基因工程載體XXXX課件

第四章基因工程載體

§1概述§2克隆載體§3

大腸桿菌表達(dá)載體第四章基因工程載體§1概述1第一節(jié)概述載體（vector）是指將外源DNA或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。按功能:克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體。

克隆載體（cloningvector）：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；第一節(jié)概述載體（vector）是指將外源DNA或基因攜帶2按工作方式:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等。按受體細(xì)胞:原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體。按工作方式:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等3載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。載體的功能4第二節(jié)克隆載體克隆載體(cloningvector)：是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而設(shè)計(jì)的載體?？寺≥d體的結(jié)構(gòu)特征多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr第二節(jié)克隆載體多克隆位點(diǎn)(multiplecloning5克隆載體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。②載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。③載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。④載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞?？寺≥d體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受6⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。⑥載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。⑦載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。⑧載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。7一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體,主要用于原核生物和動(dòng)植物的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載81.質(zhì)粒(plasmid)的概念：獨(dú)立于染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制的雙鏈DNA分子。天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀(cccDNA)、開環(huán)(ocDNA)和線性(lDNA)構(gòu)型。

Plasmidchromosome

ccc1.質(zhì)粒(plasmid)的概念：

92.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài),但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。(2)質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后,可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。2.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染10(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個(gè)宿主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)少，為1-5個(gè))與松弛型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝)。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。(4)質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)：兩種不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。(親緣關(guān)系密切的,野生型和其衍生質(zhì)粒。)(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個(gè)宿113.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量(降低載體長(zhǎng)度)，建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因,如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。3.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重124.標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：選擇標(biāo)記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標(biāo)記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。4.標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：134.1選擇標(biāo)記基因4.1選擇標(biāo)記基因144.2篩選標(biāo)記基因(1)α-互補(bǔ)(α-complementation)是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，從而產(chǎn)生具有β-半乳糖苷酶學(xué)活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為α-互補(bǔ)。4.2篩選標(biāo)記基因(1)α-互補(bǔ)(α-complement15基因工程載體XXXX課件16

(2)插入失活(insertionalinactivation)

在質(zhì)粒pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個(gè)外源基因后，導(dǎo)致抗四環(huán)素基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性，這樣就可通過對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩選方法稱為插入失活。

(2)插入失活(insertionalinactiva17抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)

抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)185常用質(zhì)?？寺≥d體5常用質(zhì)?？寺≥d體195.1pSC101質(zhì)粒載體

一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、PvuⅡ、SmaⅠ7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會(huì)導(dǎo)致tetr基因失活。是第一個(gè)真核生物的克隆載體。5.1pSC101質(zhì)粒載體20基因工程載體XXXX課件21pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成。可見其原型質(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。

5.2pBR322pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序22“pBR322”這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示最初構(gòu)建它的實(shí)驗(yàn)室(BR代表了兩個(gè)構(gòu)建人的名字：Bolivar和Rodriguez)“322"把該質(zhì)粒和該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開來(另外還有pBR325，pBR327，pBR328“pBR322”這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：23基因工程載體XXXX課件24pBR322的結(jié)構(gòu)來源pBR322的結(jié)構(gòu)來源25pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：(1)、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp。意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNA分子。即使添加上6kb的DNA鏈，重組的pBR322的大小仍在可操作的范圍內(nèi)(＜10kb)。(2)、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：26pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)27基因工程載體XXXX課件28基因工程載體XXXX課件29(3)、具有較高的拷貝數(shù)。

通常在被轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌中有大約15個(gè)pBR322質(zhì)粒分子；而且經(jīng)過蛋白質(zhì)合成抑制劑（氯霉素?cái)U(kuò)增）之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝，這樣，通過培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過的pBR322質(zhì)粒分子。(3)、具有較高的拷貝數(shù)。305.3pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的，其組成如下：含有pBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。含有大腸桿菌-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。5.3pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的31基因工程載體XXXX課件32基因工程載體XXXX課件33pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體,有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：345.4T-載體5.4T-載體35基因工程載體XXXX課件366質(zhì)?？寺≥d體的用途

用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb的目的基因。構(gòu)建基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。可用于目的基因的測(cè)序。作為核酸雜交時(shí)探針的來源。6質(zhì)?？寺≥d體的用途用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb的目的37二、λ噬菌體載體

噬菌體的研究歷史，是同分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展過程密切相關(guān)的。DNA復(fù)制機(jī)理的闡明、轉(zhuǎn)錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發(fā)現(xiàn)、位點(diǎn)特異的重組作用、SOS修復(fù)機(jī)制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。依據(jù)噬菌體的復(fù)制和生活周期等特點(diǎn)，已經(jīng)構(gòu)建了許多噬菌體載體，并廣泛用于基因克隆、基因文庫(kù)的構(gòu)建等，是基因工程中不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。

