第15章DNA的生物合成和損傷修復(fù)課件

CrickWatsonCrickWatson1DNAReplicationTranscriptionTranslationTheCentralDogmabyFrancisCrickin1958DNAReplicationTranscriptionTr2

DNA的生物合成和損傷修復(fù)DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息傳遞DNA的生物合成第3染色體DNA復(fù)制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一節(jié)染色體DNA復(fù)制的一般特征第一節(jié)4一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制51958Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)1958Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)6雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)制叉(replicationfork)。二、DNA復(fù)制的生長(zhǎng)點(diǎn)形成復(fù)制叉目錄雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)7三、DNA復(fù)制是雙向復(fù)制

一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。兩個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，單向復(fù)制。一個(gè)起點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。三、DNA復(fù)制是雙向復(fù)制一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。835353535前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5四、DNA復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstrand）后隨鏈（laggingstrand）岡崎片段（Okazakifragments)DNA半不連續(xù)復(fù)制。35353535前導(dǎo)鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?復(fù)制起點(diǎn)（origin）：五、復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成原核生物單一復(fù)制起點(diǎn)真核生物多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制子（replicon）從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域。

復(fù)制起點(diǎn)（origin）：五、復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成原10E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:①多個(gè)短重復(fù)序列;②可被復(fù)制起始因子所識(shí)別;③一般富含AT，利于DNA解旋。Green:initiatorbindingsitesBlue:

unwoundregionRed:replicationinitiationsiteE.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:Gre11六、DNA復(fù)制必須有引物（一）多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物（二）個(gè)別DNA復(fù)制以DNA或核苷酸為引物174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3-OH為引物。(三)體外DNA合成采用DNA作引物六、DNA復(fù)制必須有引物（一）多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物12Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Proteinprimingasasolution13DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開(kāi)DNA雙螺旋，暴露復(fù)制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開(kāi)始延伸DNA連接酶：連結(jié)岡崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA復(fù)制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶：催化合成DNA七、DNA復(fù)制需要多種酶參與14DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)是DNA復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制起始利用引物也是確保DNA復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)制之一。八、DNA復(fù)制具有高度忠實(shí)性DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticer15

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二節(jié) DNA聚合酶的特征第二節(jié)16一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板復(fù)合物/連接處(primer-templatejunction)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP17CorrectlypairedbasesarerequiredforDNApolymerasecatalyzednucleotideaddition.二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成Correctlypairedbasesarereq18SchematicillustrationofWHYrNTPcannotbeusedbyDNApolymeraseSchematicillustrationofWHY19三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個(gè)結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；35外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)拇指手掌引物鏈?zhǔn)种妇酆厦富钚灾行耐馇忻富钚灾行哪０彐溔NA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個(gè)結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位20DNA聚合酶合成的進(jìn)行性（processivity):DNA夾子（slidingclamp）可增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性。四、可滑動(dòng)的DNA夾子增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性DNA聚合酶合成的進(jìn)行性（processivity):四、可21DNA聚合酶35外切酶活性與校對(duì)功能(proofreading).五、DNA聚合酶還有一個(gè)3’5’外切酶活性中心DNA聚合酶35外切酶活性與校對(duì)功能(proofrea22大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程DNAreplicationinE.coli第三節(jié)大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程第三節(jié)23E.coliDNA復(fù)制起始

一、在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)；解旋解鏈,形成復(fù)制叉單鏈DNA形成，SSB結(jié)合單鏈引發(fā)體組裝及引物合成。E.coliDNA復(fù)制起始一、在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因24DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復(fù)制起始需要6種蛋白因子：DnaA、DnaB、DnaC、HU、DNA復(fù)制起始需要6種蛋25E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3-GTC-5，引物長(zhǎng)度一般11~12個(gè)堿基。二、引發(fā)酶合成RNA引物E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引26負(fù)責(zé)切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復(fù)損傷。負(fù)責(zé)合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合27TLS1Rev1TLS，體細(xì)胞高變1Pol相對(duì)準(zhǔn)確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1PolTLS1Pol體細(xì)胞高變（somatichypermutation）1Pol減數(shù)分裂相關(guān)的DNA損傷修復(fù)1PolTLS1PolDNA交聯(lián)損傷修復(fù)1PolDNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)4PolDNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)2~3Pol線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)3Pol堿基切除修復(fù)1Pol合成引物4Pol功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復(fù)，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復(fù)制9PolⅢ全酶染色體DNA復(fù)制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復(fù)1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復(fù)1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細(xì)胞DNA聚合酶的類型和功能目錄TLS1Rev1TLS，體細(xì)胞高變1Pol相對(duì)準(zhǔn)確的28DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：亞基（130000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（校正功能）亞基可增強(qiáng)其活性亞基可能起組裝作用γcomplex/clamploaderDNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：2935353535前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈

同一個(gè)聚合酶如何同時(shí)合成兩條鏈?35353535前導(dǎo)鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?0

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈31第15章DNA的生物合成和損傷修復(fù)課件32三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物33DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA連接酶（ligase）將兩個(gè)岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ

53外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補(bǔ)缺口DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ34323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Kl35Ter(terminus)Tus(terminusutilizationsubstance).四、Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止Ter(terminus)四、Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制361)ParentDNAarefullymethylated;2)DaughterDNAarehemimethylated3)SeqAquicklybindstohemimethylatedsequences;4)InhibitsfullmethylationandbindingofOriCbyDnaA;DammethylasemethylatesDNAattheN6positionofalladenineswithinGATCsequences.五、DNA甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中僅起一次作用1)ParentDNAarefullymethyla37E.ColiDNAreplicationisregulatedbyDnaA,ATPlevelsandSeqASeqAsequesterDnaAbindingofOriC;AdditionalDnaAbindingsitesinthechromosome(~300,afterreplicationitisduplicated)andthusdecreasetheDnaAlevelavailable;ATPlevelandthereplacementofDnaA-ADPtoDnaA-ATPisaslowprocess.E.ColiDNAreplicationisregu38復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋。六、DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生正超螺旋。六、DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)39E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋40E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。41E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體42ReplicationterminationinEukaryotes:

TheendreplicationproblemPage333ReplicationterminationinEuk43Solution1:Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Solution1:Proteinprimingas44Solution2:Replicationoftelomeresby

telomeraseSolution2:Replicationoftel45ReplicationoftelomeresbytelomeraseReplicationoftelomeresbyte46線粒體和噬菌體的DNA復(fù)制DNAreplicationinmitochondriaandphages第五節(jié)線粒體和噬菌體的DNA復(fù)制DNAreplicationi47一、線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H鏈和一條L鏈dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點(diǎn)：兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；一、線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H48二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈??E.coli噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋DNA分子；E.co493-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制550DNApolymeraseerrorratesInitialpairingerror=1/105Afterproofreading-Finalcopy=1/107Actualerrorrates~1/109Humangenome=3.2x109bp3errors/replication!DNApolymeraseerrorratesInit51MutationofDNAToofast:harmfultosurvivalandproliferation;Tooslow:lackofevolutionforce.MutationofDNAToofast:harmf52DNAdamageandrepairDNADamage:AnychangesintheDNAmoleculeisreferedtoas~.Mutation:ApermanentchangeinthenucleotidesequenceofDNAiscalledamutation.DNAdamageandrepairDNADamag53ImportanceofDNARepair?DNAistheonlybiologicalmacromoleculethatisrepaired.Allothersarereplaced.?Morethan100genesarerequiredforDNArepair,eveninorganismswithverysmallgenomes.?CancerisaconsequenceofinadequateDNArepair.ImportanceofDNARepair54DNA損傷修復(fù)TheRepairofDNADamage第六節(jié)DNA損傷修復(fù)第六節(jié)55一、復(fù)制差錯(cuò)和化學(xué)/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生誤差化學(xué)或物理?yè)p傷轉(zhuǎn)座子（transposons）的轉(zhuǎn)座作用自發(fā)突變遺傳信息的突變來(lái)源：一、復(fù)制差錯(cuò)和化學(xué)/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生56首先，在基因組中迅速找到錯(cuò)配的核苷酸；然后，準(zhǔn)確地校正錯(cuò)配核苷酸。二、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)DNA復(fù)制中出現(xiàn)的差錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）能夠發(fā)現(xiàn)和修復(fù)DNA復(fù)制中錯(cuò)配的核苷酸，提高復(fù)制準(zhǔn)確率。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：首先，在基因組中迅速找到錯(cuò)配的核苷酸；二、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)D57E.coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)復(fù)制差錯(cuò)（一）E.coli依賴Dam甲基化酶識(shí)別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈E.coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)復(fù)制差錯(cuò)（一）E.coli依賴D58模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈MutH僅切割新合成的DNA鏈模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈59MSH（MutShomologs）蛋白與MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核細(xì)胞利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈真核細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)無(wú)MutH，也無(wú)半甲基化標(biāo)記母鏈。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈。真核細(xì)胞核苷酸修復(fù)錯(cuò)配系統(tǒng)：MSH（MutShomologs）蛋白（二）真核細(xì)胞利用岡60三、多種化學(xué)或物理因素造成細(xì)胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價(jià)交聯(lián)DNA損傷類型其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結(jié)果:三、多種化學(xué)或物理因素造成細(xì)胞DNA損傷堿基丟失DNA損傷類61四、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體，無(wú)嘌呤位點(diǎn)跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復(fù)E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚體，堿基烷基化核苷酸切除修復(fù)DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）堿基損傷堿基切除修復(fù)E.coli：DNA光裂合酶等嘧啶二聚體直接修復(fù)E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS復(fù)制差錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)酶損傷修復(fù)系統(tǒng)的類型四、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如62修復(fù)對(duì)象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。分布：分布廣泛，除哺乳動(dòng)物外均有之。（一）直接修復(fù)（directrepair）系統(tǒng)利用酶簡(jiǎn)單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)：修復(fù)對(duì)象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。（一63修復(fù)對(duì)象：DNA中被甲基化修飾的鳥(niǎo)嘌呤（O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤，與T配對(duì)）。特點(diǎn)：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修復(fù)代價(jià)高昂。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)修復(fù)對(duì)象：DNA中被甲基化修飾的鳥(niǎo)嘌呤（O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤，與64E.coli堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶（二）堿基切除系統(tǒng)修復(fù)切除受損堿基Baseexcisionrepair,BERE.coli堿基切除修復(fù)系統(tǒng)（二）堿基切除系統(tǒng)修復(fù)切除受損堿65胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；氧化的鳥(niǎo)嘌呤（oxoG）；脫氨基的腺嘌呤；開(kāi)環(huán)堿基；碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。

