幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥分子機(jī)制研究

幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥分子機(jī)制研究【內(nèi)容摘要】幽門螺桿菌(hpylori，hp)是慢性胃炎，消化性潰瘍的主要致病因素。研究表示清楚，hp的根治和去除有利于潰瘍的治愈。而hp耐藥直接影響hp的根治和去除，hp耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物(克拉霉素)的機(jī)制與其23srrna的v區(qū)上的點(diǎn)突變有關(guān)。隨著hp耐藥率的逐年升高，有關(guān)hp的耐藥分子機(jī)制和檢測技術(shù)成為研究熱門。因而，開展hp耐藥的相關(guān)研究對hp的診斷和治療有重大意義。【本文關(guān)鍵詞語】幽門螺桿菌;耐藥性;克拉霉素;分子機(jī)制克拉霉素是新一代的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由于其抗hp作用強(qiáng)，而成為鏟除hp治療方案中的重要藥物。但hp可對其產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致鏟除治療失敗的重要原因[1-3]。我們國家近年才開始應(yīng)用克拉霉素，hp原發(fā)耐藥菌株的出現(xiàn)可能重要與同類藥物穿插耐藥有關(guān)，治療失敗時(shí)大約1/2～2/3的菌株可對其產(chǎn)生獲得性耐藥。因而，研究hp的耐藥情況、耐藥機(jī)制和檢測手段對指點(diǎn)臨床用藥以及療效監(jiān)測顯得特別需要。本文就hp對克拉霉素耐藥作一綜述。1hp對克拉霉素的耐藥情況隨著克拉霉素的廣泛使用，hp的耐藥菌株也逐步增加。hp對克拉霉素耐藥率在不同的國家和地區(qū)情況不盡一致。kobayashi等人[4]研究發(fā)現(xiàn)日本的hp克拉霉素耐藥率從2002年的18.9%上升到2005年的27.7%，且有明顯的性別差別(p0.0001)，其中男性19.2%，女性27.0%。他們還發(fā)現(xiàn)克拉霉素耐藥率有地區(qū)差別。kato等人[5]報(bào)道日本兒童的2002年克拉霉素原發(fā)耐藥率為29.0%，hp敏感菌株和耐藥菌株的鏟除率分別為89.0%、56.0%。hp繼發(fā)耐藥率(78%)明顯高于原發(fā)耐藥率(p0.01)。kimet等人[6]報(bào)道韓國漢城hp克拉霉素耐藥率由1994年的2.5%上升至2003年的13.8%。toracchio等人[7]對意大利中部研究發(fā)現(xiàn)克拉霉素原發(fā)耐藥率和繼發(fā)耐藥率分別為23.4%、82.3%，克拉霉素原發(fā)耐藥多見于女性。elviss等人[8]報(bào)道北威爾士2004年的克拉霉素耐藥率為7%，明顯低于歐洲其他地方。koivisto等人[9]報(bào)道芬蘭的克拉霉素耐藥率僅為2%，且與有口腔和呼吸道疾病的用藥史有關(guān)。boyanova等人[10]以為保加利亞的兒童克拉霉素耐藥率和他們的寓居地有關(guān)，這種差別可能和當(dāng)?shù)厥褂么蟓h(huán)內(nèi)酯類藥物有關(guān)，寓居在鄉(xiāng)村的兒童克拉霉素耐藥率為22.7%，明顯高于寓居在大城市的兒童耐藥率(8.5%)。osato等人[11]分別用etest和agardilution方法研究發(fā)現(xiàn)美國的克拉霉素原始和繼發(fā)耐藥率分別為12%和10.6%，性別和年齡對克拉霉素耐藥有很大影響。kaneko等人[12]研究顯示在經(jīng)太多重抗生素(包含克拉霉素)治療的非結(jié)核性呼吸道感染患者的克拉霉素耐藥率高達(dá)100%，提示應(yīng)在進(jìn)行長期的抗生素治療前應(yīng)鏟除hp。onder等人[13]對土耳其110例hp感染者研究發(fā)現(xiàn)，hp的克拉霉素耐藥率為48.2%，但其耐藥率和性別、年齡、大環(huán)內(nèi)酯類藥物的使用、寓居地、教育狀態(tài)無相關(guān)性。go?ciniak等人[14]研究發(fā)現(xiàn)波蘭1997-2001年的克拉霉素原發(fā)耐藥率8.6%，治療8周后耐藥率達(dá)17.6%。中國地區(qū)也存在著地區(qū)和年齡的差別，成虹等人[15]調(diào)查發(fā)現(xiàn)北京1999-2000年的克拉霉素耐藥率為10.0%，2000-2001年為18.3%，存在著上升趨勢。陳潔等人[16]對浙江地區(qū)44例兒童臨床分離菌株研究顯示克拉霉素耐藥率為18.2%，兒童耐藥率高于成人。hao等人[17]2004年報(bào)道中國東北地區(qū)克拉霉素耐藥率為23.3%。