二、λ噬菌體載體噬菌體的研究歷史，是同分38

噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一39λ噬菌體侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖。λ噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，在1個(gè)菌體內(nèi)生長(zhǎng)出100個(gè)左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原。λ噬菌體侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、40λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細(xì)菌-獨(dú)立復(fù)制-裂解（沖破細(xì)胞膜）-再感染其他細(xì)菌。

λ噬菌體的生活周期：41λ噬菌體的生活周期：

λ噬菌體的生活周期：42λ噬菌體整個(gè)基因組分3部分:①左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長(zhǎng)約20kb,是λDNA整合和切出,溶原生長(zhǎng)所需序列。③右臂：長(zhǎng)約10kb,是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來說，中段是非必需的。這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)。λ噬菌體整個(gè)基因組分3部分:43基因工程載體XXXX課件44λ噬菌體DNA的兩個(gè)5′末端為12bp的單鏈，兩端序列互補(bǔ)成為天然的“粘性末端”。λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主菌體后，通過兩個(gè)末端互補(bǔ)結(jié)合而形成粘性末端位點(diǎn)（cohesiveendsite，即粘性末端位點(diǎn)之意,簡(jiǎn)稱cos位點(diǎn)）整個(gè)DNA分子環(huán)化。λ噬菌體DNA的兩個(gè)5′末端為12bp的單鏈，兩端序列45 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’Theph461λ-DNA載體的構(gòu)建1.1縮短長(zhǎng)度

野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。1λ-DNA載體的構(gòu)建471.2刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)；同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)；除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。1.2刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ481.3加裝選擇標(biāo)記

與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是λ-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容λ-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記1.3加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型49(1)加裝選擇標(biāo)記imm434

imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。(1)加裝選擇標(biāo)記imm434imm450(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ

lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。(2)加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因511.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λ-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λ-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。1.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體琥521.5λ-DNA重組分子的體外包裝λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。以感染方式導(dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~105/μgDNA。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，只有這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。1.5λ-DNA重組分子的體外包裝53基因工程載體XXXX課件541.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放λ-DNA乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA1.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥552λ-DNA載體的主要類型：插入型載體（insertionvector）:

通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。Charon2、Charon6、λgt11置換型載體(replacementvector,又稱取代型載體):允許外源DNA片段替換非必需DNA片段的載體。λEMBL4、Λgem-11、Charon402λ-DNA載體的主要類型：插入型載體（insertio56基因工程載體XXXX課件57基因工程載體XXXX課件583λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因3λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體59三、人工染色體載體人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。三、人工染色體載體人工染色體載體（artificialch60這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)入高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點(diǎn)是能容納長(zhǎng)達(dá)1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)入高拷貝復(fù)611.酵母人造染色體(YeastArtificialChromosomesYAC)YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb1.酵母人造染色體(YeastArtificialChr62基因工程載體XXXX課件63基因工程載體XXXX課件642.細(xì)菌人造染色體(BacterialArtificialChromosomesBAC)

細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝,BACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)2.細(xì)菌人造染色體(BacterialArtificial65第三節(jié)大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)載體(expressionvector)：在克隆載體基礎(chǔ)上，為使插入的外源DNA片段有效轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽，裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子以及利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離和純化的元件，這種載體稱為表達(dá)載體。第三節(jié)大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)載體(expression66原核表達(dá)載體1.原核表達(dá)載體所需的主要元件(1)啟動(dòng)子；(2)SD順序;(3)篩選標(biāo)記；(4)其它調(diào)控基因(5)終止子(6)復(fù)制原點(diǎn)(7)MCS原核表達(dá)載體67