DNA糖苷酶識(shí)別的異常堿基包括：胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；DNA糖苷酶識(shí)別的異常堿基包括：66（三）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋變形nucleotideexcisionrepair,NERNER識(shí)別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形而非特殊堿基UvrA識(shí)別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形UvrB負(fù)責(zé)解鏈，募集核酸內(nèi)切酶UvrCUvrC在損傷部位的兩側(cè)切斷DNA鏈UvrD去除這兩個(gè)切點(diǎn)之間的DNA片段DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)缺口（三）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別DNA雙螺旋變形nucleoti67（四）重組修復(fù)系統(tǒng)能夠修復(fù)雙鏈斷裂損傷（四）重組修復(fù)系統(tǒng)能夠修復(fù)雙鏈斷裂損傷68E.coli跨損傷DNA合成（五）跨損傷DNA聚合酶能夠跨越損傷部位合成DNAE.coli跨損傷DNA合成（五）跨損傷DNA聚合酶能夠跨69第七節(jié)逆轉(zhuǎn)錄概念：在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過(guò)程。ReversetranscriptionRNA腫瘤病毒DNA原病毒（或前病毒）RNA腫瘤病毒1964年,Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制過(guò)程中的中間物。第七節(jié)逆轉(zhuǎn)錄概念：在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DN70逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；RNAseH的活性。逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：71第15章DNA的生物合成和損傷修復(fù)課件72逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒73二、逆轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA二、逆轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA74逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則。該酶是分子生物學(xué)研究中常用的工具酶.Reversetranscription逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則。Reversetranscr75DavidBaltimore

RenatoDulbecco

HowardMartinTemin

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975DavidBaltimoreRenatoDulbecc76End!End!77Figure16.6MinusstrandDNAisgeneratedbyswitchingtemplatesduringreversetranscription.16.2TheretroviruslifecycleinvolvestranspositionlikeeventsFigure16.6MinusstrandDNAi78Figure16.7SynthesisofplusstrandDNArequiresasecondjump.16.2TheretroviruslifecycleinvolvestranspositionlikeeventsFigure16.7Synthesisofplus79第15章DNA的生物合成和損傷修復(fù)課件80TheCentralDogmaTheCentralDogma81CrickWatsonCrickWatson82DNAReplicationTranscriptionTranslationTheCentralDogmabyFrancisCrickin1958DNAReplicationTranscriptionTr83

DNA的生物合成和損傷修復(fù)DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息傳遞DNA的生物合成第84染色體DNA復(fù)制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一節(jié)染色體DNA復(fù)制的一般特征第一節(jié)85一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制一、DNA復(fù)制是半保留復(fù)制861958Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)1958Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)87雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)制叉(replicationfork)。二、DNA復(fù)制的生長(zhǎng)點(diǎn)形成復(fù)制叉目錄雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)88三、DNA復(fù)制是雙向復(fù)制

一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。兩個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，單向復(fù)制。一個(gè)起點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。三、DNA復(fù)制是雙向復(fù)制一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。8935353535前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5四、DNA復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstrand）后隨鏈（laggingstrand）岡崎片段（Okazakifragments)DNA半不連續(xù)復(fù)制。35353535前導(dǎo)鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?0復(fù)制起點(diǎn)（origin）：五、復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成原核生物單一復(fù)制起點(diǎn)真核生物多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制子（replicon）從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域。

復(fù)制起點(diǎn)（origin）：五、復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成原91E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:①多個(gè)短重復(fù)序列;②可被復(fù)制起始因子所識(shí)別;③一般富含AT，利于DNA解旋。Green:initiatorbindingsitesBlue:

unwoundregionRed:replicationinitiationsiteE.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:Gre92六、DNA復(fù)制必須有引物（一）多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物（二）個(gè)別DNA復(fù)制以DNA或核苷酸為引物174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3-OH為引物。(三)體外DNA合成采用DNA作引物六、DNA復(fù)制必須有引物（一）多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物93Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Proteinprimingasasolution94DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開(kāi)DNA雙螺旋，暴露復(fù)制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開(kāi)始延伸DNA連接酶：連結(jié)岡崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA復(fù)制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶：催化合成DNA七、DNA復(fù)制需要多種酶參與95DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)是DNA復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制起始利用引物也是確保DNA復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)制之一。八、DNA復(fù)制具有高度忠實(shí)性DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticer96

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二節(jié) DNA聚合酶的特征第二節(jié)97一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板復(fù)合物/連接處(primer-templatejunction)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP98CorrectlypairedbasesarerequiredforDNApolymerasecatalyzednucleotideaddition.二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成Correctlypairedbasesarereq99SchematicillustrationofWHYrNTPcannotbeusedbyDNApolymeraseSchematicillustrationofWHY100三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個(gè)結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；35外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)拇指手掌引物鏈?zhǔn)种妇酆厦富钚灾行耐馇忻富钚灾行哪０彐溔NA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個(gè)結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位101DNA聚合酶合成的進(jìn)行性（processivity):DNA夾子（slidingclamp）可增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性。四、可滑動(dòng)的DNA夾子增強(qiáng)DNA聚合酶的進(jìn)行性DNA聚合酶合成的進(jìn)行性（processivity):四、可102DNA聚合酶35外切酶活性與校對(duì)功能(proofreading).五、DNA聚合酶還有一個(gè)3’5’外切酶活性中心DNA聚合酶35外切酶活性與校對(duì)功能(proofrea103大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程DNAreplicationinE.coli第三節(jié)大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程第三節(jié)104E.coliDNA復(fù)制起始

一、在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)；解旋解鏈,形成復(fù)制叉單鏈DNA形成，SSB結(jié)合單鏈引發(fā)體組裝及引物合成。E.coliDNA復(fù)制起始一、在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因105DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復(fù)制起始需要6種蛋白因子：DnaA、DnaB、DnaC、HU、DNA復(fù)制起始需要6種蛋106E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3-GTC-5，引物長(zhǎng)度一般11~12個(gè)堿基。二、引發(fā)酶合成RNA引物E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引107負(fù)責(zé)切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復(fù)損傷。負(fù)責(zé)合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合108TLS1Rev1TLS，體細(xì)胞高變1Pol相對(duì)準(zhǔn)確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1PolTLS1Pol體細(xì)胞高變（somatichypermutation）1Pol減數(shù)分裂相關(guān)的DNA損傷修復(fù)1PolTLS1PolDNA交聯(lián)損傷修復(fù)1PolDNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)4PolDNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)2~3Pol線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)3Pol堿基切除修復(fù)1Pol合成引物4Pol功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復(fù)，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復(fù)制9PolⅢ全酶染色體DNA復(fù)制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復(fù)1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復(fù)1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細(xì)胞DNA聚合酶的類型和功能目錄TLS1Rev1TLS，體細(xì)胞高變1Pol相對(duì)準(zhǔn)確的109DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：亞基（130000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（校正功能）亞基可增強(qiáng)其活性亞基可能起組裝作用γcomplex/clamploaderDNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：11035353535前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈

同一個(gè)聚合酶如何同時(shí)合成兩條鏈?35353535前導(dǎo)鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?11

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈112第15章DNA的生物合成和損傷修復(fù)課件113三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物114DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA連接酶（ligase）將兩個(gè)岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ

53外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補(bǔ)缺口DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ115323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Kl116Ter(terminus)Tus(terminusutilizationsubstance).四、Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止Ter(terminus)四、Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制1171)ParentDNAarefullymethylated;2)DaughterDNAarehemimethylated3)SeqAquicklybindstohemimethylatedsequences;4)InhibitsfullmethylationandbindingofOriCbyDnaA;DammethylasemethylatesDNAattheN6positionofalladenineswithinGATCsequences.五、DNA甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中僅起一次作用1)ParentDNAarefullymethyla118E.ColiDNAreplicationisregulatedbyDnaA,ATPlevelsandSeqASeqAsequesterDnaAbindingofOriC;AdditionalDnaAbindingsitesinthechromosome(~300,afterreplicationitisduplicated)andthusdecreasetheDnaAlevelavailable;ATPlevelandthereplacementofDnaA-ADPtoDnaA-ATPisaslowprocess.E.ColiDNAreplicationisregu119復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋。六、DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生正超螺旋。六、DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)120E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋121E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。122E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體123ReplicationterminationinEukaryotes:

TheendreplicationproblemPage333ReplicationterminationinEuk124Solution1:Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Solution1:Proteinprimingas125Solution2:Replicationoftelomeresby

telomeraseSolution2:Replicationoftel126ReplicationoftelomeresbytelomeraseReplicationoftelomeresbyte127線粒體和噬菌體的DNA復(fù)制DNAreplicationinmitochondriaandphages第五節(jié)線粒體和噬菌體的DNA復(fù)制DNAreplicationi128一、線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H鏈和一條L鏈dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點(diǎn)：兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；一、線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H129二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈??E.coli噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋DNA分子；E.co1303-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5131DNApolymeraseerrorratesInitialpairingerror=1/105Afterproofreading-Finalcopy=1/107Actualerrorrates~1/109Humangenome=3.2x109bp3errors/replication!DNApolymeraseerrorratesInit132MutationofDNAToofast:harmfultosurvivalandproliferation;Tooslow:lackofevolutionforce.MutationofDNAToofast:harmf133DNAdamageandrepairDNADamage:AnychangesintheDNAmoleculeisreferedtoas~.Mutation:ApermanentchangeinthenucleotidesequenceofDNAiscalledamutation.DNAdamageandrepairDNADamag134ImportanceofDNARepair?DNAistheonlybiologicalmacromoleculethatisrepaired.Allothersarereplaced.?Morethan100genesarerequiredforDNArepair,eveninorganismswithverysmallgenomes.?CancerisaconsequenceofinadequateDNArepair.ImportanceofDNARepair135DNA損傷修復(fù)TheRepairofDNADamage第六節(jié)DNA損傷修復(fù)第六節(jié)136一、復(fù)制差錯(cuò)和化學(xué)/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生誤差化學(xué)或物理?yè)p傷轉(zhuǎn)座子（transposons）的轉(zhuǎn)座作用自發(fā)突變遺傳信息的突變來(lái)源：一、復(fù)制差錯(cuò)和化學(xué)/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生137首先，在基因組中迅速找到錯(cuò)配的核苷酸；然后，準(zhǔn)確地校正錯(cuò)配核苷酸。二、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)DNA復(fù)制中出現(xiàn)的差錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）能夠發(fā)現(xiàn)和修復(fù)DNA復(fù)制中錯(cuò)配的核苷酸，提高復(fù)制準(zhǔn)確率。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)：首先，在基因組中迅速找到錯(cuò)配的核苷酸；二、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)D138E.coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)復(fù)制差錯(cuò)（一）E.coli依賴Dam甲基化酶識(shí)別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈E.coli錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)復(fù)制差錯(cuò)（一）E.coli依賴D139模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈MutH僅切割新合成的DNA鏈模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈140MSH（MutShomologs）蛋白與MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核細(xì)胞利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈真核細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)無(wú)MutH，也無(wú)半甲基化標(biāo)記母鏈。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯(cuò)配堿基所在的DNA鏈。真核細(xì)胞核苷酸修復(fù)錯(cuò)配系統(tǒng)：MSH（MutShomologs）蛋白（二）真核細(xì)胞利用岡141三、多種化學(xué)或物理因素造成細(xì)胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價(jià)交聯(lián)DNA損傷類型其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結(jié)果:三、多種化學(xué)或物理因素造成細(xì)胞DNA損傷堿基丟失DNA損傷類142四、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體，無(wú)嘌呤位點(diǎn)跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復(fù)E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XP