基因工程第三章2-Jun-finalversion課件

CloningVectors第三章基因工程載體CloningVectors第三章基因工程載體1第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質(zhì)粒載體

第二節(jié)

噬菌體載體

第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質(zhì)粒載體2第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性二、λ噬菌體載體三、粘性質(zhì)粒四、單鏈DNA噬菌體載體第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性3一、噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。一、噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微4噬菌體的結(jié)構(gòu)噬菌體的結(jié)構(gòu)5基因工程第三章2-Jun-finalversion課件6烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細(xì)菌溶源化原噬菌體烈性噬菌體7噬菌體的侵染與包裝噬菌體的侵染與包裝8二、λ噬菌體載體二、λ噬菌體載體9λ噬菌體的電子顯微鏡照片λ噬菌體的電子顯微鏡照片10a)在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編碼50多個(gè)基因，在兩端各有12個(gè)堿基組成的5’單鏈互補(bǔ)粘性末端(Cohesiveend),進(jìn)入宿主細(xì)胞后,粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點(diǎn))，是包裝的必需DNA序列．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因組DNA上有56種限制酶識(shí)別位點(diǎn)．1.λ基因組DNA的特點(diǎn)（一）λDNA分子a)在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編11基因工程第三章2-Jun-finalversion課件12λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個(gè)基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和NCI基因，O-R為裂解區(qū).λ噬菌體的基因組圖及EcoRI酶切圖2.λ基因組DNA的結(jié)構(gòu)λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：λ噬菌體的基因組13A：成熟包被，切開cos環(huán)，D,E：(占頭蛋白75%)W,F：頭尾連接Int(整合),Xis(刪除),Red促重組N(早期調(diào)控)促O,P(復(fù)制).Red,Xis,Int轉(zhuǎn)錄和整合。Q(晚期調(diào)控)促頭,尾,S,R基因表達(dá)和溶菌CI,CII,CIII為負(fù)調(diào)控，阻止溶菌環(huán)化后的λ基因組DNAA：成熟包被，切開cos環(huán)，環(huán)化后的λ基因組DNA14人為將λ噬菌體基因組分為3個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個(gè)區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動(dòng)。中間區(qū)包含重組基因和整合切割基因。右側(cè)區(qū)：位于N基因的右側(cè)，包含全部的主要調(diào)節(jié)基因及復(fù)制基因和裂解基因。人為將λ噬菌體基因組分為3個(gè)區(qū)域：15裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復(fù)制，復(fù)制起點(diǎn)位于O基因內(nèi)，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復(fù)制的開關(guān)被啟動(dòng)，復(fù)制從θ型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點(diǎn)是λ噬菌體正確包裝的必需位點(diǎn)。3.λDNA的復(fù)制裂解周期3.λDNA的復(fù)制16λ噬菌體DNA的復(fù)制λ噬菌體DNA的復(fù)制17溶原性周期λDNA復(fù)制以另外一種形式進(jìn)行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復(fù)制。cI基因表達(dá)，合成參與溶菌周期活動(dòng)的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。附著位點(diǎn)att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達(dá)，是一種可逆的過程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離宿主染色體，重新變成獨(dú)立的復(fù)制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)。溶原性周期184.λ噬菌體的組裝4.λ噬菌體的組裝191.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。包裝限制:λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有與λ裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。（二）λ噬菌體載體的構(gòu)建1.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因（二）20基因工程第三章2-Jun-finalversion課件212.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非必需區(qū)段切除必需的的RE識(shí)別位點(diǎn)，在非必需區(qū)引入合適的RE識(shí)別位點(diǎn)引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因以便重組子的篩選建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，通過無意義突變將其改造成安全載體，以利于生物學(xué)防護(hù)。2.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非221)除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)天然的λ-DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：EcoRI5個(gè)，HindIII7個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點(diǎn)缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個(gè)產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的λDNA分子會(huì)被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點(diǎn)缺失了。2.λ噬菌體的改造1)除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)2.λ噬菌體的改造23通過自然選擇法篩選無EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的λ-噬菌體通過自然選擇法篩選無EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的λ-噬菌體242)切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長(zhǎng)，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)14kb長(zhǎng)的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去2.λ噬菌體的改造2)切除掉λDNA的非必需區(qū)2.λ噬菌體的改造253)引入無義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λDNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λDNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。2.λ噬菌體的改造3)引入無義突變2.λ噬菌體的改造263.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.43.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)27插入型載體只具有一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內(nèi)外源DNA片斷替換型載體(取代型載體)具有兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點(diǎn)，即可用作插入型又可用作取代型4.λ噬菌體載體的類型插入型載體4.λ噬菌體載體的類型28體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段2943.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kbAJLacZ免疫功能失活插入型載體若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑β－半乳糖苷酶失活插入型載體若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍(lán)斑根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型：插入型載體的篩選

