calculatethemassrequiredtogivetherequiredmolarity計算并稱量配制溶液所需的質(zhì)量Addallcomponents,titratetothepHandmakeupthevolume（加入所有其它組分，用HCl或NaOH調(diào)至所需pH并定容）pH計工作原理及使用注意事項描述緩沖液的兩個指標：緩沖液的摩爾濃度緩沖液pH方案2Choosethebuffer（withapK62小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預期pH（pH±0.5）溫度改變、溶液稀釋及添加中性鹽的情況下，緩沖液pH變化盡可能小緩沖物質(zhì)不與實驗中其他物質(zhì)發(fā)生反應，不干擾實驗的檢測（eg.硼酸鹽/糖蛋白，280nm處有光吸收）一般常用的緩沖液都有現(xiàn)成的配方，可查閱相關參考書利用特定的緩沖液計算軟件或者網(wǎng)上緩沖液計算軟件：http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預期pH（pH±0.5）一般常63第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件64第四章-細胞破碎和分離提取技術-課件654.3AssaysforactivityandconcentrationMostproteinshavesomeformofuniquefunctionalactivity（具有一種活性）,whichdefinesthespecificprotein.Beforetheproteincanbeisolated,itisnecessarytoconceiveof(確定)anactivityandtodevise（設計）anappropriateassay.補充2Theactivityassayshouldbe:specific,

todefinetheproteinofinterestanddistinguishitfromallothersquantitative,

sothatthesuccessofthepurificationcanbemonitored

economical

intermsoftimeandmaterial.4.3Assaysforactivityandco66干擾素含量測定（MTT法生物學活性測定）

原理：干擾素能刺激某些指示細胞(如人羊膜上皮細胞Wish株、人喉癌細胞株Hep-2等)產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細胞免受水皰性口炎病毒(VSV)的攻擊，根據(jù)待測樣品不同稀釋度的保護能力，計算出干擾素生物學活性單位。材料：

VSV、Wish細胞、MTT、二甲亞砜(DMSO)、10％FCS

RPMI1640、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、CO2孵箱、超凈臺、酶標檢測儀?；钚远x：以保護半數(shù)(50％)Wish細胞免受病毒VSV損害的最高干擾素稀釋度為1個干擾素活性單位。干擾素含量測定（MTT法生物學活性測定）原理：干擾素能刺激67尿激酶活性測定尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物體內(nèi)，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。對合成底物的活性與胰蛋白酶和纖溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-賴氨酸甲酯。對血纖維蛋白、血纖維蛋白原等都有溶解作用，從而達到溶血栓、抗凝血作用，所以是一種十分有效的溶血劑。在臨床上，尿激酶已廣泛應用于治療各種新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。尿激酶活性測定尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原68尿激酶活性測定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在40-60oC迅速加入（牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液0.5mL，立即混勻，倒入平皿（直徑9cm），制成厚度約0.2cm的纖維膜。分別加入不同濃度的標準液及供試品液各10mL于膜上，蓋上蓋，于37oC培養(yǎng)箱保溫18h后取出，分別量出每個溶圈垂直的兩直徑。以溶圈直徑（平均）為縱坐標，標準品效價為橫坐標，做標準曲線尿激酶活性測定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在69胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對這些鍵的敏感性次序為：酯鍵>酰胺鍵>肽鍵?？衫煤羞@些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（簡稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡稱BANA）測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡稱BAEE）和對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡稱TAME）測定酯酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測定方法而異。胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基70ConcentrationassaysAnumberofmethodsareavailableformeasuringproteinconcentrationEachbeingbasedonaspecificpropertyofproteinsEachhavingcertainadvantagesanddisadvantages.ConcentrationassaysAnumbero711、AbsorptionofultravioletlightTheextinctioncoefficients(消光系數(shù))ofproteinsdifferUV-absorptionisusefulasaqualitative（定性）measure,fordetectingthepresenceofprotein（檢測蛋白質(zhì)是否存在）Butislessusefulforaccuratequantitativemeasurements（準確定量測定）Exceptforpureproteinsofknownextinctioncoefficient.Becauseofitssimplicity,UVabsorptionisthemethodfavoredforcontinuous(semi-quantitative)monitoringoftheproteinconcentrationintheeluatefromchromatographycolumns.1、Absorptionofultravioletli72OneofthelimitationsofUV-absorbanceUV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的非蛋白質(zhì)物質(zhì)）mayinterferewith（干擾）themeasurement.Anelegantmethodforeliminatingtheabsorptionduetonucleicacids,thusallowingameasurementofproteinmustbetakenNucleicacids,whichareubiquitously（無所不在的）presentinbiologicalmaterial,absorbUVradiationstrongly,withaprofileoverlappingthatofprotein,butwithamaximumat260nm.OneofthelimitationsofUV-a732、ThebiuretassayInalkalinesolution,proteins（withpeptidebonds）reduceCu2+toCu+togiveabluecolouredcomplex.Becausethereactioniswithpeptidebonds,thereislittlevariationinthecolourintensitygivenbydifferentproteins（不同蛋白質(zhì)的光吸收強度差別不大）.Thebiuretmethodcanbeusedforthemeasurementofproteinconcentration2、ThebiuretassayInalkaline74Adisadvantageofthebiuretmethod：

Itisrelativelyinsensitive(靈敏度低),sothatlargeamountsofproteinarerequiredfortheassay（每次蛋白質(zhì)含量測定時所需蛋白質(zhì)量要很大）.Anotherlimitationisthataminobuffers,suchasTris,whicharecommonlyusedinthepHrange8-10,caninterferewiththereaction.Adisadvantageofthebiuretm753、TheLowryassayMaybeconsideredasanextensionofthebiuretassay.Initially,