A-發(fā)育生物學緒論

緒論(Introduction)一、發(fā)育生物學的任務和研究對象1.發(fā)育生物學（developmentalbiology)是應用現(xiàn)代生物學技術(shù)研究生物體發(fā)育的過程及其變化機制的科學。它是20世紀50年代在胚胎學（embryology)的基礎(chǔ)上，隨著分子生物學、遺傳學、細胞生物學和生物化學等學科的發(fā)展以及它們與胚胎學的相互滲透而興起的一門新的前緣學科。2.發(fā)育生物學研究從生殖細胞發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、生長、成熟、衰老和死亡，即個體發(fā)育中生命現(xiàn)象發(fā)展的機制，以及異常發(fā)育如腫瘤、畸形等。3.發(fā)育生物學研究的核心問題是細胞分化(celldifferentiation).細胞分化是指由一種類型的細胞產(chǎn)生的細胞類型的多樣性。4.發(fā)育生物學研究有機體細胞的每一個分子、每一個細胞、每一種組織、每一個器官和每一種有機體，因為它們的起源和形成都離不開發(fā)育。珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和青蛙鰓的形成對發(fā)育生物學家來說是同樣正當?shù)膯栴}。發(fā)育生物學的研究并不局限于有機體的任一系統(tǒng)、組織或器官。這意味著發(fā)育生物學可能是生物學科的最廣泛的概括。發(fā)育的研究把所有的生物學領(lǐng)域連接在一起。二、發(fā)育的基本模式（一）發(fā)育的基本特點:多細胞有機體的產(chǎn)生是一個相對緩慢和漸進的變化過程，我們將其稱為發(fā)育（development)。其特征是具有嚴格的時間和空間的次序性，這種次序性是由發(fā)育的遺傳程序控制，發(fā)育是有機體的各種細胞協(xié)同作用的結(jié)果,也是一系列基因網(wǎng)絡性調(diào)控的結(jié)果.發(fā)育完成兩大功能：1.產(chǎn)生細胞的多樣性和在每一代中的條理性。從單個的受精卵產(chǎn)生不同類型的細胞，如肌肉細胞、皮膚細胞、神經(jīng)元、淋巴細胞、血細胞和所有其它類型的細胞。我們把細胞多樣性的產(chǎn)生稱為分化（differentiation)，是一個質(zhì)變的過程。由已分化的細胞形成組織和器官的過程稱為形態(tài)發(fā)生（morphogenesis)。發(fā)育的過程還包括生長（growth)，這是一個量變的過程。2.確保從一代到下一代生命的連續(xù)性,即增殖（reproduction).以保證該物種新個體的持續(xù)產(chǎn)生。（二）發(fā)育的基本過程：1.配子發(fā)生(gametogenesis)：產(chǎn)生成熟的精子（sperm)和卵子(ovum)的過程。2.受精(fertilization)：為精子和卵子相遇并結(jié)合的過程。3.卵裂(cleavage)和囊胚(blastula)：受精卵連續(xù)分裂，產(chǎn)生的細胞稱為卵裂球（blastomeres)，然后由它們形成多細胞的囊胚。4.原腸形成(gastrulation):囊胚的細胞經(jīng)過多種多樣的形態(tài)發(fā)生運動（morphogeneticmovement）產(chǎn)生由外胚層(ectoderm)、中胚層(mesoderm)和內(nèi)胚層(endoderm)組成的原腸胚（gastrula）。5.器官發(fā)生（organgenesis）：三胚層的細胞相互作用分化形成各種不同器官的原基。6.變態(tài)(metamorphosis)：有些動物，如兩棲類和昆蟲，在發(fā)育過程中經(jīng)歷一個幼蟲（larva）階段，然后經(jīng)過“脫胎換骨”的變化發(fā)育為成體的過程。三、發(fā)育生物學的發(fā)展簡史發(fā)育生物學是由于細胞生物學、遺傳學、生物化學及分子生物學等其他生命學科的發(fā)展和與胚胎學的相互滲透，在胚胎學的基礎(chǔ)上發(fā)展和形成的一門新興的生命科學。（一）先成論(preformation)和后成論(epigenesis)早在公元前,Aristotle

(384一322)認為動物胚胎和成體動物各種結(jié)構(gòu)形成的原因只有兩種可能：一是卵子或精子中本來具有微小的結(jié)構(gòu)，在發(fā)育過程中逐漸長大形成胚胎和成體的結(jié)構(gòu)；二是卵子或精子中本來并不具有這些結(jié)構(gòu)，而是在發(fā)育過程中逐漸形成的.在觀察雞和一些無脊椎動物胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)上，他首先提出了胚胎是由簡單到復雜逐漸發(fā)育形成的（后成論）。但到了公元17世紀后期和18世紀，以精源學說和卵源學說為代表的先成論占統(tǒng)治地位。精源學說認為胚胎預先存在于精子中，卵源學說則認為卵子中本來就存在微小的胚胎雛形。其共同點都認為胚胎是成體的雛形，是配子中本來固有的結(jié)構(gòu),胚胎發(fā)育僅僅是原有結(jié)構(gòu)的增大。1759年德國Wollf(TheoriaGenerationis和FormationeIntestinorum)再次提出了后成論觀點。Wollf根椐對雞胚發(fā)育的觀察，認為卵子中本來并不存在胚胎結(jié)構(gòu)，胚胎與成體也并不相同，胚胎發(fā)育是逐漸變化的過程。后成論直到19世紀才為人們所接受。（二）胚胎學(embryology)1.描述胚胎學(descriptiveembryology)2.比較胚胎學(comparativeembryology):

重演學說(recapitulationtheory)或生物發(fā)生律(biogeneticlaw)和進化論(evolutiontheory)。3.實驗胚胎學(experimentalembryology):

鑲嵌型發(fā)育(mosaicdevelopment;Weismann,

determinant;