2.原核表達(dá)載體的類型(1)融合型表達(dá)載體——表達(dá)出融合蛋白；(2)非融合型表達(dá)載體——表達(dá)出完整蛋白；(3)分泌型表達(dá)載體——表達(dá)產(chǎn)物可跨膜分泌到胞間隙。2.原核表達(dá)載體的類型68(1)、融合表達(dá)載體融合基因(fusiongene):是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù),構(gòu)建的一類含兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因序列的雜合基因。融合蛋白(fusionprotein):是指通過將兩個(gè)或多個(gè)基因的開放閱讀框按一定順序連接在一起并通過表達(dá)而形成的雜合蛋白。開放閱讀框(openreadingframe，ORF)：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域，是潛在的編碼區(qū)。(1)、融合表達(dá)載體69融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合70基因工程載體XXXX課件71(2)非融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA(2)非融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體PSDForeign72(3)、分泌型表達(dá)載體將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)或直接分泌到培養(yǎng)基中，避免細(xì)胞內(nèi)的水解酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解。具備的3個(gè)要素：一是有一段信號(hào)肽，二是在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)有適當(dāng)?shù)呐c分泌相關(guān)的氨基酸序列，三是細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。(3)、分泌型表達(dá)載體將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到大腸桿菌細(xì)胞的73分泌型表達(dá)載體PSD融合型表達(dá)載體融合基因ForeignDNAIPP分泌型表達(dá)載體PSD融合型表達(dá)載體融合基因ForeignD743、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體穿梭載體：能夠在兩類不同宿主細(xì)胞中復(fù)制、增殖和選擇的質(zhì)載體，裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子和篩選標(biāo)記基因，便于基因克隆。3、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體穿梭載體：能夠在兩類不同宿主細(xì)75大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有兩種分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)與選擇標(biāo)記，可單獨(dú)或同時(shí)在兩種寄主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它調(diào)節(jié)功能。MCS大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有兩種分別來自大腸桿菌和釀76本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、質(zhì)粒的拷貝數(shù)、質(zhì)粒的不相容性、α-互補(bǔ)、插入失活、人工染色體載體、融合基因、融合蛋白、開放閱讀框架的概念?？寺≥d體DNA分子具備的條件。標(biāo)記基因的分類及其作用。抗生素選擇標(biāo)記基因的作用方式及其機(jī)理。pUC18/19質(zhì)粒載體的組成、結(jié)構(gòu)圖、優(yōu)點(diǎn)及質(zhì)?？寺≥d體用途。λ-DNA載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌基因表達(dá)載體的組成基因元件及常見表達(dá)系統(tǒng)。本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)77第四章基因工程載體

§1概述§2克隆載體§3

大腸桿菌表達(dá)載體第四章基因工程載體§1概述78第一節(jié)概述載體（vector）是指將外源DNA或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。按功能:克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體。

克隆載體（cloningvector）：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；第一節(jié)概述載體（vector）是指將外源DNA或基因攜帶79按工作方式:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等。按受體細(xì)胞:原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體。按工作方式:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等80載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。載體的功能81第二節(jié)克隆載體克隆載體(cloningvector)：是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而設(shè)計(jì)的載體。克隆載體的結(jié)構(gòu)特征多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr第二節(jié)克隆載體多克隆位點(diǎn)(multiplecloning82克隆載體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。②載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。③載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。④載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞?？寺≥d體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受83⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。⑥載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。⑦載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。⑧載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。84一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體,主要用于原核生物和動(dòng)植物的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載851.質(zhì)粒(plasmid)的概念：獨(dú)立于染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制的雙鏈DNA分子。天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀(cccDNA)、開環(huán)(ocDNA)和線性(lDNA)構(gòu)型。

Plasmidchromosome

ccc1.質(zhì)粒(plasmid)的概念：

862.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài),但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。(2)質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后,可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。2.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染87(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個(gè)宿主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)少，為1-5個(gè))與松弛型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝)。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。(4)質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)：兩種不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。(親緣關(guān)系密切的,野生型和其衍生質(zhì)粒。)(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個(gè)宿883.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量(降低載體長(zhǎng)度)，建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因,如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。3.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重894.標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：選擇標(biāo)記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標(biāo)記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。4.標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：904.1選擇標(biāo)記基因4.1選擇標(biāo)記基因914.2篩選標(biāo)記基因(1)α-互補(bǔ)(α-complementation)是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，從而產(chǎn)生具有β-半乳糖苷酶學(xué)活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為α-互補(bǔ)。4.2篩選標(biāo)記基因(1)α-互補(bǔ)(α-complement92基因工程載體XXXX課件93

(2)插入失活(insertionalinactivation)

在質(zhì)粒pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個(gè)外源基因后，導(dǎo)致抗四環(huán)素基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性，這樣就可通過對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩選方法稱為插入失活。

(2)插入失活(insertionalinactiva94抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)

抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)955常用質(zhì)?？寺≥d體5常用質(zhì)粒克隆載體965.1pSC101質(zhì)粒載體

一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、PvuⅡ、SmaⅠ7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會(huì)導(dǎo)致tetr基因失活。是第一個(gè)真核生物的克隆載體。5.1pSC101質(zhì)粒載體97基因工程載體XXXX課件98pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。