λgt10λgt1143.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kb30基因工程第三章2-Jun-finalversion課件31不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標(biāo)記:imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標(biāo)記:32體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–33替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對(duì)的限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代cos位點(diǎn)cos位點(diǎn)置換區(qū)域左臂右臂替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對(duì)的限制酶34λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。應(yīng)用指示性培養(yǎng)基可對(duì)這種重組體方便的篩選出來。宿主含lacZ的琥珀突變?chǔ)薔M781由于λ噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因351.轉(zhuǎn)染作用轉(zhuǎn)染：由宿主細(xì)胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒等外源DNA引入細(xì)胞的過程。2.λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法（三）λ噬菌體載體的應(yīng)用1.轉(zhuǎn)染作用（三）λ噬菌體載體的應(yīng)用36包裝有限制，λφDNA全長(zhǎng)48kb，必需基因?yàn)?8kb,包裝外源基因限制全長(zhǎng)105-75％（即51－28＝23kb;36－28＝8kb）包裝限制范圍為8-23kb，一般包裝容量為15kb左右。λDNA的體外包裝包裝有限制，λφDNA全長(zhǎng)48kb，必需基因?yàn)?8kb,包37凱倫噬菌體載體(Charon)這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當(dāng)數(shù)量的限制酶切位點(diǎn)，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央?yún)^(qū)段）。插入基因經(jīng)包裝后，可通過藍(lán)/白斑篩選陽(yáng)性克隆。Charon載體的特點(diǎn)是容量大，對(duì)研究大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)很有用處。它承受外源DNA的能力為幾kb到23kb。當(dāng)與外殼蛋白體外包裝，形成噬菌體顆粒，其感染效率很高，幾乎為100%，遠(yuǎn)高于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率(0.1%)。（四）常用的λ噬菌體載體凱倫噬菌體載體(Charon)（四）常用的λ噬菌體載體38基因工程第三章2-Jun-finalversion課件39三、粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒是帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA序列的載體。三、粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒是帶有λ噬菌體的Cos位40粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。易環(huán)化和擴(kuò)增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫(kù)。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的λcos位點(diǎn)。1.粘性質(zhì)粒的組成及性質(zhì)粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)412.粘性質(zhì)粒的克隆無cos點(diǎn)，不包裝DNA小于包裝下線，不包裝2.粘性質(zhì)粒的克隆無cos點(diǎn)，不包裝DNA小于包裝下線，不42DigestionLigation（c）PackagingandinfectDigestionLigation（c）Packaging43λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載能力考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有λDNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體3.粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb44能像λDNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞4.粘性質(zhì)粒作為載體的優(yōu)點(diǎn)能像λDNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞4.粘性質(zhì)45M13單鏈DNA噬菌體為細(xì)線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀蛋白外殼中。四、單鏈DNA噬菌體載體1.M13噬菌體的生物學(xué)特性M13單鏈DNA噬菌體為細(xì)線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀462.M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)—9個(gè)基因，10種蛋白基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復(fù)制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNA2.M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)—9個(gè)基因，10種蛋白基因Ⅰ473.M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過程：ss（+）RF(0-1min)(復(fù)制型DNA,replicativeDNA)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)