Roux)和調(diào)整型發(fā)育(regulativedevelopment;Driesch)胚胎是由一個單細胞的合子經(jīng)過一系列的分裂和分化產(chǎn)生的。19世紀80年代,Weismann就提出了關(guān)于細胞、染色體和基因與胚胎發(fā)育關(guān)系的理論。他認為合子的細胞核含有大量特殊的信息物質(zhì)——決定子(determinants),在卵裂的過程中被平均分配到子細胞中去控制子細胞的發(fā)育命運。細胞的命運實際上是由卵裂時所獲得的合子核信息早已預定的。這一類型發(fā)育稱為嵌合型發(fā)育。Weismann理論的核心強調(diào)早期卵裂必須是不對稱分裂。由于合子成分的不均勻分布，其卵裂的結(jié)果產(chǎn)生的子細胞彼此之間是完全不同的。胚胎學家Roux(1887)用燒熱的針破壞兩細胞期蛙胚的一個分裂球，結(jié)果存活的另一個分裂球只發(fā)育為半個胚胎。由此他認為蛙的胚胎發(fā)育存在嵌合型發(fā)育機制，細胞的特征和命運是在卵裂的過程中決定的。但是Driesch(1891)用海膽為實驗材料重復Roux的實驗卻得到了完全不同的結(jié)果。他在海膽兩細胞時期將兩個分裂球分開,得到了兩個發(fā)育正常的、個體較小的海膽幼體。Driesch的實驗結(jié)果第一次證明發(fā)育過程中存在調(diào)整型發(fā)育機制。4.胚胎誘導作用(embryonicinduction)和組織者(organizer;

Spemann和Mangold,1924)Driesch(1876-1941)提出的調(diào)整型發(fā)育機制已經(jīng)涉及細胞之間的相互作用，但是一直到誘導現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)之后，人們才真正認識到，細胞之間的相互作用是胚胎發(fā)育最重要的核心問題.誘導是指一類組織與另一類組織的相互作用，前者稱為誘導者(inductor),后者稱反應組織，誘導者可指令鄰近反應組織的發(fā)育.1924年Spemann進行了著名的胚孔背唇移植實驗。將蠑螈原腸胚早期的胚孔背唇組織移植到另一同期受體胚胎的胚孔側(cè)唇表面，隨著受體胚胎發(fā)育的進程，大部分移植組織也內(nèi)陷進入胚胎內(nèi)，發(fā)現(xiàn)到原腸胚后期誘導產(chǎn)生了另一個次生胚。由于胚孔背唇組織具有調(diào)控和組織一個幾乎完整的胚胎產(chǎn)生的特殊能力,故稱組織者。發(fā)育中的誘導和細胞之間相互作用的重要性才因此得到充分的重視。由此重大發(fā)現(xiàn),Spemann在1935年獲得諾貝爾醫(yī)學獎.（三）細胞學理論和胚胎學1839年德國植物學家Schleiden和生理學家Schwann指出，所有生物有機體都由細胞構(gòu)成，細胞是生命的基本單位；通過細胞的有絲分裂產(chǎn)生其他細胞。因此發(fā)育也必然是逐漸變化的過程.在胚胎發(fā)育中,通過受精卵的分裂產(chǎn)生許多新細胞和新的細胞類型.到19世紀40年代，對卵子的特性開始有所認識，認識到卵子也是一個細胞（一個特殊細胞）。Weismann進一步提出后代所具有的雙親遺傳特性來自于生殖細胞，來自于兩性配子所攜帶的遺傳特性。之后對海膽等的研究進一步顯示，在受精初期受精卵中包含兩個細胞核，其中一個來源于卵子，另一個來源于精子，在受精過程中兩個細胞核融合。到19世紀后期，人們通過一系列研究認識到，合子細胞核的染色體中各有一半分別來源于兩個親代，而合子的遺傳信息在卵裂過程中平均分配到子細胞中去，這就為遺傳特性的傳遞提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。（四）胚胎學和遺傳學的結(jié)合Boveri

(1902)對海膽的研究發(fā)現(xiàn)，正常的胚胎發(fā)育決定于正常的染色體組型.之后的研究進一步提出基因型(genotype)與表型(phenotype)的概念。基因型是有機體從雙親獲得的遺傳信息所賦有的特性.有機體在不同發(fā)育時期表現(xiàn)出來的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生化等特征稱為表型。由基因型控制發(fā)育，同時有機體的表型又受到環(huán)境因子與基因型的共同影響。如孿生兄弟。所以發(fā)育實際上看作是基因型與表型的結(jié)合.發(fā)育受遺傳信息的控制，在發(fā)育過程中合子從雙親獲得的遺傳信息是如何表達的，一個單細胞的合子又是如何發(fā)育成為具有功能的有機體的，要回答這些難題，需要將遺傳學和胚胎學的研究結(jié)合起來。隨著基因編碼蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，不少問題迎刃而解.細胞的性質(zhì)是由細胞中所包含的蛋白質(zhì)決定的，而這些蛋白質(zhì)由基因編碼?；蛲ㄟ^其編碼產(chǎn)物—蛋白質(zhì)的變化控制發(fā)育分化中細胞的性質(zhì)和習性.遺傳和發(fā)育是個體發(fā)生過程的兩個方面。對于發(fā)育性狀的研究，既可以從遺傳現(xiàn)象出現(xiàn)的角度進行研究，又可以從發(fā)育過程進行研究。發(fā)育受遺傳程序的控制，遺傳特性通過發(fā)育展現(xiàn)出來.（五）分子生物學和發(fā)育生物學發(fā)育生物學是個新興學科。自從Watson和Crick

(1953)根據(jù)X衍射和化學分析提出DNA分子的雙螺旋模型以后，特別是60年代Nirenberg對DNA遺傳密碼的破譯，Jacob和Monocl(1960)提出并證明蛋白質(zhì)合成調(diào)控機制的操縱子學說等研究成果，使分子生物學迅速發(fā)展.分子生物學與遺傳學的結(jié)合，人們逐漸認識到遺傳信息主要是編碼在細胞核內(nèi)基因組DNA的一級序列，發(fā)育受遺傳的控制。為回答發(fā)育的遺傳程序是以何種方式編碼在基因組DNA上，編碼在DNA上的遺傳信息又如何控制生物體的發(fā)育等問題，人們開始采用分子生物學方法和各種新興的生物學技術(shù)，進行發(fā)育機制的研究.目前對于果蠅和線蟲發(fā)育的分子控制機制已基本闡明。在此基礎(chǔ)上，利用發(fā)育調(diào)控基因在進化上的保守性，開展了對脊椎動物發(fā)育分子機制的深入研究，對于斑馬魚、非洲爪瞻、小鼠、雞和文昌魚等模式動物的研究已取得一系列重大的突破.由于發(fā)育生物學的迅速發(fā)展，發(fā)育生物學已成為當代生命科學研究的前沿和熱點領(lǐng)域之一.四、發(fā)育生物學模式生物現(xiàn)代發(fā)育生物學研究主要集中于幾種模式生物，包括果蠅、線蟲、非洲瓜瞻、斑馬魚、雞和小鼠等。對于發(fā)育分子機制的認識也主要來源于對這些模式生物的研究。模式動物各有優(yōu)缺點,但都具備一些共同特征：①取材方便。在實驗室條件下，這些動物常年可產(chǎn)卵，隨時可獲得胚胎材料，飼養(yǎng)管理簡單，維持費用低。②胚胎具有較強的可操作性。胚胎一般較大，相關(guān)實驗技術(shù)如顯微注射等比較完善。③可進行遺傳學研究。上述物種中果蠅、線蟲和斑馬魚均可用于大規(guī)模遺傳突變研究，小鼠的基因敲除技術(shù)已相當完善，非洲爪瞻的轉(zhuǎn)基因技術(shù)較有優(yōu)勢。此外,棘皮動物海膽和尾索動物海鞘也都是較為常用的模式動物,文昌魚是研究動物進化的模式生物,水螅渦蟲常被用予再生機制的研究（一）脊椎動物模式生物

1.兩棲類：非洲爪蟾(Xenopuslaevis)兩棲類動物是早期胚胎學研究的經(jīng)典動物模型。在20世紀早期，常用的動物是蠑螈和蜥蜴，50年代以后，非洲爪瞻逐漸成為主要兩棲類動物模型。非洲爪瞻的優(yōu)勢是:取卵方便.在實驗室條件下，非洲爪蟾可常年產(chǎn)卵，不受季節(jié)限制。只需要注射激素，雌體第2天就可產(chǎn)卵產(chǎn)卵量大,卵可通過人工授精獲得受精卵。卵子和胚胎個體較大,直徑可達1.4mm,很方便進行實驗胚胎學研究，如顯微注射、胚胎切割和移植等。早期胚胎發(fā)育很快，在24oC下受精后2天左右就可以孵化為可自由游動的幼蟲.非洲瓜蟾的研究為我們認識脊椎動物的發(fā)育機制做出了重要貢獻。

非洲爪蟾的生命周期如圖緒.1。非洲爪瞻的成熟卵子具有明確的動物極和植物極之分。動物極含有大量色素顆粒而卵黃較少，植物極則含有豐富的卵黃而色素顆粒較少。受精時精子于動物半球的任意位點人卵。受精作用引起皮質(zhì)運動(corticalrotation)，質(zhì)膜下的皮質(zhì)胞質(zhì)相對于內(nèi)部的胞質(zhì)部分旋轉(zhuǎn)約30o。在這一過程中原來位于植物半球的背部決定因子被轉(zhuǎn)運至精子人卵處的對側(cè)，即未來胚胎的背側(cè)爪蟾胚胎經(jīng)過卵裂、囊胚（3.5h）、原腸胚(11h)、神經(jīng)胚(18h)及尾芽期(25h)等階段孵化成為幼蟲(66h)。蝌蚪在5天左右后肢開始發(fā)育并逐漸進入變態(tài)期，到2個月時完成變態(tài)。幼體要生長1-2年才能達到性成熟。雖然X.laevis作為動物模型有許多優(yōu)點，但也存在著重要缺陷，即很難進行遺傳學研究。主要是由于其生命周期過長，同時，X.laevis是異源四倍體，多數(shù)基因都存在4個拷貝，很難進行遺傳突變實驗。近年來，另一個X.laevis的近緣品種一X.tropicalis開始進入人們的視野。與X.laevis相比，X.tropicalis個體較小，世代周期短(約4個月)，是二倍體品種，因而比較適于進行遺傳學實驗。它同時也具備X.laevis所具有的實驗胚胎學研究優(yōu)勢，如激素誘導產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量大等。X.tropicalis的卵直徑0.6-0.7mm，足以進行顯微操作實驗。在X.laevis中建立的實驗方法均可直接應用于X.tropicalis中。目前X.tropicalis的基因組測序已接近完成。X.tropicalis有望成為重要的發(fā)育遺傳學研究模型。2.魚類：斑馬魚(Daniorerio)

20世紀60年代，美國Oregon大學Streisinger

G就開始了對斑馬魚的研究。90年代，由NilssleinVolhardC和DrieverW分別領(lǐng)導的實驗室開展了斑馬魚的大規(guī)模突變篩選，得到了大約4000個突變品系。此次篩選成為斑馬魚研究領(lǐng)域的里程碑。此后斑馬魚的研究得到了迅速發(fā)展。斑馬魚作為發(fā)育生物學模式生物有兩個明顯的優(yōu)勢：一是世代周期短(約3個月)，二是胚胎透明，易于觀察，同時飼養(yǎng)管理較為簡單，容易進行雜交實驗。斑馬魚是目前唯一可以進行大規(guī)模遺傳突變篩選的脊椎動物.斑馬魚的基因組測序已接近完成，相關(guān)的遺傳學和形態(tài)學研究技術(shù)也比較完善，斑馬魚已成為最好的脊椎動物發(fā)育遺傳學研究體系之一.

斑馬魚的卵屬于端黃卵，胚盤位于卵黃之上。早期的卵裂為盤狀不完全卵裂，囊胚期胚胎形成一個細胞球位于卵黃上，而囊胚腔并不明顯。位于囊胚邊緣的細胞與卵黃并不完全分隔。到囊胚期，這些細胞與卵黃細胞融合，形成一個合胞體層，稱為卵黃合胞體層(yolklsyncytiallayer，YSL)。到囊胚晚期，卵黃合胞體層與胚盤開始向下包被。到原腸作用結(jié)束時,卵黃細胞被完全包被在胚胎內(nèi)部。原腸作用后，體節(jié)、神經(jīng)管和其他器官原基開始出現(xiàn)。斑馬魚胚胎在受精后48h左右開始孵化為自由游動的幼體。

3.鳥類：雞

雞的胚胎發(fā)育過程與哺乳動物更為接近.由于雞胚在體外發(fā)育，相對于哺乳動物更容易進行實驗研究，相應的研究手段已比較成熟。雞胚是研究附肢、體節(jié)等器官發(fā)育機制的重要模型。雞的基因組測序也已完成。雞卵在輸卵管內(nèi)完成受精，在排卵過程中逐漸包被上卵清、殼膜和蛋殼。卵細胞質(zhì)和核位于卵黃上方2-3mm的狹小區(qū)域。受精卵經(jīng)卵裂形成胚盤，胚盤中央逐漸與卵黃分離，形成胚下腔。隨后一部分細胞遷移至胚下腔內(nèi)卵黃上方，形成下胚層，位于表面的胚層為上胚層，兩者之間為囊胚腔。上胚層后部細胞向中間遷移，使中央部分加厚形成原條，原條逐漸向前延伸，其最前端細胞變得更密集，稱為亨氏結(jié)(Hensen‘snode)。預定中胚層和內(nèi)胚層細胞通過原條中央的原溝遷入囊胚腔內(nèi)部--即原腸作用。隨后原條開始逐漸回縮，胚胎開始出現(xiàn)脊索、體節(jié)、神經(jīng)板等結(jié)構(gòu)。伴隨其發(fā)育，胚胎還形成復雜的胚外膜系統(tǒng)，包括卵黃囊、尿囊等。卵黃囊為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)，而尿囊是胚胎的呼吸器官并貯存代謝廢物。

雞胚在孵育21天后孵化成為小雞4.哺乳動物：小鼠

胚胎發(fā)育過程與人類比較接近，作為很多人類疾病的動物模型小鼠的世代周期約2個月，這在哺乳動物中是相當短的。其基因組測序已經(jīng)完成，遺傳學背景較為清楚，相應的遺傳學實驗手段如轉(zhuǎn)基因、基因敲除等也比較完善。小鼠是目前唯一可以進行基因敲除實驗的脊椎動物。最大缺點是其胚胎在母體內(nèi)發(fā)育，胚胎個體很小，很難實驗操作.小鼠成熟卵外包被透明帶(zonapellucida)，受精和卵裂均在輸卵管內(nèi)進行.在8細胞時胚胎發(fā)生緊密化(compaction)形成實心球體，至32細胞時稱桑椹胚(morula).此后出現(xiàn)囊胚腔.胚胎分化為滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm)和內(nèi)細胞團(innercelllPass)—胚泡(blastocyst)。內(nèi)細胞團將發(fā)育成為胚胎本身，而滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胚外組織。E4.5天時胚泡到達子宮從透明帶中孵出并植入子宮壁。此后小鼠胚胎的發(fā)育過程與雞胚類似.內(nèi)細胞團逐漸發(fā)育為一個中空的柱狀結(jié)構(gòu)，稱為卵柱(eggcylinder).卵柱中位于囊胚腔表面的細胞分化為臟壁內(nèi)胚層(visceralendoderm),與雞胚的下胚層相當，將來分化為胚外組織;而位于內(nèi)部的內(nèi)胚團細胞與雞胚的上胚層相當.卵柱中央的腔將來成為羊膜腔.在E6.5天時，在上胚層一側(cè)出現(xiàn)原條,原條向前延伸，其前端出現(xiàn)原節(jié)(node.)。胚胎的預定中胚層和內(nèi)胚層細胞通過原條遷入胚胎內(nèi)部。隨后原條回縮,胚胎開始出現(xiàn)神經(jīng)板、脊索、體節(jié)等。到E8.5天，胚胎的頭褶(headfold)已相當清楚.胚胎開始沿它的長軸扭轉(zhuǎn)，經(jīng)扭轉(zhuǎn)過程，胚胎被羊膜和羊膜液完全包圍.

小鼠幼仔在受孕后19-20天出生(二)無脊椎動物模式生物

1.果蠅(Drosophilamelanogaster)果蠅是遺傳學的經(jīng)典模式生物，已有100多年的研究歷史。但作為發(fā)育生物學研究模型，在早期并未受到重視。1980年初，德國科學家Nesslein-Volhard

C和美國學者WeichausE以果蠅作為材料，研究發(fā)育調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)，他們和另一位美國遺傳學家LewisEB分享了1995年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。果蠅為雙翅目昆蟲，個體小，生命周期短，繁殖容易，操作簡便，成本低廉，其胚胎和成體都具有豐富的表型特征。果蠅是目前遺傳學背景最清楚的物種，其基因組序列測序已全部完成(約包含13600個基因)，相關(guān)遺傳學研究手段非常完備，在長期的遺傳學研究過程中積累了大量遺傳突變品系，為果蠅的發(fā)育遺傳學研究提供了有利條件。

果蠅在250C下由卵至成蟲約需11天，經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段。果蠅卵呈長橢圓形，精子通過卵殼前部的卵孔入卵.其胚胎發(fā)育很快，受精卵在24h內(nèi)就可以孵化為幼蟲.卵裂為表面卵裂。在早期階段，合子核進行一系列快速分裂，而胞質(zhì)不分裂，形成合胞體(syncytium).核第8次分裂后,在胚胎最后部的核最先被細胞膜分隔形成極細胞，將形成生殖細胞。核第9次分裂后，大部分核開始遷移到卵的邊緣，稱為合胞體胚盤(syncytialblastoderm).受精約3個小時后，卵周邊的核被新形成的胞膜包圍，形成細胞化胚盤(celluarblastoderm).原腸作用過程(圖緒.8)中，先是胚胎腹側(cè)的預定中胚層細胞沿腹中線內(nèi)陷，形成腹溝(ventralfurrow)。隨后這部分細胞與表層組織分離，形成中胚層管。這些細胞將遷移至外胚層下，發(fā)育成為肌肉和其他結(jié)締組織。隨著中胚層組織的內(nèi)陷，原來位于胚胎背側(cè)的細胞也逐漸向腹側(cè)遷移集中。仍停留在背側(cè)的少量細胞不再繼續(xù)分裂，也不參與胚胎本身的構(gòu)成，而是形成胚外組織，稱為羊漿膜(amnioserosa)。而集中于胚胎腹側(cè)的細胞帶稱為胚帶(germband)。胚帶包含了外胚層和位于其下方的中胚層組織，將來形成胚胎的主體結(jié)構(gòu)，也是將要分節(jié)的部分。位于外胚層最腹側(cè)的預定神經(jīng)母細胞逐漸陷入胚胎內(nèi)部，發(fā)育為神經(jīng)組織。位于腹溝前后兩端的內(nèi)胚層細胞也分別內(nèi)陷，分別形成中腸的前部和后部，兩者隨后融合形成完整的中腸。在中腸細胞內(nèi)陷時，在其前后部同時帶人一部分外胚層細胞內(nèi)陷，分別形成前腸和后腸。隨著原腸作用的進行，胚帶開始延伸，胚帶后端不斷向背側(cè)延伸并折向前方。到胚帶延伸完成時，胚帶開始出現(xiàn)分節(jié)。胚胎的表皮出現(xiàn)一系列均勻分布的小溝，將胚胎分為14個區(qū)域，此時出現(xiàn)的分節(jié)是副體節(jié)。副體節(jié)與后來的體節(jié)在位置上并不對應，每一體節(jié)包含前一副體節(jié)的后2/3與后一副體節(jié)的前1/3。副體節(jié)在胚胎發(fā)育中的出現(xiàn)是短暫的，但它奠定了胚胎軀體結(jié)構(gòu)劃分的基礎(chǔ)，也是許多分節(jié)基因表達區(qū)域的基本單位。大約在7.5h胚帶開始回縮，在這一過程中胚胎開始出現(xiàn)明確的體節(jié)，包括3個頭部體節(jié)，3個胸部體節(jié)，8個腹部體節(jié)和1個尾節(jié).果蠅胚胎大約在受精后24h孵出成為幼蟲。幼蟲要經(jīng)過兩次蛻皮，因此分為1、2、3齡幼蟲。幼蟲表皮具有規(guī)則分布的齒狀突起帶(denticlebelt)，這些突起帶的形狀和大小具有體節(jié)特異性，這些是研究果蠅胚胎前一后軸和背-腹軸發(fā)育的重要表型依據(jù)。果蠅的3齡幼蟲化成蛹，在激素刺激下發(fā)生變態(tài)，由幼蟲變?yōu)槌上x。在變態(tài)過程中大部分幼蟲組織被吸收而被成體結(jié)構(gòu)所代替。果蠅成體的許多結(jié)構(gòu)都是由成蟲盤(imaginaldisc)發(fā)育而來的，包括腿、翅膀、眼睛、觸角及生殖腺等。成蟲盤是在胚胎發(fā)育階段由特定區(qū)域的表皮細胞群內(nèi)陷形成的囊狀結(jié)構(gòu)。

2.線蟲：秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)英國科學家SydneyBrenner在20世紀60年代開始選擇線蟲作為發(fā)育生物學模式動物，他與其合作者HRobertHorvitz和JohnESulston獲得了2002年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。線蟲成蟲僅約1mm長，構(gòu)造簡單，全身透明，細胞數(shù)目少，發(fā)育中的細胞譜系(celllineage)幾乎固定，易于追蹤。線蟲生命周期短，培養(yǎng)簡單，便于遺傳突變篩選，并可用液氮長期保存。線蟲的基因組測序已在1998年完成(共含19099個基因)，是第一個完成全基因組測序的多細胞動物.線蟲分雌雄同體和雄性兩性別，雌雄同體為主要形式.雌雄同體個體的性染色體為xx型，而雄性個體為xo型，只一條性染色體.雄體是減數(shù)分裂過程中由于染色體丟失造成的。雌雄同體個體可通過自體受精產(chǎn)生后代，也可與雄性個體交配異體受精。成熟的雌雄同體個體具有959個體細胞，約2000個生殖細胞。雄蟲則有1031個體細胞和約1000個生殖細胞.線蟲大致呈圓柱形，外表覆有角質(zhì)化層，下方為下皮層(hypodermis)，然后是肌肉。消化系統(tǒng)包括咽和腸道。其體腔為假體腔，體腔周圍沒有中胚層細胞包被。雌雄同體性腺為雙臂狀，開口至腹側(cè)中部的陰門。在性腺中，距陰門最近的細胞分化為精子貯存于體內(nèi)。卵子細胞核產(chǎn)生于性腺遠端，通過減數(shù)分裂形成，它們最初以合胞體狀態(tài)存在，直到受精前才形成完整的細胞膜。卵子在產(chǎn)出的過程中受精，在排出母體時通常處于卵裂階段(約40個細胞)。雄體性腺為單臂狀，只能產(chǎn)生精子。在250C條件下，線蟲完成一個生命周期約需2.5天(圖緒.9)。胚胎的前后軸是由精子人卵處決定的，精子入卵的部分成為胚胎的后端。精子入卵引起卵質(zhì)的重組，受精卵中間部分出現(xiàn)一個“分裂溝”，但此時并不真正分裂，稱為“假卵裂”(pseudocleavage).合子卵裂為不對稱卵裂(圖緒.10)

第一次卵裂后前部的細胞為AB細胞，而后段的細胞稱為P細胞。AB細胞繼續(xù)分裂為ABa和ABp細胞。而P細胞后幾次的分裂方式則類似干細胞，即每次分裂后都保持其中一個細胞為P細胞,另外一個細胞分別為EMS,C和D細胞(圖緒.10)。P4細胞是生殖細胞前體。EMS細胞繼續(xù)分裂為一個E細胞和一個MS細胞.E細胞將發(fā)育為內(nèi)胚層細胞。線蟲胚胎的“原腸作用”持續(xù)時間較長。在28細胞時期，兩個E細胞開始向內(nèi)部遷移，此時可以算作是原腸作用的開始。隨后由C和D細胞產(chǎn)生的肌細胞和由ABa細胞產(chǎn)生的咽細胞也依次由腹裂(ventralcleft)卷入胚胎內(nèi)部。胚胎的腹裂相當于胚孔。腹裂在290細胞時期合。胚胎在受精后約14h孵化成為幼蟲。線蟲胚胎發(fā)育過程中的細胞分裂方式一成不變，其細胞譜系已被完全確定(圖緒.11).幼蟲經(jīng)4次蛻皮成為成體，然后在3天內(nèi)產(chǎn)下300多個卵，并在2周后死亡.五、發(fā)育生物學研究技術(shù)

(一)常用發(fā)育生物學研究技術(shù)1.顯微鏡技術(shù)由于胚胎個體通常很小，顯微鏡和解剖鏡仍是發(fā)育生物學研究的必備工具。除了常規(guī)的光學顯微鏡外，一些特殊的顯微鏡也廣泛用于發(fā)育生物學研究。例如，相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)和微分干涉差顯微鏡(differentialinterference.contrastmicroscope)適用于觀察活的或未染色的樣品的精細結(jié)構(gòu).A.光鏡技術(shù)取材、固定、脫水、包埋、制片、染色、觀察B.電鏡技術(shù)

透射電鏡術(shù):取材、固定、脫水、包埋、制片、染色、觀察組織塊(lmm3)用戊二醛與餓酸兩次固定，脫水后樹脂包埋，用超薄切片機切片，再經(jīng)醋酸鈾和擰橡酸鉛染色。電子束射落到切片時，隨細胞構(gòu)成成分的密度以及吸附重金屬鈾、鉛、餓的程度不同,而發(fā)生相應的電子散射。當電子束技射到密度大、吸附重金屬多的結(jié)構(gòu)(如溶酶體)時，電子被散射得多，因此，射落到熒光屏上的電子少而呈暗像，電鏡照片上呈黑或深灰色，習慣稱該結(jié)構(gòu)為高電子密度；反之呈淺灰色，稱低電子密度。

掃描電鏡術(shù)：不需要制備切片，組織塊(約0.3cm大小)用戊二醛和餓酸固定，經(jīng)脫水干燥，表面噴鍍薄層碳與金屬膜，觀察.激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope)是20世紀80年代初研制成功的一種高光敏度、高分辨率的新型儀器，近年來在發(fā)育生物學領(lǐng)域得到了廣泛的應用.共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。某些熒光物質(zhì)(如熒光標記染料或熒光蛋白)在一定波長的激發(fā)光照射下會發(fā)出熒光。利用熒光染料標記的特異性抗體或探針，可對胚胎或細胞中的特定蛋白或mRNA的分布進行定性和定量研究。傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的最大缺點是成像質(zhì)量差。共聚焦顯微鏡技術(shù)很好地解決了這一問題。2.組織切片技術(shù)要觀察到胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通常要進行組織切片。最常用的技術(shù)是石蠟切片技術(shù)。石蠟切片術(shù)(paraffinsectioning)：取材、固定、脫水、包埋、切片(5～10μm厚)(連續(xù)切片）、貼片、脫蠟、染色、觀察蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，

HE染色法)：蘇木精為堿性染料，使染色質(zhì)和核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料使胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)著紅色

冷凍切片是利用特殊的低溫包埋劑對樣品進行包埋，在低溫條件下進行切片的技術(shù)。通常冷凍切片的質(zhì)量比石蠟切片要差，也很難進行連續(xù)切片，但方便快捷,對樣品中蛋白質(zhì)和核酸的保存也較好。特殊染色用硝酸銀將神經(jīng)細胞染為黑色(鍍銀染色法)用醛復紅將彈性纖維和肥大細胞的分泌顆粒染為紫色.活體染色將無毒或毒性小的染料經(jīng)靜脈注入后，再取材制成切片觀察.如注入的臺盼藍(trypanblue)可被肝、脾器官內(nèi)的巨噬細胞吞噬.在組織化學術(shù),常使用熒光染料染色或作為標記物,用熒光顯微鏡觀察3.免疫組織化學（immunohistochemistry）根據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合原理，檢測組織切片中的肽和蛋白質(zhì)用標記的抗體與組織中的抗原結(jié)合，標記物可于顯微鏡下觀察。肽和蛋白質(zhì)均具有抗原性。當把人或動物的某種肽或蛋白質(zhì)作為抗原注入另一種動物，其體內(nèi)會產(chǎn)生針對該抗原的特異性抗體(免疫球蛋白)。將抗體從動物血清中提出后，與標記物相結(jié)合，即成為標記抗體。用后者與組織切片孵育，抗體則與組織中相應抗原特異性結(jié)合，在顯微鏡下通過觀察標記物而獲知該肽或蛋白質(zhì)的分布部位。標記物有熒光素（熒光顯微鏡觀察）、辣根過氧化物酶（光鏡或電鏡觀察）、膠體金（多用于電鏡觀察）免疫組織化學(辣根過氧化物酶標記)胰島B細胞呈胰島素陽性免疫組織化學(熒光素標記)毛血管內(nèi)皮細胞呈vWF陽性

4.分子生物學技術(shù)聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT：-PCR)，

Northern印跡雜交，Western印跡雜交，免疫共沉淀技術(shù)等都常用于發(fā)育生物學研究，如用于檢測目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達。5.原位雜交技術(shù)核酸分子雜交組織化學術(shù)，檢測基因（DNA片段）的有無、基因的表達活性（mRNA）。原理：用帶標記物的已知堿基順序的核酸探針與細胞內(nèi)待測核酸按堿基配對原則進行特異性原位結(jié)合（雜交），并通過對標記物的顯示和檢測，而獲知待測核酸的有無及相對量。常用標記物有放射性核素35S、32P、3H和地高辛6.顯微注射顯微注射技術(shù)可將外源DNA、RNA或標記物等導人早期胚胎細胞中。在非洲爪瞻和斑馬魚中,用于對基因功能的研究和細胞譜系的標記研究。在果蠅和小鼠中，常用于轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建.由于不同動物胚胎大小差異很大，顯微注射所需顯微操作系統(tǒng)也有所差異。非洲瓜蟾和斑馬魚胚胎可在解剖鏡下操作，而小鼠和果蠅胚胎需在顯微鏡下操作。

原位雜交臍靜脈內(nèi)皮細胞呈心房鈉尿肽陽性7.報道基因技術(shù)常用于啟動子/增強子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因(即報道基因，reportergene)與待研究的表達調(diào)控序列串聯(lián),然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入胚胎體內(nèi)，通過分析報道基因產(chǎn)物的表達來研究目的片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。常用的報道基因有綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)和lacZ基因。GFP的分布可在熒光顯微鏡下直接觀察；lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，可以用特異底物進行顯色而研究其產(chǎn)物分布。熒光素酶(luciferase)報道基因以往常用于體外條件下基因表達活性的定量分析，特別是作為報道基因用于信號傳遞途徑的研究，近年來，隨著高靈敏度的檢測技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能夠?qū)ε咛ド踔脸审w小鼠體內(nèi)的熒光分布進行成像，熒光素酶報道基因也開始被用于體內(nèi)研究。8.細胞標記技術(shù)研究胚胎早期卵裂球分化命運.在胚胎移植實驗中標記供體或受體組織，在顯微注射實驗中追蹤被注射卵裂球的命運與表型等.早期常用的標記物包括活體染料尼羅藍和中性紅，使用方便，價格便宜，但很難標記胚胎內(nèi)部組織，隨胚胎發(fā)育染料會有擴散和衰退現(xiàn)象.現(xiàn)在細胞外標記染料常用親脂性熒光染料DiI和DiO.它會溶于標記細胞的細胞膜中并很好地保存于子代細胞中。在紫外線照射下，DiI會發(fā)出紅色熒光，而DiO會發(fā)出綠色熒光。其缺點是會溶于有機溶劑，不適于需進行組織切片的實驗。細胞內(nèi)標記物常用熒光標記葡聚糖和辣根過氧化物酶，這些標記物不會在細胞間擴散，示蹤比較準確。細胞內(nèi)標記物需通過顯微注射導入細胞內(nèi)，通過熒光顯微鏡或組織化學方法進行定位。在顯微注射實驗中，較常用的示蹤基因是GFP和lacZ基因，即將GFP或lacZmRNA與要研究的活性物質(zhì)共同注射入胚胎卵裂球中，通過觀察胚胎中GFP或β-半乳糖苷酶的分布來確定獲得注射物質(zhì)的組織。

(二)發(fā)育遺傳學技術(shù)發(fā)育生物學的基本任務之一是研究基因在胚胎發(fā)育中的作用。這一問題可以從兩個方向研究。一是正向遺傳學手段,即大規(guī)模隨機誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因。二是反向遺傳學方法，即通過功能喪失(lossoffunction)或功能獲得(gainoffunction)方法對已知基因進行功能研究。

1.正向遺傳學技術(shù)A.大規(guī)模誘變篩選誘變篩選通常是通過射線或化學誘變劑處理父本個體,在其生殖系細胞中產(chǎn)生隨機突變，然后與野生型母本個體雜交，子一代(Fl)個體中就有可能攜帶基因突變,而每一個體攜帶的基因突變可能都不同于其他個體.Fl中的每一個體再與野生型個體雜交，所產(chǎn)生的每一子二代(F2)群體再進行群體內(nèi)的雜交.如果Fl個體攜帶有基因突變，F(xiàn)2個體中就會有一半個體是雜合突變體，在F3代中有1/4的交配組合的后代中就有可能出現(xiàn)純合突變個體而表現(xiàn)出某種發(fā)育異常.突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細的生化技術(shù)才能檢測出與野生型的差別，有的突變可能是致死的。最常見的基因突變類型是功能喪失，即突變后的蛋白質(zhì)比野生型蛋白質(zhì)活性差。導致某一蛋白質(zhì)完全失活的突變稱為無效突變(nullmutation)。有時同一基因會出現(xiàn)一系列不同程度的功能喪失性突變。在有些情況下突變也可能是獲得功能性的，如某些受體或轉(zhuǎn)錄因子可能會由于突變而持續(xù)活化。對果蠅常染色體隱性突變篩選,引入了平衡染色體(halanGerchromosome).平衡染色體有3個特點：一是含有大規(guī)模的染色體易位，具有正常功能但不會與相應染色體間進行同源重組，保證了突變的遺傳穩(wěn)定性。二是該染色體上含有一個顯性標記基因，便于鑒別含有該染色體的個體。三是在純合狀態(tài)下是致死的。用于進行化學誘變的果蠅品系相應染色體中帶有一個隱性標記基因.經(jīng)過化學誘變的雄性個體與攜帶平衡染色體的雌性個體雜交，通過表型檢測挑選Fl代個體中帶有平衡染色體的雄性個體進行下一步的雜交。與Fl個體雜交的雌性個體中相應染色體上帶有一個溫度敏感型的致死基因。在290C培養(yǎng)時攜帶這一基因的胚胎會死亡.這樣，在F2代中，存活個體都有帶有一條平衡染色體和一條可能帶有突變基因的染色體.F2代雌雄個體間交配產(chǎn)生F3代個體.如果Fl代中的果蠅個體相應染色體上帶有基因突變，在F3代個體中就會產(chǎn)生該基因的純合突變體。如果該突變不致死，相應個體就會出現(xiàn)父本個體所攜帶的隱性表型；如果是致死的就要檢查死亡胚胎所出現(xiàn)的表型。而F3代中存活但不表現(xiàn)出父本表型的個體為攜帶有平衡染色體的雜合突變體,可用于該品系的保存.B.插入誘變篩選(insertionalmutagenesisscreen)利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體作為誘變劑。在果蠅中最常用的轉(zhuǎn)座子是p-因子(P-element).p-因子存在于某些果蠅類群中，可隨機插入基因組中，并可在基因組中移動。一個完整的p-因子包括轉(zhuǎn)座所需的特殊序列(包括末端重復序列等)和一個轉(zhuǎn)座酶編碼基因。在插入突變篩選中采用的P-因子是缺陷型的，缺乏有功能的轉(zhuǎn)座酶基因。p-因子介導的插入突變篩選通過不同品系果蠅的雜交來實現(xiàn)。其中一個品系攜帶有缺陷型的p-因子，而另一個品系攜帶有轉(zhuǎn)座酶，在其后代個體生殖細胞中，轉(zhuǎn)座酶就會誘導p-因子在基因組中的隨機轉(zhuǎn)座并有可能造成某些基因的突變。這些個體再與野生型個體雜交，其后代中就會含有雜合突變個體，同時p-因子與轉(zhuǎn)座酶基因通常會分離，從而保證其后代突變的穩(wěn)定性。這些雜合突變體再通過近交就可以獲得純合突變體并加以研究。該方法的不足處是p-因子的插入位點并不是完全隨機的，它不能覆蓋基因組中的全部基因。反轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA病毒，它們進入宿主細胞中后所攜帶的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA并隨機整合入宿主基因組中.利用這一特性人們構(gòu)建了缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體用于轉(zhuǎn)基因研究。這類載體具有隨機整合入宿主基因組的能力，也可用于隨機插入誘變篩選。這一方法在小鼠和斑馬魚中應用較多。

