血紅蛋白的提取和分離(shk)課件

血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色譜法、電泳法等別離生物大分子的根本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法別離蛋白質的原理②電泳法別離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：①樣品的預處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。2021/1/122第一頁，共66頁。血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色譜法、電泳法等別離生物大分子的根本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法別離蛋白質的原理②電泳法別離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：①樣品的預處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。2021/1/122第二頁，共66頁。學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標志著進入了后基因組和蛋白質組時代。人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質組：生物個體表達的蛋白質分子的總和。主要是對蛋白質功能的研究。對蛋白質的研究和應用，首先需要獲得純度較高的蛋白質。如何從復雜的細胞混合物中提取，別離高純度的蛋白質呢？2021/1/123第三頁，共66頁。2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成人類基因組：指D考慮1別離生物大分子的根本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法別離具有不同物理或化學性質的生物大分子?？紤]2蛋白質的別離和提取的原理是什么？根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來別離不同蛋白質。你認為別離蛋白質和別離DNA一樣容易嗎？2021/1/124第四頁，共66頁?？紤]1別離生物大分子的根本思路是什么？選用一定的物理或化學考慮3人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進展DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，構造簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。2021/1/125第五頁，共66頁?？紤]3人們用雞的紅細胞提取DNA，用人雞的紅細胞具有細胞核提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法別離蛋白質的方法：2021/1/126第六頁，共66頁。提取分離方法凝膠色譜法凝膠電泳法別離蛋白質的方法：202一、根底知識㈠凝膠色譜法〔分配色譜法〕：1、凝膠：一些微小多孔的球體〔內含許多貫穿的通道，由多糖類化合物構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩〕2、概念：根據被別離的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀構造的凝膠的分子篩作用，來進展別離。2021/1/127第七頁，共66頁。一、根底知識㈠凝膠色譜法〔分配色譜法〕：1、凝膠3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，〔〕的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程〔〕，挪動速度〔〕，而〔〕的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在〔〕挪動，路程〔〕，挪動速度〔〕，相對分子質量不同的蛋白質因此得以別離。4、詳細過程相對分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快2021/1/128第八頁，共66頁。3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，〔2021/1/129第九頁，共66頁。2021/1/129第九頁，共66頁。2021/1/1210第十頁，共66頁。2021/1/1210第十頁，共66頁。1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：可以抵抗〔〕對溶液的〔〕的影響，維持PH根本不變。外界的酸或堿PH值2021/1/1211第十一頁，共66頁。1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋3、緩沖溶液的配制通常由〔〕種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的〔〕就可以制得〔〕使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內考慮：說出人體血液中緩沖對。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO32021/1/1212第十二頁，共66頁。3、緩沖溶液的配制通常由〔〕種緩沖劑溶解于水中配制而㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程?？紤]：在整個實驗過程中使用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常構造和功能，便于觀察〔紅色〕和材料的科學研究〔活性〕。2021/1/1213第十三頁，共66頁。㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生考慮：在整個實驗2、原理：許多重要的生物大分子，如〔〕等都具有)在()下，這些基團會帶上〔〕。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其〔〕挪動。電泳利用了待別離樣品中各種分子〔〕以及分子本身〔〕、〔〕的不同使帶電分子產生不同的〔〕，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的別離。多肽、核酸可解離的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質的差異大小形狀遷移速度一定的PH2021/1/1214第十四頁，共66頁。2、原理：許多重要的生物大分子，如〔2021/1/1215第十五頁，共66頁。2021/1/1215第十五頁，共66頁。〔1〕聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨和催化劑〔四甲基已二胺〕的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀構造的凝膠3.分類：兩種常用的電泳方法:瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素?！?〕原理2021/1/1216第十六頁，共66頁?！?〕聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中參加()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因此掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于()?！?〕SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機理:單條肽鏈的分子量分子的大小SDS注意：測定〔〕通常用十二烷基磺酸鈉〔SDS〕—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質相對分子質量2021/1/1217第十七頁，共66頁。為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中參加(聚丙烯酰胺凝膠電泳對別離大分子具有較高的分辨率，但核酸比蛋白質分子大得多，只能采用較大孔徑的瓊脂糖凝膠電泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸帶負電荷，在電場中向正極挪動。溴化乙啶熒光染料對核酸染色在紫外線的照射下，發(fā)出橙紅色熒光。根據熒光條帶的粗細和分布的位置，可以用在對PCR擴增效果的鑒定上。說明：2021/1/1218第十八頁，共66頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳對別離大分子具有較高的分辨率，但核酸比蛋白電泳檢測PCR結果瓊脂糖凝膠電泳2021/1/1219第十九頁，共66頁。電泳檢測PCR結果瓊脂糖凝膠電泳2021/1/1219第十九二、實驗操作蛋白質的提取和別離一般分為四步：1.樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作搜集到血紅蛋白溶液。2.粗別離：透析除去分子較小的雜質。3.純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去。4.純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。

