光譜檢測技術(shù)在生命科學中的應用課件

第2章光譜檢測技術(shù)在生命科學中的應用紫外透照燈1.光譜范圍和對應的檢測儀器

400nm

650nmUltraVioletVisibleNearInfrared白光透照燈、普通酶標儀、熒光化學發(fā)光酶標儀、測序儀、掃描儀顯微鏡測序儀、掃描儀凝膠圖像分析系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀、光密度掃描儀、激光掃描儀、熒光顯微鏡分光光度計、熒光分光光度計、掃描酶標儀紫外線紫外線是德國物理學家里特在1801年發(fā)現(xiàn)的，一切高溫物體，如太陽、弧光燈發(fā)出的光都含有紫外線。紫外線的作用主要是化學作用。紫外線有很強的熒光效應，能使很多物質(zhì)發(fā)出熒光。可見光

A

可

見

光主要部件日光燈管和磨砂玻璃波長可見光用于檢測凝膠和膜上的染料硝酸銀、考馬斯亮藍等及放射自顯影膠片白光透照儀主要部件光學系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：340-700nm用于各種微孔板檢測普通酶標儀Elx-800酶標儀工作原理光電倍增管計算機打印機酶標板濾光片光源Elx-808酶標儀工作原理濾光片輪鹵素燈主要部件光學系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)微量比色杯波長：230、260、280、320、562、595nm用于各種生物樣品檢測核酸蛋白檢測儀主要部件光學系統(tǒng)（光源、單色器、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：200-999nm，1nm步進用于各種微孔板檢測全波長掃描酶標儀PowerWaveHTSynergy全波長掃描酶標儀工作原理熒光技術(shù)簡介一、熒光發(fā)生過程

熒光產(chǎn)生于某些分子（通常是含多聚芳香烴的碳水化合物或雜環(huán)化合物）稱為熒光體或熒光染料。熒光探針是一個熒光體設計用于定位生物樣品的特異性區(qū)域或?qū)μ禺愋源碳ひ蜃影l(fā)生反應。熒光發(fā)生是一個3階段的過程。①激發(fā)

外源的白熾燈或激光提供的能量（hvEX）的光子被熒光體吸收，產(chǎn)生被激發(fā)的電子單峰態(tài)（S1’）。這個過程是熒光和化學發(fā)光的區(qū)別，化學發(fā)光的激發(fā)態(tài)是由化學反應產(chǎn)生的。

③熒光發(fā)射

能量（hvEM）光子被激發(fā)，熒光體回到基態(tài)S0。由于能量在激發(fā)態(tài)壽命期的部分消耗，這些光子的能量較低，因此比激發(fā)光子hvEX有更長的波長。這種由于（hvEM-hvEX）呈現(xiàn)的能量或波長的差異稱作Stokes漂移。Stokes漂移奠定了熒光技術(shù)靈敏性的基礎(chǔ)，因為它可以與激發(fā)光子在光譜上分離，而在一個較低的背景下檢測發(fā)射光子。相比較而言，吸收光分光測定法在透射光檢測時相對于較高水平的同一波長的光。

EmissionFExcitation熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式：發(fā)光ExcitationBHFTransfer熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式：發(fā)熱二、熒光光譜

熒光發(fā)生的整個過程是循環(huán)的，除非熒光體在激發(fā)態(tài)不可逆轉(zhuǎn)的破壞（一個重要的現(xiàn)象稱作光漂白），同一熒光體可以反復地激發(fā)和檢測。對于溶液中多原子分子，由hvEX和hvEM呈現(xiàn)的不連續(xù)的電子躍遷被一個較寬的能量光譜稱作熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜取代。在兩種或更多的熒光體同時檢測時，這些光譜的帶寬是非常重要的參數(shù)。除了很少的例外，一般在稀釋溶液中單種熒光體的熒光激發(fā)光譜和它的吸收光譜是相同的。在同樣條件下，由于在激發(fā)態(tài)壽命期激發(fā)能量的部分消耗，熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長是分離的。熒光發(fā)射強度是與在激發(fā)波長的熒光激發(fā)光譜振幅成比例的。三、熒光檢測熒光檢測儀器

熒光檢測系統(tǒng)的4個基本要素是：⑴激發(fā)光源，⑵熒光體，⑶將激發(fā)光子與發(fā)射光子分離的特定波長的濾光片，⑷檢測器記錄發(fā)射光子并輸出，通常是電子信號或圖像。3種主要的熒光檢測儀器提供不同的數(shù)據(jù)。熒光分光光度計：測定液體樣品（uL-mL）

