薄層層析,顯色劑

薄層層析溶劑/展開劑/顯色劑的選擇配制及注意事項摘要：薄層色譜方法總結(jié)：使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4：1：1,V/V/V）,或者絕對量（如18ml甲苯+2ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復使用，如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用相關(guān)專題薄層層析（TLC）技術(shù)薄層色譜方法總結(jié)1■方法原理（1） 流動相利用毛細管力帶著樣品穿過固定相。（2） 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極-（誘導）-偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機理。2■溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4:1：1,V/V/V），或者絕對量（如18ml甲苯+2ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復使用，如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。一、 溶劑選擇規(guī)則：1、 考慮分離成分的極性、溶解度、吸附度。2、 先加入極性較小的溶劑，若不容再加入少量極性大的溶劑3、 一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶。4、 混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑。5、 展開劑的比例要靠嘗試■一般根據(jù)文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。6、 一般把兩種溶劑混合時，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開的跡象,再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑），達到最佳效果;如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。二、 展開劑的選擇條件：對的所需成分有良好的溶解性；②可使成分間分開；待測組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測定在0.3?0.5之間；不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學反應(yīng)；⑤沸點適中，黏度較??；⑥展開后組分斑點圓且集中；⑦混合溶劑最好用新鮮配制。三、 溶劑極性參數(shù)表環(huán)已烷：-0.2、石油醚（I類，30~60°C）、石油醚（II類，60~90°C）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯25、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫咲喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸60、水:10.21、一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入

甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；2、 中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于蔥醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；3、 強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。四、展開劑的選擇物質(zhì)分子化學結(jié)構(gòu)中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。以下分開討論不同化合物極性情況及其對應(yīng)的展開劑。1、 類極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)冰片：石油醚(30?60°C)—醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚：苯-醋酸乙酯(9:1.5)、a-香附酮：苯-醋酯乙酯-冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：環(huán)己烷-醋酸乙酯(3:1)，結(jié)論：以石油醚、正構(gòu)烷和苯為體積百分數(shù)比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而用醋酸乙酯為調(diào)節(jié)Rf(比移值)的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當加入添加劑，如有機酸或者有機堿。2、 類極性較小的不揮發(fā)性物質(zhì)P-谷甾醇：環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲醇(625:1)或者環(huán)己烷-丙酮(5:2)、熊果酸：甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、齊墩果酸：氯仿-甲醇(40:1)、豬去氧膽酸：氯仿-乙醚-冰醋酸(2:2:1)、大黃素：苯一醋酸乙酯一甲醇(15:2:0.2)或者苯一乙醇(8:1)、丹參酮IIA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、穿心蓮內(nèi)酯：氯仿-無水乙醇(9:1)靛玉紅、靛藍氯仿-乙醇(9:1)或者苯-氯仿-丙酮(5:4:1)結(jié)論：這類物質(zhì)展開劑極性比極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)洗脫力強一些，因為這類物質(zhì)極性小的母核大，而極性大的基團通?？梢孕纬蓺滏I，比如羧酸、羥基。以上物質(zhì)，母核分子量減小、母核結(jié)構(gòu)中不飽和健的增加(尤其是出現(xiàn)苯環(huán))，極性基團的增加，都使極性增加，展開劑極性也增大。。這個范圍內(nèi)的物質(zhì)很多，一般展開劑大百分數(shù)的溶劑可以從環(huán)己烷一〉甲苯一〉二甲苯一〉苯一〉氯仿的順序，按照極性要求選擇。這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數(shù)也比較小，在這范圍的化合物很少用，因為粘性大、展開慢，造成斑點擴散;另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。調(diào)節(jié)Rf值的溶劑，從醋酸乙酯一〉甲醇一〉丙酮一〉乙醇。揮發(fā)性物質(zhì)也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發(fā)性就可以明白，分子間作用力不強，另外，母核與石油醚、正構(gòu)烷和苯的結(jié)構(gòu)差異小，估計更容易脫離硅膠吸附，更快進入溶劑中，而不需要通過提高展開劑的極性。由于存在糖的多羥基結(jié)構(gòu)，苷元的結(jié)構(gòu)影響變小。展開劑中使用極性大的有機溶劑(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。3、 類極性大的小分子有機酸：沒食子酸：氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。相應(yīng)展開劑分別為：正己烷一乙醚一冰醋酸(5:5:0.1)、苯-冰醋酸-甲醇

(30:1:3)、氯仿-甲醇-甲酸(9:1:0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3:6:1)、醋酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)。結(jié)論：這類物質(zhì)多數(shù)是苯乙烯母核的，這個結(jié)構(gòu)的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團，個別有多羥基配基。皂苷的展開劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。4、類含氮有機物：鹽酸小檗堿：苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和)或正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)、麻黃堿：氯仿-甲醇-濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1)甘草酸銨：醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)。結(jié)論分析：由于NH2硅醇基的作用很強，在強極性展開劑加有機酸、有機堿掃尾。對于極性化合物，使用正丁醇對斑點擴散影響較小，因為化合物和硅膠的作用強。當被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑;被分離物質(zhì)為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠)，則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。TLC的通用顯色方法理想的顯色希望靈敏度高，斑點顏色穩(wěn)定、斑點與背景間的對比度好，斑點的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比，在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得尤為重要，通用顯色方法主要有：\E/mT2KgV"pFg4244131、紫外照射法：方便、不破壞樣品；Plo;Er"mzs?dT$V4244132、碘蒸氣法：通用性強，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨使用；$b8M"}?(P[+e4244133、熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯;小木蟲學術(shù)博客J-M0D6{Rf;r4、 硫酸溶劑：對絕大多數(shù)有機物有效，但有破壞性。4■薄層層析和紙色譜操作注意事項1、 點樣點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊1.0?1.5cm，樣點直徑一般不大于2mm,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應(yīng)待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。點樣時必須注意勿損傷薄層表面2、 展開將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜，密封，待展開至規(guī)定距離(一般為8?15cm)，取出薄層板，晾干，待檢測。注：展開缸如需預先用展開劑預平衡，可在缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持15-30分鐘。3、 顯色與檢視供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質(zhì)或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在356nm紫外光燈下觀察熒光色譜。對于可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板(如GF254板)，在254nm紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質(zhì)形成的色譜。把我的祖?zhèn)髅胤礁嬖V你吧

PE(60-90)EtAc/PE=1:2 EtAc/PE/AcOH=15:5:1EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O=2:1:1:18年來我用這四種體系，沒有出現(xiàn)過什么問題■我一直在用的是乙酸乙酯：環(huán)已烷，不斷調(diào)節(jié)比例，直到有滿意的Rf值，有拖尾時可能要加酸或堿，我一般乙酸和三乙胺。我用了好幾年了，都還好。不妨一試！鋪板鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋;過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2?3,硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進一步影響上樣量。涂層薄，點樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。點樣盡量用小的點樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點樣斑點擴散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點好樣的薄層板用電吹風的熱風吹干或放入干燥器里晾干。展開劑配制選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑。混合不均勻和沒有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達到實驗室儀器的最咼精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標移液管，移液管應(yīng)符合計量認證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。展開系統(tǒng)的飽和一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