2021/1/1220第二十頁，共66頁。二、實驗操作蛋白質的提取和別離一般分為四步：2021/1二實驗操作血液血漿水分其他物質血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞〔最多〕血紅蛋白〔〕兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈共四條肽鏈90％2021/1/1221第二十一頁，共66頁。二實驗操作血液血漿水分其他物質血漿蛋白無機鹽血細胞白細胞血2021/1/1222第二十二頁，共66頁。2021/1/1222第二十二頁，共66頁。2021/1/1223第二十三頁，共66頁。2021/1/1223第二十三頁，共66頁。每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。2021/1/1224第二十四頁，共66頁。每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，2021/1/1224第二十①目的：去除〔〕②方法：〔〕離心〔速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到別離的效果〕，然后用膠頭吸管吸出上層透明的〔〕，將下層〔〕的紅細胞液體倒入〔〕每個肽鏈環(huán)繞〔〕，此基團可攜帶〔〕。血紅蛋白因含有〔〕而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液來別離血紅蛋白。一個亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色燒杯2021/1/1225第二十五頁，共66頁。①目的：去除〔〕每個肽鏈環(huán)繞〔再參加用〔〕的〔〕質量分數為0.9％的氯化鈉溶液洗滌,緩慢攪拌10min，〔〕離心.五倍體積生理鹽水低速短時間如此重復洗滌〔〕次，直至上清液中已沒有〔〕，說明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的別離純化，不可洗滌次數過少。三黃色2021/1/1226第二十六頁，共66頁。再參加用〔〕的〔〕質洗滌過程圖解血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色2021/1/1227第二十七頁，共66頁。血液3g檸檬酸鈉低速離心紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理(2)血紅蛋白的釋放加〔〕到〔〕體積，再加40％體積的〔〕〔溶解細胞膜〕，置于〔〕上充分攪拌10min〔加速細胞破裂〕,細胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)別離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水2021/1/1228第二十八頁，共66頁。(2)血紅蛋白的釋放加〔〕到〔〕體第1層〔最上層〕：〔〕甲苯層第2層〔中上層〕：〔〕色薄層固體，〔〕的沉淀層。第3層〔中下層〕：〔〕的液體，〔〕的水溶液層。

