生化實驗報告-DNA定量測定(二苯胺法)800字

生化實驗報告--DNA定量測定(二苯胺法)800字

DNA的定量測定-二苯胺法一、實驗目的1.學習和掌握用濃鹽法從動物肝臟中提取DNA的原理和方法；2.學習和掌握用二苯胺法測定DNA含量的原理和方法。二、實驗原理1．DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成ω-羥基-γ-酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍色化合物（λmax=595nm）。2．在DNA濃度為20-200μg/ml的范圍內(nèi)，吸光度與DNA濃度成正比，可用比色法測定。三、實驗儀器?試管?移液管?7220分光光度計四、實驗試劑1、DNA標準液（200ug/ml）：稱取10mgDNA鈉鹽溶于5mol/l氫氧化鈉溶液并稀釋至100ml。2、二苯胺試劑：A液：稱取純二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加濃硫酸1.5ml。貯于棕色瓶中。B液：稱取1.6ml乙醛溶于100ml蒸餾水中，臨用時配制臨用時，將20mlA液和0.1mlB液混合即可五、實驗驗步驟1.標準曲線的繪制加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長下測吸光度，以吸光度對DNA濃度作標準曲線。2.樣品測定吸取DNA樣液1.0ml，加入蒸餾水1.0ml，混勻。然后加入二苯胺溶液4.0ml,加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長下測吸光度，根據(jù)所測得的吸光度對照標準曲線求得DNA的質(zhì)量。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)制得標準曲線如下：由上表可知樣液的吸光度y=0.115，則由標準曲線得出DNA樣液的濃度x=18.49μg/ml。故樣品中DNA的質(zhì)量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、實驗分析1.測定DNA含量的方法還有哪些原理?熒光法，用PicoGreen熒光染料，測定DNA濃度比較靈敏，并且適合測量低濃度和微量DNA，并且受其它雜質(zhì)的影響不大，缺點要有專門的熒光檢測儀器，試劑比較昂貴。2.實驗中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的斷裂損傷,DNA在酸性條件下加熱，在反應液中加入少量乙醛,可以提高反應靈敏度.

第二篇：二苯胺法測定DNA含量1100字實驗12二苯胺法測定DNA含量一、目的學習和掌握測定DNA的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技術(shù)。二、原理脫氧核糖核酸中的α—脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成ω—羥基—γ酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣的反應。CH2C—CHCHO藍色化合物酸性條件二苯胺Oω—羥基—γ酮基戊醛三、材料、試劑和器具（一）試劑1、DNA標準溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氫氧化鈉溶液配制成200微克/毫升的溶液。2、DNA樣品液：（自己提?。┛刂破銬NA含量在50~100微克/毫升左右。3、二苯胺試劑：稱取1克結(jié)果的二苯胺試劑溶于100毫升分析純的冰醋酸中，再加入10毫升過氯酸（A.R60%以上）或濃硫酸2.75毫升，混勻備用。臨用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液應保存于冰箱，一周內(nèi)可使用）所配得的溶液應為無色。（二）器具1、試管及試管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒溫水浴4、可見光分光光度計四、操作步驟（一）DNA標準曲線的制作取8支試管，編號，按下表加入試劑==加畢，搖勻，于60℃恒溫水浴中保溫1小時，（或于沸水中煮沸15分鐘，冷卻測0.D595nm值。）以光密度為縱坐標，DNA含量（ug/ml）為橫坐標，繪制標準曲線。（二）樣品的測定取2支試管，各加0.2~0.5毫升的待測液（內(nèi)含DNA應在標準曲線可測范圍之內(nèi)）加蒸餾水稀釋至2毫升，再加4毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標準曲線的制作相同。根據(jù)測得的光密度值，從標準曲線上查出相當該光密度DNA的含量，按下式計算出樣品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待測液=標準曲線查得值×稀釋倍數(shù)DNA產(chǎn)率(%)?含量/毫升?總體積新鮮鮮肝(g)?106?100五、注意事項1、二茉胺法測定DNA含量靈敏度不高，待測樣品中DNA含量低于50mg/L即難以測定。乙醛可增加二苯胺法測定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測定的靈敏度。2、樣品中含有少量RNA并不影響測定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應形成有色化合物，故能干擾DNA定