綜上所述：(1)各國家或地區(qū)的hp菌株對克拉霉素原發(fā)耐藥率不同，耐藥率為2%-48%，有明顯的地域差別?？死顾啬退幝试跐h城、北京、日本、土耳其呈上升趨勢，在意大利、芬蘭、北威爾士呈相對穩(wěn)定狀況或下降趨勢。(2)雖然有報(bào)道兒童克拉霉素耐藥率高于成人，但克拉霉素耐藥能否存在年齡、性別等差異不同，還存在爭議。(3)當(dāng)前多數(shù)學(xué)者以為，克拉霉素繼發(fā)耐藥率明顯高于原發(fā)耐藥率，抗生素(大環(huán)內(nèi)酯類)的用藥史與hp穿插耐藥、繼發(fā)性耐藥率的上升有相關(guān)性。2hp對克拉霉素的耐藥機(jī)制克拉霉素為14環(huán)的半合成新大環(huán)內(nèi)酯類，因構(gòu)造上其內(nèi)酯環(huán)的6位羥基為甲氧基所替代，也稱甲紅霉素。這一構(gòu)造上的修飾增長了其對酸的穩(wěn)定性及抗菌活性。其作用于細(xì)菌核糖體50s亞單位，通過阻斷轉(zhuǎn)肽作用及mrna位移而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。作為鏟除hp治療方案的關(guān)鍵成分，對該藥的耐藥是治療失敗的重要原因。bazzoli等人[18]報(bào)道克拉霉素敏感株及耐藥株的鏟除率分別為95%和40%。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能結(jié)合在野生型hp的50s大亞基的23s單位上，抑制肽基酰基轉(zhuǎn)移酶，影響核蛋白位移，抑制細(xì)菌蛋白合成和肽鏈延伸。而有耐藥性的hp的23srrna的v區(qū)上發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致核糖體的構(gòu)象改變，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合位點(diǎn)也隨之發(fā)生改變，進(jìn)而使hp與大環(huán)內(nèi)酯類藥物親合能力減粥，藥物也就不能阻攔細(xì)菌的蛋白合成，最終產(chǎn)生耐藥。最多見的突變位點(diǎn)為a2143g。defrancesco等人[19]在對62株克拉霉素耐藥菌株的研究中發(fā)現(xiàn)35株發(fā)生了a2143g突變(突變率為56.4%)，14株發(fā)生a2142g突變，8株a2142c突變，5株為a2143g和a2142g或a2143g和a2142c的同時(shí)突變。francesco等人[20]還發(fā)現(xiàn)發(fā)生a2143g突變的菌株鏟除率最低(48%)，但發(fā)生a2142g或a2142c突變的菌株鏟除率仍可到達(dá)93%，提示a2143g突變對hp對克拉霉素耐藥進(jìn)而影響其鏟除的作用最大。posteraro等人[21]應(yīng)用pcr依靠的高壓液相色譜法檢測到5個(gè)突變位點(diǎn)：a2142g，a2142c，a2143g，t2182c和c2195t。其c2195t的突變先前未曾發(fā)現(xiàn)過，此次與a2143g同時(shí)出現(xiàn)，顯示克拉霉素仍有新的突變位點(diǎn)產(chǎn)生，其耐藥機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。3幽門螺桿菌耐藥生物學(xué)檢測方法3.1對hp耐藥的傳統(tǒng)生物學(xué)檢測方法hp耐藥的傳統(tǒng)生物學(xué)檢測方法是取胃黏膜或組織，細(xì)菌增殖培養(yǎng)后，進(jìn)行etest、瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法等體外藥敏試驗(yàn)。etest操作簡便，但試紙價(jià)格昂貴;瓊脂稀釋法技術(shù)要求較高;紙片擴(kuò)散法簡便易行，但結(jié)果受多種因素的影響，不夠精確。hp培養(yǎng)要求高，時(shí)間長，不合適臨床慣例開展。hp耐藥的分子生物學(xué)檢測方法建立在檢測其核糖體23srrna點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上，根據(jù)能否需要基因擴(kuò)增分為：(1)需要用基因擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行分析的，包含聚合酶鏈限制性片段長度多態(tài)性分析法(pcrrelp)、dna測序法(sequencing)、dna酶免疫測定法(dnaenzymeimmunoassay)、寡核苷酸連接試驗(yàn)(ola)、3'端錯配反向pcr(3'mpcr)、實(shí)時(shí)熒光定量pcr(realtimepcr)、基因芯片法(genechip)、變性高效液相色譜法(dhplc)等。