PCR簡(jiǎn)介-陳小波課件

PCR技術(shù)介紹（PolymeraseChainReaction)

IntroductiontoPCRTechnology實(shí)驗(yàn)室：陳小波遺傳是怎樣實(shí)現(xiàn)的？一、DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)O.T.Avery(1877-1955)1865年1944年1953年二、DNA的體內(nèi)半保留復(fù)制1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）三、PCR的發(fā)明

1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)基因研究的里程碑！

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡(jiǎn)稱ＰＣＲ：

在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，即體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。四、PCR的基本概念模板聚合酶dNTPsBuffer(Mg2+)引物五、PCR的反應(yīng)體系常用體系：10μL

25μL50μLPCR循環(huán)第一步：加熱變性（94℃）靶序列靶序列七、PCR的反應(yīng)過程PCR循環(huán)第三步:引物延伸（72℃

）靶序列靶序列引物1引物2生物素生物素5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon八、PCR的體系優(yōu)化模板：純聚合酶：效率與錯(cuò)配dNTPs：足量Buffer(Mg2+)：鎂離子濃度引物：設(shè)計(jì)合理1.變性溫度和時(shí)間2.退火溫度和時(shí)間3.延伸溫度和時(shí)間

4.循環(huán)數(shù)九、PCR的條件優(yōu)化單因素改變！優(yōu)化PCR條件設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照避免交叉污染

采取隔離措施循環(huán)次數(shù)盡量少十、PCR的質(zhì)量控制熒光定量PCR(Real-timePCR)

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。TaqMan探針技術(shù)Dane顆粒（完整的病毒）HBsAgHBcAg/HBeAgHBVDNADNA聚合酶（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）八、熒光定量PCR檢測(cè)HBV(一)、HBV的結(jié)構(gòu)：(三)、HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測(cè)臨床意義HBsAgHBeAg抗-HBe抗-HBc抗-HBs臨床意義IgMIgG+-----

感染或無癥狀攜帶者++-+--急性乙型肝炎（有傳染）

（大三陽(yáng)）++--+-慢性乙型肝炎（有傳染）

（大三陽(yáng)）+-++-急性肝炎趨向恢復(fù)（小三陽(yáng)）--+-++恢復(fù)期（傳染性低）-----+既往感染或接種疫苗1.檢測(cè)HBV-DNA是判斷乙肝病毒有無復(fù)制的“金指標(biāo)”；2.判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性；3.檢測(cè)病毒變異引起的“HBeAg陰性肝炎”、“抗-HBs陽(yáng)性乙肝”等；4.指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥:如果抗病毒治療3個(gè)月或半年，HBV

DNA仍不轉(zhuǎn)陰或下降少于2次方，則提示該藥物抗病毒療效欠佳，可考慮停藥或換用其他抗病毒藥。

(四)、HBV-DNA檢測(cè)的意義：(五)、HBV-DNA其它檢測(cè)的意義：1HBVP區(qū)耐藥基因測(cè)序各種耐藥：拉米呋啶、阿德福韋、恩曲他濱、恩替卡韋、特比呋啶；2HBVYMDD突變檢測(cè)拉米呋啶耐藥；HBV前C區(qū)1896位點(diǎn)變異檢測(cè)干擾素治療不敏感。3－子宮頸癌與人乳頭瘤病毒（HPV）九、熒光定量PCR檢測(cè)HPV*十九世紀(jì)四十年代:意大利醫(yī)生RegoniStern最早提出：結(jié)婚與否與宮頸癌的發(fā)生可能有關(guān)；

*60－70年代:人們的主要研究對(duì)象是HSV,HCMV等病原體；

*1974年:zurHausen首次提出HPV感染與宮頸腫瘤有密切關(guān)系；(一)、宮頸癌的生物學(xué)病因研究進(jìn)展：返回分子生物*1977年:Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中存在人乳頭狀瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）顆粒；

*1995年IARC專題討論會(huì)：

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。

-99.7％的宮頸癌患者都能發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染。(一)、宮頸癌的生物學(xué)病因研究進(jìn)展：

行為因素：如性生活過早、多個(gè)性伴侶、多孕多產(chǎn)、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位低下、營(yíng)養(yǎng)不良及性混亂等；

生物學(xué)因素：如細(xì)菌、病毒和衣原體等各種微生物的感染。目前僅有少量研究表明宮頸癌可能存在著家族聚集現(xiàn)象。(二)、子宮頸癌的危險(xiǎn)因素：(三)、人乳頭瘤病毒：（HumanPapillomaviruses,HPV）雙鏈DNA無包膜病毒；環(huán)狀DNA，約8Kb；病毒顆粒直徑為50～55nm；依靠宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。HPV電鏡圖1.病毒簡(jiǎn)介：已發(fā)現(xiàn)100多種不同的亞型。其中超過35種可以感染人類的生殖器官，約30種與腫瘤有關(guān)：