5.2pBR322pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序99“pBR322”這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示最初構(gòu)建它的實(shí)驗(yàn)室(BR代表了兩個(gè)構(gòu)建人的名字：Bolivar和Rodriguez)“322"把該質(zhì)粒和該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開來(另外還有pBR325，pBR327，pBR328“pBR322”這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：100基因工程載體XXXX課件101pBR322的結(jié)構(gòu)來源pBR322的結(jié)構(gòu)來源102pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：(1)、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp。意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNA分子。即使添加上6kb的DNA鏈，重組的pBR322的大小仍在可操作的范圍內(nèi)(＜10kb)。(2)、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：103pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)104基因工程載體XXXX課件105基因工程載體XXXX課件106(3)、具有較高的拷貝數(shù)。

通常在被轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌中有大約15個(gè)pBR322質(zhì)粒分子；而且經(jīng)過蛋白質(zhì)合成抑制劑（氯霉素?cái)U(kuò)增）之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝，這樣，通過培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過的pBR322質(zhì)粒分子。(3)、具有較高的拷貝數(shù)。1075.3pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的，其組成如下：含有pBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。含有大腸桿菌-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。5.3pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的108基因工程載體XXXX課件109基因工程載體XXXX課件110pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體,有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：1115.4T-載體5.4T-載體112基因工程載體XXXX課件1136質(zhì)?？寺≥d體的用途

用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb的目的基因。構(gòu)建基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。可用于目的基因的測(cè)序。作為核酸雜交時(shí)探針的來源。6質(zhì)?？寺≥d體的用途用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb的目的114二、λ噬菌體載體

噬菌體的研究歷史，是同分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展過程密切相關(guān)的。DNA復(fù)制機(jī)理的闡明、轉(zhuǎn)錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發(fā)現(xiàn)、位點(diǎn)特異的重組作用、SOS修復(fù)機(jī)制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。依據(jù)噬菌體的復(fù)制和生活周期等特點(diǎn)，已經(jīng)構(gòu)建了許多噬菌體載體，并廣泛用于基因克隆、基因文庫(kù)的構(gòu)建等，是基因工程中不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。

二、λ噬菌體載體噬菌體的研究歷史，是同分115

噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一116λ噬菌體侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖。λ噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，在1個(gè)菌體內(nèi)生長(zhǎng)出100個(gè)左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原。λ噬菌體侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、117λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細(xì)菌-獨(dú)立復(fù)制-裂解（沖破細(xì)胞膜）-再感染其他細(xì)菌。

λ噬菌體的生活周期：118λ噬菌體的生活周期：

λ噬菌體的生活周期：119λ噬菌體整個(gè)基因組分3部分:①左臂：從A到J長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長(zhǎng)約20kb,是λDNA整合和切出,溶原生長(zhǎng)所需序列。③右臂：長(zhǎng)約10kb,是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來說，中段是非必需的。這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)。λ噬菌體整個(gè)基因組分3部分:120基因工程載體XXXX課件121λ噬菌體DNA的兩個(gè)5′末端為12bp的單鏈，兩端序列互補(bǔ)成為天然的“粘性末端”。λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主菌體后，通過兩個(gè)末端互補(bǔ)結(jié)合而形成粘性末端位點(diǎn)（cohesiveendsite，即粘性末端位點(diǎn)之意,簡(jiǎn)稱cos位點(diǎn)）整個(gè)DNA分子環(huán)化。λ噬菌體DNA的兩個(gè)5′末端為12bp的單鏈，兩端序列122 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’Theph1231λ-DNA載體的構(gòu)建1.1縮短長(zhǎng)度

野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。1λ-DNA載體的構(gòu)建1241.2刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)；同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)；除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。1.2刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ1251.3加裝選擇標(biāo)記

與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是λ-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容λ-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記1.3加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型126(1)加裝選擇標(biāo)記imm434

imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。(1)加裝選擇標(biāo)記imm434imm4127(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ

lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。(2)加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因1281.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λ-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λ-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。1.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體琥1291.5λ-DNA重組分子的體外包裝λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。以感染方式導(dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~105/μgDNA。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，只有這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。1.5λ-DNA重組分子的體外包裝130基因工程載體XXXX課件1311.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放λ-DNA乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA1.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥1322λ-DNA載體的主要類型：插入型載體（insertionvector）:

通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。Charon2、Charon6、λgt11置換型載體(replacementvector,又稱取代型載體):允許外源DNA片段替換非必需DNA片段的載體。λEMBL4、Λgem-11、Charon402λ-DNA載體的主要類型：插入型載體（insertio133基因工程載體XXXX課件134基因工程載體XXXX課件1353λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因3λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體136三、人工染色體載體人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。三、人工染色體載體人工染色體載體（artificialch137這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)入高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA