實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制與滅菌課件

實(shí)驗(yàn)一

植物培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)和了解培養(yǎng)基母液的配制方法。2、掌握培養(yǎng)基的配制方法。3、學(xué)習(xí)和了解培養(yǎng)基、器皿和相關(guān)設(shè)備的滅菌方法。二、主要實(shí)驗(yàn)用具和儀器設(shè)備燒杯（1000ml、500ml、100ml、50ml）、量筒（2000ml、1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml、10ml）、容量瓶（1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml）、試劑瓶（1000ml、500ml、200ml、100ml、50ml）、玻璃棒、油性標(biāo)記筆、移液槍（5ml、1ml、200μl、100μl）、對應(yīng)的槍頭、培養(yǎng)基瓶（1000ml、500ml、200ml）等。電子天平（感量為0.1mg、10mg）、pH計(jì)、滅菌鍋、微波爐、磁力攪拌器、電磁爐、超凈工作臺(tái)等。三、實(shí)驗(yàn)藥品

按培養(yǎng)基配方準(zhǔn)備。1NNaOH、1NHCl。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）MS培養(yǎng)基母液的配制1、大量元素母液的配制（配1L）無機(jī)鹽中大量元素母液，按照培養(yǎng)基配方的用量，把各種化合物擴(kuò)大10倍，分別用50ml燒杯稱量，用蒸餾水溶解，必要時(shí)加熱。溶解后，倒入1000ml容量瓶中，最后用蒸餾水定容。在混合定容時(shí)，必須最后加入氯化鈣，因?yàn)槁然}與磷酸二氫鉀能形成難溶于水的沉淀。將配好的混合液倒入細(xì)口試劑瓶中，貼好標(biāo)簽。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1000ml培養(yǎng)基，取大量元素母液100ml。2、微量元素母液的配制（配0.5L）無機(jī)鹽中微量元素母液，按照培養(yǎng)基配方的用量，把各種化合物擴(kuò)大100倍，分別用50ml燒杯稱量，用蒸餾水溶解，必要時(shí)加熱。溶解后，倒入500ml容量瓶中，最后用蒸餾水定容。化合物名稱每升培養(yǎng)基用量（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量（mg/0.5L）備注MnSO4●4H2O22.31115每升培養(yǎng)基取母液10mlZnSO4●7H2O8.6430H3BO36.2310KI0.8341.5Na2MoO4●2H2O0.2512.5CuSO4●5H2O0.0251.25CoCl2●6H2O0.0251.253、鐵鹽母液的配制（配0.5L）目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。常常配成200倍母液，溶解時(shí)可加熱?；衔锩Q每升培養(yǎng)基用量（mg/L）擴(kuò)大200倍稱量（g/0.5L）備注Na2EDTA37.253.725每升培養(yǎng)基取母液5mlFeSO4●7H2O27.852.7854、有機(jī)物母液的配制（配0.5L）MS培養(yǎng)基中，有機(jī)物為甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫氨素（V-B1）、鹽酸吡哆素（V-B6），常常配成1000倍或100倍母液。本實(shí)驗(yàn)將有機(jī)物配成100倍母液。化合物名稱每升培養(yǎng)基用量（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量（mg/0.5L）備注Glycine（甘氨酸）2.0100每升培養(yǎng)基取母液10mlThiamine-HCl（VB1）0.420Pyridoxine-HCl(VB6)0.525Nicotinicacid(煙酸)0.525Inositol（肌醇）10050005、植物生長調(diào)節(jié)劑（激素）母液的配制配制生長素類，如2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸等，應(yīng)先用少量（1-2ml）的乙醇溶解，然后用蒸餾水定容；配制細(xì)胞分裂素時(shí)，先用少量的1NHCl或1NNaOH溶解，然后用蒸餾水定容。最終各種激素母液濃度應(yīng)均為1mg/ml。

以上各種母液必須用蒸餾水配制，然后保存在冰箱（4℃）中，一般可保存幾個(gè)月，當(dāng)發(fā)現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)時(shí)，則不能繼續(xù)使用。培養(yǎng)基配制：藥品名稱母液倍或母液濃度（mg/ml）配制1L培養(yǎng)基所需母液量(ml)或直接稱量量（g）MS1MS2MS3大量元素10倍液100ml

100ml

100ml

微量元素100倍液10ml10ml10ml鐵鹽200倍液5

ml5

ml5

ml有機(jī)物質(zhì)100倍液10ml

10ml

10ml

2,4-D1.0mg/ml1ml——

1ml

NAA1.0mg/ml——0.2ml

——

KT1.0mg/ml0.1ml

1.0ml——

蔗糖30g30g30g30g瓊脂8g8g8g——pH值5.85.85.85.82、配培養(yǎng)基時(shí)大量體積的溶液可以用量筒（選擇合適的量程），少量的用移液槍，用完后調(diào)回最大量程；每取完一種母液必須換槍頭，防止交叉污染。3、每10人1組，每組選擇配1種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基配1L。以上培養(yǎng)基pH值在滅菌前調(diào)至5.8。五、作業(yè)要求：完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，回答下面的思考題1、根據(jù)以下所給母液濃度、蔗糖和瓊脂量，配制煙草愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)的培養(yǎng)基（MS1），按MS配方（MurashigeandSkoog,1962）計(jì)算各種母液吸取量或藥品的直接稱量量。2、簡述高壓蒸氣滅菌的步驟；培養(yǎng)基采用高壓蒸氣滅菌應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？

藥品名稱母液倍或母液濃度（mg/ml）配制1L培養(yǎng)基所需母液量(ml)或質(zhì)量（g）配制0.25L培養(yǎng)基所需母液量(ml)或直接稱量量（g）MS1MS2MS3大量元素10倍液

微量元素100倍液

鐵鹽200倍液