1）低危型：宮頸上皮內(nèi)低度病變，引起外生殖器濕疣等良性性?。℉PV6、11、42）；

2）高危型：宮頸上皮內(nèi)高度病變，與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)（HPV16、18、31、33、35、39

、45、51、52、53、56、58、59、66及68）；

3）中間型：不確定型。2.HPV的型別：

3.HPV常見類型:

低危型（6/11）:可導(dǎo)致生殖道、肛周皮膚外生性濕疣病變，或低級(jí)別病變(CIN1)。（6、11、42、43、44）

高危型（16/18）:可導(dǎo)致高級(jí)別病變（CIN2/CIN3）和宮頸癌的發(fā)生。（16、1831、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）

有些亞型和地區(qū)、宮頸癌的病理類型有關(guān)：

1）HPV45在非洲西部很常見；2）HPV39和59在美洲中部和南部常見；3）HPV52，58在中國(guó)常見。

4）在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌中以HPV16為主(占51％)，在腺癌和腺鱗癌中HPV18分別占56％和39％。3.HPV的分布：4.HPV感染率:最常見的低危型:HPV6、11最常見的高危型:HPV16、18、31、33、45、58HPV16HPV18HPV45HPV31HPV33Other宮頸癌患者中高危型HPV感染率表：2006-2007ADICONHPV亞型陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)亞型6111618313335比例

16％18％32％6％4％10％16％亞型394556585973比例2％4％16％8％12％2％子宮頸癌：

病因明確的癌癥;可以早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防的癌癥;可望消滅的癌癥。(四)、子宮頸癌的預(yù)防與檢查:1.概述:表:不同的篩查頻率，可以降低宮頸癌的累積發(fā)病率篩查頻率每年篩查一次每?jī)赡旰Y查一次每三年篩查一次一生篩查5次一生篩查3次一生篩查2次一生篩查一次累積發(fā)病率的降低（％）90-9386-9175-8861-7435-5529-4217-32篩查對(duì)象:三年以上性行為或21歲以上有性行為的婦女終止年齡:65歲以上危險(xiǎn)性極低。篩查間隔:每年一次，若連續(xù)兩次HPV和細(xì)胞學(xué)篩查均為正常，可延長(zhǎng)篩查間隔時(shí)間至5～8年。2.宮頸癌篩查及早診早治指南:

---中國(guó)癌癥研究基金會(huì)（CCRF）篩查方案：

最佳方案：TCT+HPV檢測(cè)隨訪對(duì)象：細(xì)胞學(xué)低度病變、CINI以上者、“特殊職業(yè)”婦女人群、年齡30歲以上的高危HPV感染者，每年定期隨訪檢查。注意事項(xiàng)：

1、在非月經(jīng)期采樣

2、采樣前3天內(nèi)不做陰道沖洗，不使用陰道內(nèi)用藥物

3、采樣前24h內(nèi)不要行性生活TCT檢查3.宮頸癌的常規(guī)臨床檢測(cè)方法:臨床檢查：如肉眼觀察、陰道鏡等;細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：觀察宮頸上皮細(xì)胞的變異，常見方法有：巴氏涂片、TCT等病毒學(xué)檢測(cè)：HPVDNA檢測(cè)(PCR方法),常見方法有：基因芯片分型檢測(cè)、熒光PCR等

特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快捷(98%)4.德、法、英三個(gè)國(guó)家研究數(shù)據(jù)總概:HPV（＋）是宮頸病變的重要依據(jù)，持續(xù)的HPV感染是CINⅡ/CINⅢ的重要條件。液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（ThinprepCytologicTest：TCT）目前國(guó)際領(lǐng)先的一種宮頸防癌細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)

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子宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌。全世界每年約有47萬新發(fā)子宮頸癌，亞洲約38萬，中國(guó)約15萬例。全世界每年約23萬婦女死于宮頸癌，亞洲約19萬，中國(guó)約8萬，美國(guó)約0.5萬。子宮頸癌患者年輕化，腺癌的發(fā)生率上升。年輕人群中的HPV感染增加，其中20歲左右的子宮頸癌患者占所有患者的5%。一、子宮頸癌

巴氏涂片細(xì)胞學(xué)之父：巴巴尼古拉是過去50年來最有效的子宮頸癌的篩選方法。

自從被發(fā)明以來，已經(jīng)減少了70%的子宮頸癌患者。在過去的50年內(nèi)，幾乎沒有什么改進(jìn)。二、傳統(tǒng)子宮頸癌篩查方法假陰性(1.5-55%)

子宮頸發(fā)生病變，但病變細(xì)胞未在玻片上被發(fā)現(xiàn)。不確定性(5-20%)

不明確的結(jié)果。假陽(yáng)性(SIL-鱗狀上皮內(nèi)瘤變)(5-10%)

細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為異常，但子宮頸并未發(fā)生病變。(一)、巴氏涂片的局限：克服樣本制備的問題更有效的特制取樣器保留了幾乎所有的細(xì)胞過濾膜及微電腦控制制片，標(biāo)本具有代表性及時(shí)的濕固定處理克服了讀片的問題超薄，一致的細(xì)胞層大幅度降低不滿意標(biāo)本數(shù)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)更加清晰傳統(tǒng)涂片TCT涂片同一病人標(biāo)本，均為顯微鏡下放大40倍三、TCT傳統(tǒng)涂片TCT(一)、TCT與巴氏涂片的對(duì)比：

步驟一：采樣

暴露宮頸口，用棉簽將宮頸口及宮頸管內(nèi)的分泌物輕輕粘掉，不能用力擦；將掃帚狀采樣器的中央刷毛部分輕輕地深插入子宮頸的通道內(nèi)，以便較短的刷毛能夠完全接觸到外子宮頸，柔和地向前抵住采樣器，并按同一個(gè)時(shí)針方向轉(zhuǎn)動(dòng)掃帚狀采樣器5-10周整，從子宮頸上采取足夠數(shù)量的細(xì)胞樣本；切勿來回轉(zhuǎn)動(dòng)。(二)、TCT檢查標(biāo)本采集方法：步驟二：漂洗

在裝有TCT保存液的小瓶?jī)?nèi)漂洗掃帚狀采樣器。上下反復(fù)地將掃帚狀采樣器推入瓶底，迫使刷毛全部分散開來，共10次；最后，在溶液中快速地轉(zhuǎn)動(dòng)掃帚狀采樣器以進(jìn)一步的將細(xì)胞樣本保存下來，然后將采樣器扔掉。

步驟三：存放

擰緊瓶蓋，直到瓶蓋上的扭矩標(biāo)志線越過瓶上的扭矩標(biāo)志線為止；將患者的姓名寫在瓶上空白標(biāo)簽處，詳細(xì)填寫液基薄層細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)申請(qǐng)單，貼條形碼，并在標(biāo)本瓶上貼與其相應(yīng)的條形碼；將樣本保存瓶和檢驗(yàn)申請(qǐng)單分別裝入自封袋后再裝入同一自封袋內(nèi)，送至醫(yī)院檢驗(yàn)科等待艾迪康工作人員接收。全自動(dòng)化微電腦處理精確過濾膜有效的去除血液、黏液及非診斷性雜質(zhì)1.細(xì)胞分散2.細(xì)胞采集3.細(xì)胞轉(zhuǎn)移在診所在實(shí)驗(yàn)室將細(xì)胞涮到保存液中1232cm(三)、TCT檢查制備步驟：一個(gè)重要的轉(zhuǎn)變 1、采樣應(yīng)在非月經(jīng)期進(jìn)性2、采樣前24h內(nèi)不做陰道沖洗，不使用陰道內(nèi)用藥物3、采樣前24h內(nèi)不要行性生活(四)、TCT檢查制備注意事項(xiàng)：

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染色體核型分析通過對(duì)染色體核型的分析，在細(xì)胞水平上對(duì)疾病進(jìn)行診斷－－細(xì)胞遺傳學(xué)

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利用PHA（植物血凝素）刺激成熟的淋巴細(xì)胞再次分裂；利用秋水仙素在細(xì)胞分裂中期破壞紡錘絲，抑制細(xì)胞分裂，形成染色體的形態(tài)；通過胰酶消化或緩沖液作用，將染色體顯帶，通過帶紋和數(shù)目的分析判斷染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的情況。(一)、染色體核型分析的原理：染色體（chromosome)是遺傳信息的載體，由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成。人類具有23對(duì)染色體，其中1對(duì)性染色體，X,Y，22對(duì)常染色體。正常女性的染色體核型為：46,XX正常男性的染色體核型為：46,XY(二)、染色體與常見染色體病：

染色體各級(jí)結(jié)構(gòu)圖解DNA大分子形成核小體長(zhǎng)度縮小7倍形成螺線管縮短6倍形成超螺線管再縮短40倍形成染色單體時(shí)縮短5倍共縮短7x6x40x5＝8400倍從幾厘米長(zhǎng)縮短到幾微米長(zhǎng)不平衡易位通常引起嚴(yán)重的疾患而夭折。平衡易位由于大都沒有遺傳物質(zhì)的丟失，所以，本人雖不表現(xiàn)疾患，但其生育染色體異?；颊叩母怕矢哌_(dá)50-100％，給后代帶來嚴(yán)重的后果。