(2)不需要用基因擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行分析的，如熒光原位雜交(fish)。1996年versalovic等首先將pcrrelp用于檢查hp23srrna的a2142g，a2143g的突變，該法以核糖體23srrna點(diǎn)突變?yōu)榛A(chǔ)，通過pcr方法擴(kuò)增發(fā)生突變的區(qū)域，由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)的出現(xiàn)，利用特異的限制性內(nèi)切酶(mboⅱ，bsaⅰ)對pcr產(chǎn)品進(jìn)行酶切，電泳分析，然后根據(jù)dna片段長度的差別作出判定。該法簡便易行，較為敏感，是檢測ag突變常用的方法，但是該法的精確性遭到臨床標(biāo)本以及非hpdna擴(kuò)增產(chǎn)品的影響，alarcón等人[22]用3'mpcr能夠檢測的23srrnaa2142c的突變，其特點(diǎn)是運(yùn)用一對特殊的引物。realtimepcr將雜交技術(shù)和實(shí)時(shí)pcr以及融解曲線分析法三者有機(jī)地結(jié)合在一起，此方法不易污染，不需酶切，能同時(shí)對hp感染進(jìn)行定量和耐藥性檢測，而且合適于大量標(biāo)本的檢查。elviss等人[23]用realtimepcr通過對溶解曲線的判定精確快速檢測點(diǎn)突變，還比較了3'mpcr、realtimepcr、pcrrelp，以為用3'mpcr檢測點(diǎn)突變其敏感度和特異度都高于另外兩種方法。dhplc由oefner于1995年建立，利用雜合雙鏈和純合雙鏈部分變性溫度不同，能夠自動檢測單堿基置換，小片段插入和缺失。posteraro等人[24]用dhplc對pcr擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行分析，能檢測a2142g，a2143g，a2123c，t2182c，c2195t五個(gè)位點(diǎn)的突變。臨床理論證明，dna測序則是檢測基因突變位點(diǎn)的金標(biāo)準(zhǔn)。3.2基因芯片技術(shù)對hp耐藥的檢測近年來，基因芯片(genechip)技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于疾病研究、疾病診斷、基因測序、藥物挑選等方面?；蛐酒夹g(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)的基礎(chǔ)上的，其原理是將大量的探針分子固定在支持物上，與標(biāo)記的樣品dna進(jìn)行雜交，可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則確定靶dna序列，通過激光共聚集儀掃描，檢測雜交信號的強(qiáng)度和分布進(jìn)行分析。基因芯片能夠?qū)崿F(xiàn)對上千個(gè)基因同步檢測，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在嘗試用該技術(shù)檢測hp耐藥基因，且對hp基因進(jìn)行定性、定量及構(gòu)造分析的研究。國內(nèi)學(xué)者[25]制備和應(yīng)用寡核苷酸芯片對hp感染及其致病性相關(guān)的基因型和耐藥性同時(shí)進(jìn)行檢測，該法將pcr技術(shù)與高通量芯片技術(shù)相結(jié)合，對檢測對象的多種生物學(xué)信息進(jìn)行檢測，具有快速、高效的特點(diǎn)，具有較高的靈敏度，同時(shí)自動化讀取手段可確保檢測的特異性和客觀性，減少人為誤差，這對多種基因的比較研究非常有利。但也存在一些問題：樣品的制備與標(biāo)記比較繁瑣，芯片的制備較為復(fù)雜，儀器昂貴，費(fèi)用較高等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因芯片技術(shù)也會逐步成熟和完善，基因芯片技術(shù)對hp耐藥的檢測有著極為廣闊的應(yīng)用前景。隨著各國學(xué)者對hp耐藥檢測技術(shù)研究的進(jìn)展，取材方式也經(jīng)歷了一個(gè)發(fā)展經(jīng)過：(1)胃鏡下取胃組織或黏膜，細(xì)菌培養(yǎng)，提取菌株dna，再進(jìn)行各種分子生物學(xué)方法檢測。(2)直接從胃活檢標(biāo)本中提取dna，省去了培養(yǎng)步驟，快速簡便。(3)chattopadhyay等人[26]報(bào)道不需要抽提dna的實(shí)驗(yàn)方法，胃鏡下取胃黏膜或組織置于無菌塑料管，加120ml磷酸鹽緩沖液(pbs)，劇烈振蕩2min，開水浴15min后冰上冷卻，13000g離心1min，汲取上清液進(jìn)行pcr擴(kuò)增。