第4層〔最下層〕：其它雜質〔〕的沉淀層無色透明脂溶性物質白血紅蛋白紅色透明暗紅色2021/1/1229第二十九頁，共66頁。第1層〔最上層〕：〔〕甲苯層第2層〔中上層〕用過濾，除去，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。濾紙脂溶性沉淀層2021/1/1230第三十頁，共66頁。用過濾，除去別離血紅蛋白別離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂溶性沉淀物燒杯2021/1/1231第三十一頁，共66頁。別離血紅蛋白別離過程紅細胞高速離心離心管濾紙過濾脂溶性沉淀物取()ml的血紅蛋白溶液裝入〔〕中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的〔〕中，pH為〔〕，透析12小時，目的是〔〕或用于更換樣品中的〔〕。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質透析袋磷酸緩沖液緩沖液(4)透析〔粗別離〕12021/1/1232第三十二頁，共66頁。取()ml的血紅蛋白溶液裝入〔〕中，將透析2021/1/1233第三十三頁，共66頁。2021/1/1233第三十三頁，共66頁。小結：樣品處理和粗別離1、紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要參加檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放3、別離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中〔PH為7.0〕透析。去除小分子雜質。2021/1/1234第三十四頁，共66頁。小結：樣品處理和粗別離1、紅細胞的洗滌：2021/1/123(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填(3)樣品的參加和洗脫血紅蛋白的純化2021/1/1235第三十五頁，共66頁。(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填(3)樣品的參加⑴凝膠色譜柱的制作：本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質別離不徹底。2021/1/1236第三十六頁，共66頁。⑴凝膠色譜柱的制作：本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:(2)凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立即用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱2021/1/1237第三十七頁，共66頁。材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液(2(3)樣品的參加和洗脫①調節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品注意：正確的加樣操作是：1.不要觸及并破壞凝膠面。2.貼壁加樣。3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞挪動。③樣品滲入凝膠床④洗脫⑤搜集注意：在別離過程中，假如紅色區(qū)帶均勻一致的挪動，說明色譜柱制作成功。2021/1/1238第三十八頁，共66頁。(3)樣品的參加和洗脫①調節(jié)緩沖液面3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞2021/1/1239第三十九頁，共66頁。2021/1/1239第三十九頁，共66頁。3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕判斷〔〕的蛋白質是否到達要求，需要進展蛋白質的鑒定。純化2021/1/1240第四十頁，共66頁。3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕判斷〔知識總結血紅蛋白的提取和別離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法

原理

分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定2021/1/1241第四十一頁，共66頁。知識總結血紅蛋白的提取和別離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法原影響蛋白質分子運動的因素

決定運動方向形成庫侖力形成阻力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√2021/1/1242第四十二頁，共66頁。影響蛋白質分子運動的因素

決定形成形成決定電荷性質電荷量分子觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，假如分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純潔的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三實驗結果分析與評價1、是否完成對血液樣品的處理2021/1/1243第四十三頁，共66頁。觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，假由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以參加大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶挪動的情況。假如色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。假如色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。2、凝膠色譜柱的裝填是否成功2021/1/1244第四十四頁，共66頁。由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱3、血紅蛋白的別離是否成功假如凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；假如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。2021/1/1245第四十五頁，共66頁。3、血紅蛋白的別離是否成功假如凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操課后練習1．提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否那么會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質分開；最后一步是對DNA進展鑒定，這是對整個實驗的結果的檢測。(P57)2021/1/1246第四十六頁，共66頁。課后練習1．提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選2．提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質的空間構造多種多樣，理化性質各不一樣，使得蛋白質的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據特定蛋白質的特性探究提取的條件，設計特定的方法。2021/1/1247第四十七頁，共66頁。2．提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，課后練習(P63)1.繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反響中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反響循環(huán)次數。一個DNA片段在30次循環(huán)后反響物中大約有10億個這樣的片段〔2n=230=1073741824)。2.PCR引物是根據需要擴增的目的DNA的堿基序列來設計的。2021/1/1248第四十八頁，共66頁。課后練習(P63)1.繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反課后練習(P70)1．凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分子量的大小別離蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數是由多糖類化合物構成，小球體內部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱內進展兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)那么的擴散運動。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，挪動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較2021/1/1249第四十九頁，共66頁。課后練習(P70)1．凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，挪動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網狀構造，相對分子質量大的分子通過這種網狀構造上的空隙時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得別離。2021/1/1250第五十頁，共66頁。容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，挪動速度較慢。因此，樣2．在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物〔緩沖劑〕溶解于水中制得，調節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反響體系的pH不變。在生物體內進展的各種生物化學過程都是在準確的pH下進展的，受到氫離子濃度的嚴風格控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學反響過程有與體內過程完全一樣的pH。2021/1/1251第五十一頁，共66頁。2．在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向挪動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待別離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而到達對樣品進展別離、鑒定或提純的目的。2021/1/1252第五十二頁，共66頁。3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的4．血紅蛋白提取和別離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗別離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作搜集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗別離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進展純度鑒定。2021/1/1253第五十三頁，共66頁。4．血紅蛋白提取和別離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗5．血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜別離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該搜集洗脫液。這使血紅蛋白的別離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。2021/1/1254第五十四頁，共66頁。5．血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜別離時可以通過觀察顏色討論：如何測定蛋白質的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組分子量的標準蛋白同時進展電泳，根據分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數作標準曲線，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售2021/1/1255第五十五頁，共66頁。討論：如何測定蛋白質的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳練習穩(wěn)固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深化，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間構造B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質2021/1/1256第五十六頁，共66頁。練習穩(wěn)固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越2、用凝膠色譜法別離蛋白質的過程中，關于蛋白質的表達，正確的選項是A相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D二者根本無法比較2021/1/1257第五十七頁，共66頁。2、用凝膠色譜法別離蛋白質的過程中，關于蛋白質的表達，正確的3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中參加檸檬酸鈉的目的是A調節(jié)pHB維持紅細胞的能量供給C防止微生物生長D防止血液凝固2021/1/1258第五十八頁，共66頁。3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數和CO2分子數分別是A4、2B4、4C2、1D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機溶劑-----脂類物質-----血紅蛋白溶液------紅細胞破碎物沉淀2021/1/1259第五十九頁，共66頁。5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數和CO2分子數分別B2021/1/1260第六十頁，共66頁。B2021/1/1260第六十頁，共66頁。ＡＣＤ8.凝膠色譜柱取長為40cm，內徑為1．6cm，有關說法中，正確的選項是(多項選擇)A．一般凝膠色譜柱直徑的大小不影響別離的效果B．凝膠色譜柱過高超過1m，不影響別離的效果C．凝膠色譜柱過矮，那么影響混合物的別離度D．凝膠色譜柱直徑過大會耗用過多洗脫液，樣品的稀釋度過大2021/1/1261第六十一頁，共66頁。ＡＣＤ8.凝膠色譜柱取長為40cm，內徑為1．6cm，有9.在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A、氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低別離效果B、氣泡阻礙蛋白質的運動C、氣泡與蛋白質發(fā)生化學反響D、氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不嚴密A2021/1/1262第六十二頁，共66頁。9.在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A2021/1/110.樣品的參加和洗脫的操作不正確的選項是A．加樣前，翻開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內C．等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A2021/1/1263第六十三頁，共66頁。10.樣品的參加和洗脫的操作不正確的選項是11.以下是有關血紅蛋白提取和別離的相關操作，其中正確的選項是〔〕A．可采集豬血作為實驗材料B．用蒸餾水重復洗滌紅細胞C．血紅蛋白釋放后應低速短時間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時開場搜集流出液A2021/1/1264第六十四頁，共66頁。11.以下是有關血紅蛋白提取和別離的相關操作，其中正確的選項12.凝膠色譜法別離蛋白質時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()A.改變蛋白質分子通過凝膠時的途徑B.吸附一部分蛋白質，從而影響蛋白質分子的挪動速度C.將酶或細胞固定在凝膠中D.與蛋白質分子進展化學反響，從而影響其挪動速度13.在利用凝膠電泳法別離蛋白質時，一定要參加緩沖液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白質的活性最高C.維持蛋白質所帶的電荷D.使蛋白質帶上電荷14.甲種蛋白質是由一條多肽構成，共有100個氨基酸；乙種蛋白質是由三條多肽構成，也含有100個氨基酸且種類和數量都相等，假設有一凝膠色譜柱能別離出這兩種蛋白質，那么洗脫時()A.甲先被洗脫B.乙先被洗脫C.甲乙同時被洗脫D.無法判斷ACB2021/1/1265第六十五頁，共66頁。12.凝膠色譜法別離蛋白質時，凝膠的種類較多，但其作用的共同謝謝欣賞第六十六頁，共66頁。謝謝欣賞第六十六頁，共66頁。血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色譜法、電泳法等別離生物大分子的根本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法別離蛋白質的原理②電泳法別離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：①樣品的預處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。2021/1/122第一頁，共66頁。血紅蛋白的提取和別離(shk)血紅蛋白的提取和別離(shk)學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色譜法、電泳法等別離生物大分子的根本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：①凝膠色譜法別離蛋白質的原理②電泳法別離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：①樣品的預處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。2021/1/1268第二頁，共66頁。學習目的簡述蛋白質提取和別離的根本原理，并理解凝膠色2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標志著進入了后基因組和蛋白質組時代。人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質組：生物個體表達的蛋白質分子的總和。主要是對蛋白質功能的研究。對蛋白質的研究和應用，首先需要獲得純度較高的蛋白質。如何從復雜的細胞混合物中提取，別離高純度的蛋白質呢？2021/1/1269第三頁，共66頁。2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成人類基因組：指D考慮1別離生物大分子的根本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法別離具有不同物理或化學性質的生物大分子。考慮2蛋白質的別離和提取的原理是什么？根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來別離不同蛋白質。你認為別離蛋白質和別離DNA一樣容易嗎？2021/1/1270第四頁，共66頁。考慮1別離生物大分子的根本思路是什么？選用一定的物理或化學考慮3人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進展DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，構造簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。2021/1/1271第五頁，共66頁。考慮3人們用雞的紅細胞提取DNA，用人雞的紅細胞具有細胞核提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法別離蛋白質的方法：2021/1/1272第六頁，共66頁。提取分離方法凝膠色譜法凝膠電泳法別離蛋白質的方法：202一、根底知識㈠凝膠色譜法〔分配色譜法〕：1、凝膠：一些微小多孔的球體〔內含許多貫穿的通道，由多糖類化合物構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩〕2、概念：根據被別離的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀構造的凝膠的分子篩作用，來進展別離。2021/1/1273第七頁，共66頁。一、根底知識㈠凝膠色譜法〔分配色譜法〕：1、凝膠3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，〔〕的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程〔〕，挪動速度〔〕，而〔〕的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在〔〕挪動，路程〔〕，挪動速度〔〕，相對分子質量不同的蛋白質因此得以別離。4、詳細過程相對分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快2021/1/1274第八頁，共66頁。3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，〔2021/1/1275第九頁，共66頁。2021/1/129第九頁，共66頁。2021/1/1276第十頁，共66頁。2021/1/1210第十頁，共66頁。1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：可以抵抗〔〕對溶液的〔〕的影響，維持PH根本不變。外界的酸或堿PH值2021/1/1277第十一頁，共66頁。1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋3、緩沖溶液的配制通常由〔〕種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的〔〕就可以制得〔〕使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內考慮：說出人體血液中緩沖對。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO32021/1/1278第十二頁，共66頁。3、緩沖溶液的配制通常由〔〕種緩沖劑溶解于水中配制而㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程?？紤]：在整個實驗過程中使用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常構造和功能，便于觀察〔紅色〕和材料的科學研究〔活性〕。2021/1/1279第十三頁，共66頁。㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生考慮：在整個實驗2、原理：許多重要的生物大分子，如〔〕等都具有)在()下，這些基團會帶上〔〕。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其〔〕挪動。電泳利用了待別離樣品中各種分子〔〕以及分子本身〔〕、〔〕的不同使帶電分子產生不同的〔〕，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的別離。多肽、核酸可解離的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質的差異大小形狀遷移速度一定的PH2021/1/1280第十四頁，共66頁。2、原理：許多重要的生物大分子，如〔2021/1/1281第十五頁，共66頁。2021/1/1215第十五頁，共66頁?！?〕聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨和催化劑〔四甲基已二胺〕的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀構造的凝膠3.分類：兩種常用的電泳方法:瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素?！?〕原理2021/1/1282第十六頁，共66頁。〔1〕聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中參加()。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因此掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于()?！?〕SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機理:單條肽鏈的分子量分子的大小SDS注意：測定〔〕通常用十二烷基磺酸鈉〔SDS〕—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質相對分子質量2021/1/1283第十七頁，共66頁。為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中參加(聚丙烯酰胺凝膠電泳對別離大分子具有較高的分辨率，但核酸比蛋白質分子大得多，只能采用較大孔徑的瓊脂糖凝膠電泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸帶負電荷，在電場中向正極挪動。溴化乙啶熒光染料對核酸染色在紫外線的照射下，發(fā)出橙紅色熒光。根據熒光條帶的粗細和分布的位置，可以用在對PCR擴增效果的鑒定上。說明：2021/1/1284第十八頁，共66頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳對別離大分子具有較高的分辨率，但核酸比蛋白電泳檢測PCR結果瓊脂糖凝膠電泳2021/1/1285第十九頁，共66頁。電泳檢測PCR結果瓊脂糖凝膠電泳2021/1/1219第十九二、實驗操作蛋白質的提取和別離一般分為四步：1.樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作搜集到血紅蛋白溶液。2.粗別離：透析除去分子較小的雜質。3.純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去。4.純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。