DNA包裝無嚴(yán)格限制3.M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過程：48+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DN49基因工程第三章2-Jun-finalversion課件504.M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構(gòu)建主要是插入標(biāo)記基因如，lacZ、多克隆位點(diǎn)(polylinker)，消除多余的酶切位點(diǎn)。IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker4.M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)51在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點(diǎn)的的識(shí)別序列，在基因的起始端，加入含有6堿基的序列GAATTC，是一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，這是通過體外定點(diǎn)突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp2是最簡(jiǎn)單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點(diǎn)，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。M13載體的構(gòu)建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點(diǎn)和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點(diǎn)上，就產(chǎn)生了M13mp7。4.M13噬菌體載體的構(gòu)建在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以52基因工程第三章2-Jun-finalversion課件53基因工程第三章2-Jun-finalversion課件54基因工程第三章2-Jun-finalversion課件55CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19CoordinatesofM13mp18/19gene565.M13噬菌體載體的優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝容量M13DNA的6倍產(chǎn)生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子:M13噬菌體載體最大的優(yōu)點(diǎn)就是能使插入的外源DNA片段變成單鏈。測(cè)定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑5.M13噬菌體載體的優(yōu)越性57M13單鏈載體有多聚接頭，可進(jìn)行LacZ插入失活白斑篩選。可應(yīng)用于克隆基因，測(cè)序，基因突變的誘變技術(shù)。6.M13噬菌體載體的應(yīng)用M13單鏈載體有多聚接頭，可進(jìn)行LacZ插入失活白斑篩選。可58克隆克隆59第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體一、在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的載體（共同特點(diǎn)）1.整合型載體（YIP）2.復(fù)制型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質(zhì)粒三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體一、在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的60在酵母細(xì)胞中常用的載體的共同特點(diǎn)酵母細(xì)胞的載體，它們共同的特點(diǎn)是：（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。這些標(biāo)記一般能和大腸桿菌相應(yīng)的突變體互補(bǔ)，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；（3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。酵母是單細(xì)胞真核生物，可接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在酵母細(xì)胞中常用的載體的共同特點(diǎn)酵母細(xì)胞的載體，它們共同的特61整合型附加體型復(fù)制型根據(jù)復(fù)制方式不同，載體分為三種類型整合型附加體型復(fù)制型根據(jù)復(fù)制方式不同，載體分為三種類型62整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。如Pyeleu10是由ColEI質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵63復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），穿梭載體在基因工程中廣泛使用。復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制64優(yōu)點(diǎn):YRP對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化率極高(102-103轉(zhuǎn)化子/ugDNA)，拷貝數(shù)也高。以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子形式存在，易從酵母中提取。缺點(diǎn):在受體細(xì)胞中不穩(wěn)定，易丟失。穿梭模式優(yōu)點(diǎn):YRP對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化率極高(102-103轉(zhuǎn)化子/u65附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒、2μm質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2μm質(zhì)粒是釀酒酵母中含有的長(zhǎng)度為2μm的內(nèi)源質(zhì)粒。