體外單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種

關(guān)于體外單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種第一頁，共六十七頁，2022年，8月28日植物單倍體誘導(dǎo)途徑:花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）第二頁，共六十七頁，2022年，8月28日植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相繼成功Konzak(1999)。第三頁，共六十七頁，2022年，8月28日

花藥培養(yǎng):將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)其花粉粒改變發(fā)育進程，形成花粉胚或愈傷組織，進而分化成苗的過程。（器官培養(yǎng)）花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng))：將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分化后再生成苗。（細胞培養(yǎng)）

1.花藥和花粉培養(yǎng)的概念：第四頁，共六十七頁，2022年，8月28日花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”。兩者的異同點培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。第五頁，共六十七頁，2022年，8月28日2.花藥或花粉培養(yǎng)的意義：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系2.1作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。第六頁，共六十七頁，2022年，8月28日例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

（2）提高了目標基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB

AABB AaBB AABb AaBbaB

aABB aaBB aABb aaBbAb

AabB AabB AAbb

Aabbab

aAbB aabB aAbb aabb第七頁，共六十七頁，2022年，8月28日例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

（2）提高了目標基因型的選擇效率

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->

AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培第八頁，共六十七頁，2022年，8月28日

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

（3）誘變育種中的作用

第九頁，共六十七頁，2022年，8月28日2.2物種進化研究

可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。

2.3遺傳分析

單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。2.4構(gòu)建連鎖圖譜

雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建2.5用于遺傳轉(zhuǎn)化

能直接表達外源基因，不受顯隱性影響。第十頁，共六十七頁，2022年，8月28日單倍體：具有配子體染色體數(shù)的孢子體。

單倍體植物3個明顯特點：

1、體細胞染色體數(shù)減半

2、生長發(fā)育弱，體形小

3、雌雄配子嚴重不育第十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日3.花粉孢子體發(fā)育途徑

（雄核發(fā)育）第十二頁，共六十七頁，2022年，8月28日3.1花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有絲分裂或之前。第十三頁，共六十七頁，2022年，8月28日3.2雄核發(fā)育途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞（1）A-V途徑

由營養(yǎng)細胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）

由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株第十四頁，共六十七頁，2022年，8月28日第十五頁，共六十七頁，2022年，8月28日1、雄核發(fā)育與P花粉的形成

P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理 饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核發(fā)育。3.3雄核發(fā)育啟動機理第十六頁，共六十七頁，2022年，8月28日

1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。3.4花粉植株形態(tài)發(fā)生方式第十七頁，共六十七頁，2022年，8月28日胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第十八頁，共六十七頁，2022年，8月28日通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第十九頁，共六十七頁，2022年，8月28日胚狀體發(fā)育途徑a)球形胚d)魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)第二十頁，共六十七頁，2022年，8月28日愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)第二十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)第二十二頁，共六十七頁，2022年，8月28日4花藥和花粉培養(yǎng)方法第二十三頁，共六十七頁，2022年，8月28日4.1花藥培養(yǎng)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第二十四頁，共六十七頁，2022年，8月28日4.2花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化

1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機械游離（1）磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子第二十五頁，共六十七頁，2022年，8月28日梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）第二十六頁，共六十七頁，2022年，8月28日(二)花粉培養(yǎng)方式

1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護培養(yǎng)

利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第二十七頁，共六十七頁，2022年，8月28日看護培養(yǎng)圖解第二十八頁，共六十七頁，2022年，8月28日4.3白化苗現(xiàn)象第二十九頁，共六十七頁，2022年，8月28日（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機理1、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2、外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。3、機理 核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通過對花粉發(fā)育時期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調(diào)控。第三十頁，共六十七頁，2022年，8月28日

Casestudy:

1、Canola(Brassicanapus).

Dihaploidplantsweregeneratedwithhigholeicandreduced

linoleicandα-linolenicacidsintheseedoilandfieldtested

forstabilityofthefattyacidsandyield.

第三十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日第三十二頁，共六十七頁，2022年，8月28日Uninucleatemicrosporesinsuspension

(Brassicanapus)第三十三頁，共六十七頁，2022年，8月28日Earlystageembryos(7-10days)(B.napus)第三十四頁，共六十七頁，2022年，8月28日Mid-stageEmbryos(10-14days)(B.napus)第三十五頁，共六十七頁，2022年，8月28日Latestageembryos(21days)(B.napus)第三十六頁，共六十七頁，2022年，8月28日Latestagecotyledonaryembryos(B.napus)第三十七頁，共六十七頁，2022年，8月28日“Germination”CotyledonaryembryostransferredtolightgrowthconditionswithGA3(B.napus)第三十八頁，共六十七頁，2022年，8月28日Growthofhaploidseedlingsonsolidculturemedium(B.napus)第三十九頁，共六十七頁，2022年，8月28日Well-developedhaploidplantletreadyfortransfertosoil,orforchromosomedoubling(B.napus)第四十頁，共六十七頁，2022年，8月28日Maturedihaploidplants(B.napus)第四十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日Flowschemeforanthercultureofbanana2、banana

第四十二頁，共六十七頁，2022年，8月28日AMicrosporesisolatedfrombananaanthers.Bar14μm.BDevelopmentofcallusfromanthersafter5monthsoninductionmedium.Bar2mm.CAndrogenicembryosformedoncalli.Bar4mm.DHaploidplantletsregeneratedfromanthers.Bar3cmAssanietal.PlantCellRep2003,21,511–516第四十三頁，共六十七頁，2022年，8月28日5.影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素（一）基因型植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。第四十四頁，共六十七頁，2022年，8月28日蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚狀體數(shù)量/106小孢子成苗率（%）第四十五頁，共六十七頁，2022年，8月28日（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài)1、植株生長條件光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長時期一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量第四十六頁，共六十七頁，2022年，8月28日（三）花粉發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。第四十七頁，共六十七頁，2022年，8月28日四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子第四十八頁，共六十七頁，2022年，8月28日單核晚期液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期生殖核生殖核營養(yǎng)核第四十九頁，共六十七頁，2022年，8月28日一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細胞分裂產(chǎn)生胚狀體。

第五十頁，共六十七頁，2022年，8月28日不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期發(fā)育時期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米第五十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時期的確定第五十二頁，共六十七頁，2022年，8月28日（四）預(yù)處理

預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件

預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。

預(yù)處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。

第五十三頁，共六十七頁，2022年，8月28日1、高低溫處理

低溫預(yù)處理：指在接種之前將材料用0℃以上低溫處理一段時間后再接種。應(yīng)用較多。處理溫度一般在1-14℃，時間從幾小時至幾十天不等。不同作物所用的預(yù)處理溫度及時間差異較大。不同的處理溫度需要不同的時間。

例子:小麥穗子培養(yǎng)前4℃預(yù)處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。

十字花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6-9℃處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個，預(yù)處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個。

預(yù)處理方法：第五十四頁，共六十七頁，2022年，8月28日

高溫處理（熱擊處理）：指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35℃）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。

例子:如煙草，32℃高溫；小麥，33℃高溫預(yù)處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996）第五十五頁，共六十七頁，2022年，8月28日2、化學(xué)物質(zhì)處理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。

3、其它包括γ射線、離心、磁場等。

第五十六頁，共六十七頁，2022年，8月28日（五）培養(yǎng)基

1.基本培養(yǎng)基主要為N6和MS培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。如H培養(yǎng)基（適于煙草）、C17培養(yǎng)基（適于小麥）、馬鈴署-Ⅱ培養(yǎng)基（適于馬鈴署）第五十七頁，共六十七頁，2022年，8月28日2.碳源包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。第五十八頁，共六十七頁，2022年，8月28日3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH

第五十九頁，共六十七頁，2022年，8月28日（六）培養(yǎng)條件

1、溫度物種間有差異2、光照3、植板密度

植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5×103到2×104／ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。第六十頁，共六十七頁，2022年，8月28日（七）花藥壁因素

花藥組織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進作用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。第六十一頁，共六十七頁，2022年，8月28日6.單倍體植