2021/1/1286第二十頁，共66頁。二、實驗操作蛋白質的提取和別離一般分為四步：2021/1二實驗操作血液血漿水分其他物質血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞〔最多〕血紅蛋白〔〕兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈共四條肽鏈90％2021/1/1287第二十一頁，共66頁。二實驗操作血液血漿水分其他物質血漿蛋白無機鹽血細胞白細胞血2021/1/1288第二十二頁，共66頁。2021/1/1222第二十二頁，共66頁。2021/1/1289第二十三頁，共66頁。2021/1/1223第二十三頁，共66頁。每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。2021/1/1290第二十四頁，共66頁。每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，2021/1/1224第二十①目的：去除〔〕②方法：〔〕離心〔速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到別離的效果〕，然后用膠頭吸管吸出上層透明的〔〕，將下層〔〕的紅細胞液體倒入〔〕每個肽鏈環(huán)繞〔〕，此基團可攜帶〔〕。血紅蛋白因含有〔〕而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液來別離血紅蛋白。一個亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細胞的洗滌雜質蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色燒杯2021/1/1291第二十五頁，共66頁。①目的：去除〔〕每個肽鏈環(huán)繞〔再參加用〔〕的〔〕質量分數為0.9％的氯化鈉溶液洗滌,緩慢攪拌10min，〔〕離心.五倍體積生理鹽水低速短時間如此重復洗滌〔〕次，直至上清液中已沒有〔〕，說明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的別離純化，不可洗滌次數過少。三黃色2021/1/1292第二十六頁，共66頁。再參加用〔〕的〔〕質洗滌過程圖解血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色2021/1/1293第二十七頁，共66頁。血液3g檸檬酸鈉低速離心紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理(2)血紅蛋白的釋放加〔〕到〔〕體積，再加40％體積的〔〕〔溶解細胞膜〕，置于〔〕上充分攪拌10min〔加速細胞破裂〕,細胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)別離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水2021/1/1294第二十八頁，共66頁。(2)血紅蛋白的釋放加〔〕到〔〕體第1層〔最上層〕：〔〕甲苯層第2層〔中上層〕：〔〕色薄層固體，〔〕的沉淀層。第3層〔中下層〕：〔〕的液體，〔〕的水溶液層。

第4層〔最下層〕：其它雜質〔〕的沉淀層無色透明脂溶性物質白血紅蛋白紅色透明暗紅色2021/1/1295第二十九頁，共66頁。第1層〔最上層〕：〔〕甲苯層第2層〔中上層〕用過濾，除去，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。濾紙脂溶性沉淀層2021/1/1296第三十頁，共66頁。用過濾，除去別離血紅蛋白別離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂溶性沉淀物燒杯2021/1/1297第三十一頁，共66頁。別離血紅蛋白別離過程紅細胞高速離心離心管濾紙過濾脂溶性沉淀物取()ml的血紅蛋白溶液裝入〔〕中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/L的〔〕中，pH為〔〕，透析12小時，目的是〔〕或用于更換樣品中的〔〕。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質透析袋磷酸緩沖液緩沖液(4)透析〔粗別離〕12021/1/1298第三十二頁，共66頁。取()ml的血紅蛋白溶液裝入〔〕中，將透析2021/1/1299第三十三頁，共66頁。2021/1/1233第三十三頁，共66頁。小結：樣品處理和粗別離1、紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要參加檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放3、別離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中〔PH為7.0〕透析。去除小分子雜質。2021/1/12100第三十四頁，共66頁。小結：樣品處理和粗別離1、紅細胞的洗滌：2021/1/123(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填(3)樣品的參加和洗脫血紅蛋白的純化2021/1/12101第三十五頁，共66頁。(1)凝膠色譜柱的制作(2)凝膠色譜柱的裝填(3)樣品的參加⑴凝膠色譜柱的制作：本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質別離不徹底。2021/1/12102第三十六頁，共66頁。⑴凝膠色譜柱的制作：本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:(2)凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立即用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱2021/1/12103第三十七頁，共66頁。材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液(2(3)樣品的參加和洗脫①調節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品注意：正確的加樣操作是：1.不要觸及并破壞凝膠面。2.貼壁加樣。3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞挪動。③樣品滲入凝膠床④洗脫⑤搜集注意：在別離過程中，假如紅色區(qū)帶均勻一致的挪動，說明色譜柱制作成功。2021/1/12104第三十八頁，共66頁。(3)樣品的參加和洗脫①調節(jié)緩沖液面3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞2021/1/12105第三十九頁，共66頁。2021/1/1239第三十九頁，共66頁。3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕判斷〔〕的蛋白質是否到達要求，需要進展蛋白質的鑒定。純化2021/1/12106第四十頁，共66頁。3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕判斷〔知識總結血紅蛋白的提取和別離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法

原理

分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定2021/1/12107第四十一頁，共66頁。知識總結血紅蛋白的提取和別離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法原影響蛋白質分子運動的因素

決定運動方向形成庫侖力形成阻力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√2021/1/12108第四十二頁，共66頁。影響蛋白質分子運動的因素

決定形成形成決定電荷性質電荷量分子觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，假如分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純潔的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三實驗結果分析與評價1、是否完成對血液樣品的處理2021/1/12109第四十三頁，共66頁。觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，假由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以參加大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶挪動的情況。假如色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。假如色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。2、凝膠色譜柱的裝填是否成功2021/1/12110第四十四頁，共66頁。由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱3、血紅蛋白的別離是否成功假如凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；假如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。2021/1/12111第四十五頁，共66頁。3、血紅蛋白的別離是否成功假如凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操課后練習1．提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否那么會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質分開；最后一步是對DNA進展鑒定，這是對整個實驗的結果的檢測。(P57)2021/1/12112第四十六頁，共66頁。課后練習1．提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選2．提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質的空間構造多種多樣，理化性質各不一樣，使得蛋白質的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據特定蛋白質的特性探究提取的條件，設計特定的方法。2021/1/12113第四十七頁，共66頁。2．提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，課后練習(P63)1.繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反響中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反響循環(huán)次數。一個DNA片段在30次循環(huán)后反響物中大約有10億個這樣的片段〔2n=230=1073741824)。2.PCR引物是根據需要擴增的目的DNA的堿基序列來設計的。2021/1/12114第四十八頁，共66頁。課后練習(P63)1.繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反課后練習(P70)1．凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分子量的大小別離蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數是由多糖類化合物構成，小球體內部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱內進展兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)那么的擴散運動。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，挪動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較2021/1/12115第四十九頁，共66頁。課后練習(P70)1．凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，挪動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網狀構造，相對分子質量大的分子通過這種網狀構造上的空隙時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得別離。2021/1/12116第五十頁，共66頁。容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，挪動速度較慢。因此，樣2．在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物〔緩沖劑〕溶解于水中制得，調節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反響體系的pH不變。在生物體內進展的各種生物化學過程都是在準確的pH下進展的，受到氫離子濃度的嚴風格控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學反響過程有與體內過程完全一樣的pH。2021/1/12117第五十一頁，共66頁。2．在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向挪動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待別離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而到達對樣品進展別離、鑒定或提純的目的。2021/1/12118第五十二頁，共66頁。3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的4．血紅蛋白提取和別離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗別離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作搜集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗別離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最后經聚丙