2μm質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū),STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。利用2μm質(zhì)粒，人們已經(jīng)構(gòu)建出許多YEP型載體，比如YEP型載體PYF92。附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒66YEP型載體PYF92由酵母的2μm質(zhì)粒、pBR322質(zhì)粒和酵母的His3+(組氨酸)基因構(gòu)成。YEP型載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性，一般為103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA。比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也高（25-100個(gè)/細(xì)胞），是基因克隆中的常用載體。YEP型載體PYF92由酵母的2μm質(zhì)粒、pBR322質(zhì)67三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體㈠SV40病毒㈡SV40病毒載體(1)取代型重組病毒載體①晚期區(qū)段取代載體②早期區(qū)段取代載體(2)重組的病毒-質(zhì)粒載體三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體㈠SV40病毒68猿猴空泡病毒(SV40病毒)SV40病毒呈小型20面體，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，5.2kb，序列已知。外殼蛋白由VP1、VP2、VP3構(gòu)成。受納細(xì)胞（permissivecell）：感染病毒后能使細(xì)胞裂解釋放感染性病毒顆粒。非受納細(xì)胞（nonpermissivecell）：感染病毒后不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，但能整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變。人體細(xì)胞是半受納細(xì)胞，處于二者之間。猿猴空泡病毒(SV40病毒)SV40病毒呈小型20面體，共69早期表達(dá)區(qū)編碼大T抗原和小t抗原（即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因組的復(fù)制和調(diào)節(jié)。小t抗原的功能不詳。晚期表達(dá)區(qū)合成Vp1、Vp2、Vp3，包裝釋放。SV40的基因結(jié)構(gòu)在非受納細(xì)胞中，感染的病毒只有早期基因區(qū)段表達(dá)。病毒的基因組隨后就整合到宿主的染色體基因組上。這種整合作用是隨機(jī)的。早期表達(dá)區(qū)編碼大T抗原和小t抗原（即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）。70優(yōu)點(diǎn):感染率高，幾乎100％寄主細(xì)胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建原因：包裝范圍嚴(yán)格，超過基因組大小的(5.2kb)的重組DNA就不能被被包裝。宿主細(xì)胞范圍小，只能在受納細(xì)胞中增殖，最終導(dǎo)致寄主細(xì)胞裂解死亡，不能長(zhǎng)期培養(yǎng)。SV-40的衍生物作為載體的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):SV-40的衍生物作為載體的優(yōu)缺點(diǎn)71(1)取代型重組病毒載體取代型的重組病毒載體（recombinantVirusVector）,其特點(diǎn)是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源DNA片段的大小和被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補(bǔ)充被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)的輔助病毒。(1)取代型重組病毒載體取代型的重組病毒載體（recomb72①晚期區(qū)段取代載體SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去合成外殼蛋白功能，若加入一種溫度敏感（ts）的輔助病毒tsA58（它是一種在41℃下便不能合成T抗原的突變體），與缺乏了整個(gè)晚期區(qū)段功能的SV40病毒，可以互補(bǔ)，這兩種病毒混合感染時(shí)，仍然能夠增殖。重組體病毒能提供此種T抗原，tsA58則可以復(fù)制，并合成出外殼蛋白質(zhì)，這樣就能在受納細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)。①晚期區(qū)段取代載體SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去73大鼠前胰島素原基因在猿猴細(xì)胞中的重組表達(dá)大鼠前胰島素原基因在猿猴細(xì)胞中的重組表達(dá)74②早期區(qū)段取代載體這種載體被外源基因取代早期基因而缺失大T抗原。COS細(xì)胞可以提供大T抗原，因此重組病毒在COS細(xì)胞中能夠增殖和擴(kuò)增。②早期區(qū)段取代載體這種載體被外源基因取代早期基因而缺失大T75(2)重組的病毒-質(zhì)粒載體含有完整早期區(qū)段的復(fù)制起點(diǎn)的病毒-質(zhì)粒載體:由病毒的早期區(qū)段的復(fù)制點(diǎn)和大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成。這類質(zhì)粒既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，所以也叫穿梭載體，如pAC10。分兩種類型:a.穿梭載體b.微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體(2)重組的病毒-質(zhì)粒載體含有完整早期區(qū)段的復(fù)制起點(diǎn)的病毒76