C.突變基因的克隆獲得感興趣的突變體后,就要克隆引起該突變的基因?qū)τ趐-因子或病毒載體引起的插人突變，基因的克隆可利用p-因子序列作為探針，從該突變體的基因組文庫中篩選出含有P一因子的克隆，從而確定p-因子的插人位點及被阻斷的基因。也可通過PCR方法確定其插入位點。對于化學誘變劑或射線照射引起的突變，基因的克隆就困難得多,多數(shù)情況下要采用定位克隆(positionalcloning)的辦法。定位克隆是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行基因分離。通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關(guān)系來確定突變基因的染色體位置。目的基因染色體定位的精確程度是定位克隆成功的關(guān)鍵，它取決于巳知染色體分子標記的精細程度并需要足夠大的突變體類群。較常用的分子標記檢測手段包括簡單序列長度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymorphisms,SSLPs)、限制片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs)和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisnSNPs)分析。通過這些手段通常可以將突變基因定位到幾百千堿基的范圍內(nèi).下一步的任務是獲取該染色體片段的基因組序列.獲取相應序列后，再通過生物信息學等手段確定該片段可能含有的基因，并根據(jù)這些基因的可能功能及該突變體的表型等初步判斷導致該突變的候選基因，最后通過實驗手段予以確認。要確定所得基因就是所要尋找的目的基因，要滿足以下條件：首先在該突變體中要檢測到相應的基因突變，并且該突變足以引起該基因的失活或功能異常；其次，該基因的野生型能夠使該突變體表型恢復(如通過mRNA注射或轉(zhuǎn)基因等手段)；第三，在野生型個體中，通過技術(shù)手段阻斷該基因的功能(如通過RNAi或反義技術(shù))，該個體應表現(xiàn)出與突變體一致的表型。

2.反向遺傳學技術(shù)對多數(shù)物種來講，由于其世代周期長、飼養(yǎng)管理困難等原因，進行大規(guī)模誘變篩選是很困難的。因此，反向遺傳學手段就顯得重要了。反向遺傳學通過對已知基因進行功能缺失或過表達實驗，研究胚胎個體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。常用的方法包括基因敲除或通過抑制性因子抑制目的基因的功能，或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)異位表達目的基因等。隨著許多模式生物基因組測序的完成，反向遺傳學技術(shù)將發(fā)揮越來越重要的作用。

A.基因敲除技術(shù)基因敲除(geneknock-out)是獲得攜帶有特定基因突變個體的技術(shù),研究基因在發(fā)育中的功能.20世紀80年代初,胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES細胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。小鼠胚胎干細胞取自小鼠胚胎內(nèi)細胞團，可在體外連續(xù)培養(yǎng)而保持其分化全能性。當ES細胞被注入受體胚胎內(nèi)細胞團時，它可參與形成小鼠胚胎的各種組織，形成嵌合體小鼠。通過同源重組技術(shù)可對胚胎干細胞的基因組進行修飾，使其攜帶某一特定基因突變。進行基因敲除第一步是構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu)。用抗藥性基因[常用的是新霉素(neomycin)抗性基因]取代目的基因中含有起始密碼子的外顯子部分，使目的基因完全失活。在基因突變片段兩側(cè)應帶有足夠長的與內(nèi)源基因相同位置同源的序列以利于同源重組的發(fā)生?；蛑亟M載體通過電轉(zhuǎn)化等手段導入胚胎干細胞中。通過抗藥性篩選可以獲得攜帶有重組基因的胚胎干細胞品系。經(jīng)過分子生物學手段確定這些細胞攜帶有正確重組的基因后，就可以將這些干細胞注射入胚胎中以獲得嵌合體小鼠.B.條件基因敲除技術(shù)(conditionknockout)許多重要調(diào)控基因同時參與胚胎發(fā)育的許多過程，在傳統(tǒng)的完全基因敲除小鼠胚胎中是早期致死的，而無法研究該基因在晚期胚胎發(fā)育或特定組織中的功能。條件基因敲除小鼠是指僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活.常采用Cre-lox系統(tǒng)。cre編碼一種重組酶，可以識別并結(jié)合loxP位點并切除位于兩個loxP位點之間的序列。進行條件基因敲除需構(gòu)建兩個小鼠品系，在其中一個品系中在靶基因兩側(cè)都插入loxP位點，在另一個品系中需要轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的cre基因。將兩個小鼠品系進行雜交，在其后代中,cre會在特定組織中表達，且靶基因會被Cre切除而失活，實現(xiàn)組織特異性的基因敲除(圖緒.16).由于Cre的作用效率并不能達到100%，在實際操作中l(wèi)oxP品系小鼠通常采用雜合體，即把基因中的一個拷貝帶有l(wèi)oxP位點，另一拷貝是失活的，以保證條件基因敲除的效率.Cre-lox系統(tǒng)也可用于基因的組織特異性激活實驗。在這種情況下，可將一段兩邊分別帶有l(wèi)oxP位點并含有終止子的序列插入到目的基因內(nèi)部并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。當這一品系的小鼠與特異的cre小鼠品系雜交時，在特定組織中目的基因內(nèi)部的插入序列就會被切除從而使目的基因被活化。C.RNA干擾技術(shù)抑制某一特定基因的表達,是研究基因功能的重要方法.RNA干擾是近年來發(fā)展的一種特異性抑制基因表達的新方法。1998年，F(xiàn)ireA等發(fā)現(xiàn)將雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲，可以誘導特異性的基因表達沉默(genesilencing)。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲及昆蟲直到哺乳動物的幾乎所有真核生物中。近年來，RNA干擾的研究已成為熱點，并被Science評選為2002年度最重要科技突破的首位。RNAi的作用機制如圖緒.17所示在RNAi過程中，長的dsRNA首先被二種RNA酶Ⅲ(Dicer)裂解為21-23個核苷酸的小干擾dsRNA(smallinterferingRNA，siRNA)，這些siRNA帶有5’端磷酸基團和3’端的羥基，3’末端帶有2-3個突出的核苷酸。siRNA進而結(jié)合到一種蛋白復合體中，形成RNA誘導的沉默復合體(RNAinducedsilencingcomplex，

RISC)。雙鏈siRNA解旋，RISC利用其反義鏈識別同源mRNA并在配對區(qū)的中間將目標mRNA水解,從而導致特異性的基因表達抑制.此外，微小RNA(microRNA，miRNA,與siRNA非常相似，只是產(chǎn)生機制不同)還可抑制目標mRNA的翻譯.

人們已利用RNAi技術(shù)對線蟲進行了全基因組范圍的基因功能研究在線蟲中，導入dsRNA可采用如下3種方法之一：①直接注入線蟲的性腺。②將線蟲浸泡在含dsRNA的溶液中。③用攜帶RNAi表達質(zhì)粒的細菌喂食線蟲。但在脊椎動物中，RNAi的作用效果還不理想，特別是作用的特異性似乎不夠高，阻礙了這一技術(shù)的應用。在哺乳動物細胞中,dsRNA的長度超過30個堿基對時會引起非特異性的抗病毒反應(如非特異性翻譯抑制和細胞凋亡，刺激干擾素表達等)。人們采用了多種方法來避免這一問題。一是采用化學合成的21-23個核苷酸的siRN