(4)糞便取材，fontana用巢式pcr方法對糞便進(jìn)行擴(kuò)增[27]，產(chǎn)品用mboⅱ，hhaⅰ，bsaⅰ進(jìn)行酶切可檢測a2142c/g，t2717c，a2143g的突變.糞便取材屬非創(chuàng)傷性，但由于糞便中hp含量較低，雜菌較多，尤其是糞便中的膽紅質(zhì)，膽鹽及一些重金屬離子等可抑制taqdna聚合酶的活性，給實(shí)驗(yàn)帶來一定的難度，怎樣去除抑制物是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵.以上取材方式中，胃鏡下取材適用于有內(nèi)窺鏡檢查指征的患者，如十二指腸潰瘍、早期胃癌等。糞便取材方便且無痛苦，無創(chuàng)傷，尤其適用于對hp的克拉霉素耐藥性的流行病學(xué)查，以建立當(dāng)?shù)貐^(qū)的hp耐藥的流行病學(xué)資料，指點(diǎn)臨床合理用藥。4結(jié)束語隨著抗生素的廣泛適用，hp的耐藥率逐步上升。當(dāng)前，hp對克拉霉素耐藥的分子機(jī)制已基本明確，有關(guān)耐藥的檢測手段的研究也較多，但大多數(shù)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣。因而，研究和建立簡便、快速、精確的耐藥檢測方法，將對建立流行病學(xué)資料和指點(diǎn)臨床合理用藥有側(cè)重要的作用。基因芯片技術(shù)可對多種基因同時(shí)、快速進(jìn)行檢測，且具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，有著極為廣闊的應(yīng)用前景。【以下為參考文獻(xiàn)】1realdig,doremp,pianaa,etal.pretreatmentantibioticresistanceinhelicobacterpyloriinfection:resultsofthreerandomizedcontrolledstudies[j].helicobacter,1999,4(1):106-112.2pilottoa,leandrog,franceschim,etal.theeffectsofantibioticresistanceontheoutcomeofthree12weektripletherapiesagainsthelicobacterpylori[j].alimentpharmacolther,1999,13(3):667-673.3megraudf.antibioticresistanceinhelicobacterpyloriinfection[j].brmedbull,1998,54(1):207-216.4kobayashii,murakamik,katom,etal.changingantimicrobialsusceptibilityepidemiologyofhelicobacterpyloristrainsinjapanbetween2002and2005[j].jclinmicrobiol,2007,45(18):4006-4010.5katos,fujimuras,udagawah,etal.antibioticresistanceofhelicobacterpyloristrainsinjapanesechildren[j].jclinmicrobiol,2002,40(3):649-653.6kimjm,kimjs,junghc,etal.distributionofantibioticmicsforhelicobacterpyloristrainsovera16-yearperiodinpatientsfromseoul,southkorea[j].antimicrobagentschemother,2004,48(26):4843-4847.7toracchios,marziol.primaryandsecondaryantibioticresistanceofhelicobacterpyloristrainsisolatedincentralitalyduringtheyears1998-2002[j].digliverdis,2003,35:541-545.8elvissnc,owenrj,xerryj,etal.helicobacterpyloriantibioticresistancepatternsandgenotypesinadultdyspepticpatientsfromaregionalpopulationinnorthwales[j].jantimicrobchemother,2004,54(2):435-440.9koivistott,rautelinhi,voutilainenme,etal.primaryhelicobacterpyloriresistancetometronidazoleandclarithromycininthefinnishpopulation[j].alimentpharmacolther,2004,19(8):1009-1017.10boyanoval,gergovag,koumanovar,etal.riskfactorsforprimaryhelicobacterpyloriresistanceinbulgarianchildren[j].jmedmicrobiol,2004,53(6):911-914.11osatoms,reddyr,reddysg,etal.patternofprimaryresistanceofhelicobacterpyloritometronidazoleorclarithromycinintheunitedstates[j].archinternmed,2001,161(9):1217-1220.12kanekof,suzukih,hasegawan,etal.highprevalencerateofhelicobacterpyloriresistancetoclarithromycinduringlongtermmultipleantibiotictherapyforchronicrespiratorydiseasecausedbynontuberculousmycobacteria[j].alimentpharmacolther,2004,20(suppl1):62-67.13onderg,aydina,akarcau,etal.highhelicobacterpyloriresistanceratetoclarithromycininturkey[j].jclingastroenterol,2007,41(3):747-750.14goéciniakg,iwańczakb,przondomordarskaa,etal.highlevelofresistancetometronidazoleandclarithromycininhelicobacterpyloriisolatedfrompediatricpatientsinpoland(1997-2001)[j].foliamicrobiol(praha)2004,49(1):133-136.15成虹,胡伏蓮.北京地區(qū)幽門螺桿菌的耐藥情況及其變化趨勢[j].雜志,2005,39(24):2754-2757.16陳潔,陳飛波,余金丹,等.幽門螺桿菌對克拉霉素阿莫西林甲硝唑體外耐藥性和敏感性的初步分析[j].雜志,2004,10(3):769-771.17haoq,liy,zhangzj,etal.newmutationpointsin23srrnageneassociatedwithhelicobacterpyloriresistancetoclarithromycininnortheastchina[j].worldjgastroenterol,2004,10(8):1075-1077.18bazzolif,berrettid,delucal,etal.whatcanbelearntfromthenewdataaboutantibioticresistance?arethereanypracticalclinicalconsequencesofhelicobacterpyloriantibioticresistance[j].eurjgastroenterolhepatol,1999,11(suppl2):s39-s42.19defrancescov,margiottam,zulloa,etal.clarithromycinresistantgenotypesanderadicationofhelicobacterpylori[j].anninternmed,2006,144(2):94-100.20defrancescov,margiottam,zulloa,etal.primaryclarithromycinresistanceinitalyassessedonhelicobacterpyloridnasequencesbytaqmanrealtimepolymerasechainreaction[j].alimentpharmacolther,2006,23(3):429-435.21posterarop,brancag,sanquinettim,etal.rapiddetectionofclarithromycinresistanceinhelicobacterpyloriusingapcrbaseddenaturinghplcassay[j].jantimicrobchemother,2006,57(1):71-78.22alarcnt,domingod,prieton,etal.pcrusing3'mismatchedprimerstodetecta2142cmutationin23srrnaconferringresistancetoclarithromycininhelicoba