穿梭載體:pAC10載體由大T抗原、復(fù)制子和pBR322構(gòu)成，既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。在細(xì)菌中擴(kuò)增提取基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞5-6天后可高拷貝擴(kuò)增、進(jìn)而高表達(dá)基因產(chǎn)物。穿梭載體:pAC10載體由大T抗原、復(fù)制子和pBR3277微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體:可用特殊細(xì)胞來克隆和表達(dá)，構(gòu)建很簡(jiǎn)單，將SV40復(fù)制起點(diǎn)片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒載體上。這種載體只能在持久的表達(dá)病毒T抗原的特殊細(xì)胞系使用，比如Cos細(xì)胞，HFs細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的任何大小的環(huán)形DNA，都能像質(zhì)粒一樣進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制。微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體:可用特殊細(xì)胞來克隆和表達(dá)，構(gòu)78CloningVectors第三章基因工程載體CloningVectors第三章基因工程載體79第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質(zhì)粒載體

第二節(jié)

噬菌體載體

第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質(zhì)粒載體80第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性二、λ噬菌體載體三、粘性質(zhì)粒四、單鏈DNA噬菌體載體第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性81一、噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。一、噬菌體的一般生物學(xué)特性噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微82噬菌體的結(jié)構(gòu)噬菌體的結(jié)構(gòu)83基因工程第三章2-Jun-finalversion課件84烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細(xì)菌溶源化原噬菌體烈性噬菌體85噬菌體的侵染與包裝噬菌體的侵染與包裝86二、λ噬菌體載體二、λ噬菌體載體87λ噬菌體的電子顯微鏡照片λ噬菌體的電子顯微鏡照片88a)在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編碼50多個(gè)基因，在兩端各有12個(gè)堿基組成的5’單鏈互補(bǔ)粘性末端(Cohesiveend),進(jìn)入宿主細(xì)胞后,粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點(diǎn))，是包裝的必需DNA序列．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因組DNA上有56種限制酶識(shí)別位點(diǎn)．1.λ基因組DNA的特點(diǎn)（一）λDNA分子a)在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編89基因工程第三章2-Jun-finalversion課件90λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個(gè)基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和NCI基因，O-R為裂解區(qū).λ噬菌體的基因組圖及EcoRI酶切圖2.λ基因組DNA的結(jié)構(gòu)λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：λ噬菌體的基因組91A：成熟包被，切開cos環(huán)，D,E：(占頭蛋白75%)W,F：頭尾連接Int(整合),Xis(刪除),Red促重組N(早期調(diào)控)促O,P(復(fù)制).Red,Xis,Int轉(zhuǎn)錄和整合。Q(晚期調(diào)控)促頭,尾,S,R基因表達(dá)和溶菌CI,CII,CIII為負(fù)調(diào)控，阻止溶菌環(huán)化后的λ基因組DNAA：成熟包被，切開cos環(huán)，環(huán)化后的λ基因組DNA92人為將λ噬菌體基因組分為3個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個(gè)區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動(dòng)。中間區(qū)包含重組基因和整合切割基因。右側(cè)區(qū)：位于N基因的右側(cè)，包含全部的主要調(diào)節(jié)基因及復(fù)制基因和裂解基因。人為將λ噬菌體基因組分為3個(gè)區(qū)域：93裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復(fù)制，復(fù)制起點(diǎn)位于O基因內(nèi)，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復(fù)制的開關(guān)被啟動(dòng)，復(fù)制從θ型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點(diǎn)是λ噬菌體正確包裝的必需位點(diǎn)。3.λDNA的復(fù)制裂解周期3.λDNA的復(fù)制94λ噬菌體DNA的復(fù)制λ噬菌體DNA的復(fù)制95溶原性周期λDNA復(fù)制以另外一種形式進(jìn)行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復(fù)制。cI基因表達(dá)，合成參與溶菌周期活動(dòng)的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。附著位點(diǎn)att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達(dá)，是一種可逆的過程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離宿主染色體，重新變成獨(dú)立的復(fù)制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)。溶原性周期964.λ噬菌體的組裝4.λ噬菌體的組裝971.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。包裝限制:λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有與λ裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。（二）λ噬菌體載體的構(gòu)建1.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因（二）98基因工程第三章2-Jun-finalversion課件992.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非必需區(qū)段切除必需的的RE識(shí)別位點(diǎn)，在非必需區(qū)引入合適的RE識(shí)別位點(diǎn)引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記基因以便重組子的篩選建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，通過無意義突變將其改造成安全載體，以利于生物學(xué)防護(hù)。2.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非1001)除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)天然的λ-DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：EcoRI5個(gè)，HindIII7個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點(diǎn)缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個(gè)產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的λDNA分子會(huì)被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點(diǎn)缺失了。2.λ噬菌體的改造1)除去多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)2.λ噬菌體的改造101通過自然選擇法篩選無EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的λ-噬菌體通過自然選擇法篩選無EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的λ-噬菌體1022)切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長(zhǎng)，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)14kb長(zhǎng)的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去2.λ噬菌體的改造2)切除掉λDNA的非必需區(qū)2.λ噬菌體的改造1033)引入無義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λDNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λDNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。2.λ噬菌體的改造3)引入無義突變2.λ噬菌體的改造1043.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.43.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)105插入型載體只具有一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內(nèi)外源DNA片斷替換型載體(取代型載體)具有兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點(diǎn)，即可用作插入型又可用作取代型4.λ噬菌體載體的類型插入型載體4.λ噬菌體載體的類型106體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段10743.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kbAJLacZ免疫功能失活插入型載體若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑β－半乳糖苷酶失活插入型載體若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍(lán)斑根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型：插入型載體的篩選

λgt10λgt1143.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kb108基因工程第三章2-Jun-finalversion課件109不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標(biāo)記:imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標(biāo)記:110體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–111替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對(duì)的限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代cos位點(diǎn)cos位點(diǎn)置換區(qū)域左臂右臂替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對(duì)的限制酶112λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。應(yīng)用指示性培養(yǎng)基可對(duì)這種重組體方便的篩選出來。宿主含lacZ的琥珀突變?chǔ)薔M781由于λ噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因1131.轉(zhuǎn)染作用轉(zhuǎn)染：由宿主細(xì)胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒等外源DNA引入細(xì)胞的過程。2.λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法（三）λ噬菌體載體的應(yīng)用1.轉(zhuǎn)染作用（三）λ噬菌體載體的應(yīng)用114包裝有限制，λφDNA全長(zhǎng)48kb，必需基因?yàn)?8kb,包裝外源基因限制全長(zhǎng)105-75％（即51－28＝23kb;36－28＝8kb）包裝限制范圍為8-23kb，一般包裝容量為15kb左右。λDNA的體外包裝包裝有限制，λφDNA全長(zhǎng)48kb，必需基因?yàn)?8kb,包115凱倫噬菌體載體(Charon)這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當(dāng)數(shù)量的限制酶切位點(diǎn)，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央?yún)^(qū)段）。插入基因經(jīng)包裝后，可通過藍(lán)/白斑篩選陽(yáng)性克隆。Charon載體的特點(diǎn)是容量大，對(duì)研究大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)很有用處。它承受外源DNA的能力為幾kb到23kb。當(dāng)與外殼蛋白體外包裝，形成噬菌體顆粒，其感染效率很高，幾乎為100%，遠(yuǎn)高于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率(0.1%)。（四）常用的λ噬菌體載體凱倫噬菌體載體(Charon)（四）常用的λ噬菌體載體116基因工程第三章2-Jun-finalversion課件117三、粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒是帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA序列的載體。三、粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒是帶有λ噬菌體的Cos位118粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。易環(huán)化和擴(kuò)增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫(kù)。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的λcos位點(diǎn)。1.粘性質(zhì)粒的組成及性質(zhì)粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)1192.粘性質(zhì)粒的克隆無cos點(diǎn)，不包裝DNA小于包裝下線，不包裝2.粘性質(zhì)粒的克隆無cos點(diǎn)，不包裝DNA小于包裝下線，不120DigestionLigation（c）PackagingandinfectDigestionLigation（c）Packaging121λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載能力考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有λDNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體3.粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb122能像λDNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞4.粘性質(zhì)粒作為載體的優(yōu)點(diǎn)能像λDNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞4.粘性質(zhì)123M13單鏈DNA噬菌體為細(xì)線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀蛋白外殼中。四、單鏈DNA噬菌體載體1.M13噬菌體的生物學(xué)特性M13單鏈DNA噬菌體為細(xì)線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀1242.M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)—9個(gè)基因，10種蛋白基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復(fù)制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNA2.M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)—9個(gè)基因，10種蛋白基因Ⅰ1253.M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過程：ss（+）RF(0-1min)(復(fù)制型DNA,replicativeDNA)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)

DNA包裝無嚴(yán)格限制3.M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過程：126+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DN127基因工程第三章2-Jun-finalversion課件1284.M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構(gòu)建主要是插入標(biāo)記基因如，lacZ、多克隆位點(diǎn)(polylinker)，消除多余的酶切位點(diǎn)。IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker4.M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)129在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點(diǎn)的的識(shí)別序列，在基因的起始端，加入含有6堿基的序列GAATTC，是一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，這是通過體外定點(diǎn)突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp2是最簡(jiǎn)單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點(diǎn)，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。M13載體的構(gòu)建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點(diǎn)和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點(diǎn)上，就產(chǎn)生了M13mp7。4.M13噬菌體載體的構(gòu)建在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以130基因工程第三章2-Jun-finalversion課件131基因工程第三章2-Jun-finalversion課件132基因工程第三章2-Jun-finalversion課件133CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19CoordinatesofM13mp18/19gene1345.M13噬菌體載體的優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝容量M13DNA的6倍產(chǎn)生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子:M13噬菌體載體最大的優(yōu)點(diǎn)就是能使插入的外源DNA片段變成單鏈。測(cè)定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑5.M13噬菌體載體的優(yōu)越性135M13單鏈載體有多聚接頭，可進(jìn)行LacZ插入失活白斑篩選?？蓱?yīng)用于克隆基因，測(cè)序，基因突變的誘變技術(shù)。6.M13噬菌體載體的應(yīng)用M13單鏈載體有多聚接頭，可進(jìn)行LacZ插入失活白斑篩選。可136克隆克隆137第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體一、在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的載體（共同特點(diǎn)）1.整合型載體（YIP）2.復(fù)制型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質(zhì)粒三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體一、在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的138在酵母細(xì)胞中常用的載體的共同特點(diǎn)酵母細(xì)胞的載體，它們共同的特點(diǎn)是：（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。這些標(biāo)記一般能和大腸桿菌相應(yīng)的突變體互補(bǔ)，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；（3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。酵母是單細(xì)胞真核生物，可接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在酵母細(xì)胞中常用的載體的共同特點(diǎn)酵母細(xì)胞的載體，它們共同的特139整合型附加體型復(fù)制型根據(jù)復(fù)制方式不同，載體分為三種類型整合型附加體型復(fù)制型根據(jù)復(fù)制方式不同，載體分為三種類型140整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。如Pyeleu10是由ColEI質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵141復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），穿梭載體在基因工程中廣泛使用。復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)