熒光顯微鏡：解析熒光作為二維或三維空間位置定位功能流式細胞儀：測定流體中每個細胞的熒光，在大量樣品中進行分選并識別和定量激光掃描儀熒光信號

熒光強度的定量取決于這些參數(shù)：吸光度-由Beer-Lambert定律定義為摩爾消光系數(shù)的產(chǎn)物，光徑和稀釋濃度，染料的熒光量子的產(chǎn)量，激發(fā)光源強度和儀器熒光采集效率。在稀釋溶液或懸液中，熒光強度與這些參數(shù)成線性比例關(guān)系。當樣品吸光度在1cm光徑超過0.05時，線性關(guān)系被自身吸收和內(nèi)濾光效應扭曲。通過一個大的熒光Stokes漂移（例如分離為A1和E1）可以容易從Rayleigh散射激發(fā)光（EX）分離出熒光發(fā)射信號（S1）。標記有熒光探針的生物分子通常都含有超過1個的熒光物，使信號分離更加復雜。另一個光信號（S2）可能是背景熒光或第二個熒光探針。背景熒光

熒光檢測的靈敏性會受到背景信號的很大影響，這些背景信號來自樣品內(nèi)在組分（自發(fā)熒光）或未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的探針（試劑背景）。檢測中可以通過選擇濾光片或通過選擇更長波長吸收和發(fā)射的探針來減小E2自發(fā)熒光對E1的影響。盡管將熒光檢測帶寬變窄增加了E1和E2間的分辨力，但是會影響總的熒光檢測強度。對于細胞、組織和生物體液的自發(fā)熒光，可以采用激發(fā)光＞500nm的探針減小熒光信號失真。但是，較長波長的激發(fā)光會受到密度介質(zhì)如組織的影響而發(fā)散減弱，就需要更強穿透力的激發(fā)光。直接標記－將熒光團通過化學反應直接銜接在核酸的雙鏈或單鏈上間接標記－將帶有熒光團標記的NTP或dNTP通過酶反應摻入到新合成的核酸鏈中熒光對核酸的修飾和標記PhysicalDataforIRDye700-CDImax=680nmemission=715nm=190,000LMol-1cm-1PhysicalDataforIRDye800-CDImax=780nmemission=815nm=205,000LMol-1cm-1核酸染料IRDye結(jié)構(gòu)HybridizeLabelDNA5minFastConvenientRobustLowcostIRDyeDNADNALabeling切口平移法隨機引物摻入法逆轉(zhuǎn)錄合成摻入法AminallyldUTP與熒光團的結(jié)合間接熒光標記UniversalLinkageSystem(ULS)platinum-basedchemistry氨基或硫醇基修飾的核酸可直接連接熒光團胞嘧啶的硫化介導的熒光團標記直接熒光標記IRDye800Excitationmax=778nmEmissionmax=806nmE=180,000M-1cm-1Quantumyield=0.34Cy5.5Excitationmax=675nmEmissionmax=694nmE=250,000M-1cm-1Quantumyield=0.28蛋白染料IRDye結(jié)構(gòu)AntigenonMembrane1o1o+2oOR1o+2o1o+2o+3oIRDye800andCy5.5SecondaryandTertiaryLabeledAntibodiesLabeledAntibodies主要部件光學系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：激發(fā)波長：300-650nm發(fā)射波長：350-700nm發(fā)光波長：350-700nm用于各種微孔板檢測熒光、化學發(fā)光酶標儀Flx800Synergy主要部件共聚焦光學系統(tǒng)（激光光源、濾光片、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：激發(fā)波長：488、514、543、594、633nm發(fā)射波長：500-700nm用于玻璃載片的生物芯片檢測ScanArray激光共聚焦掃描儀ScanArray激光共聚焦原理ScanArray熒光激發(fā)顯微鏡光路圖紅外線紅外線是英國物理學家赫謝爾在1800年發(fā)現(xiàn)的。紅外線最主要的作用是熱作用。紅外線的波長較長，因此衍射現(xiàn)象比較顯著，穿透力很強。主要部件共聚焦光學系統(tǒng)（激光光源、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：激發(fā)波長：685、785nm發(fā)射波長：715、815nm用于測序紅外激光自動測序儀紅外激光自動測序儀主要部件共聚焦光學系統(tǒng)（激光光源、光電倍增管）機械運動和定位系統(tǒng)（步進馬達）自動控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長：激發(fā)波長：685、785nm發(fā)射波長：715、815nm用于雜交膜檢測紅外激光掃描儀紅外激光掃描儀原理紅外激光掃描儀熒光激發(fā)IRD700激發(fā)IRD800激發(fā)

熒光顯微鏡光路圖濾光片結(jié)構(gòu)圖熒光顯微鏡濾光片光路圖化學發(fā)光技術(shù)簡介按光譜分類：狹義：可見光（400-700nm）廣義：紫外光（10-400nm）可見光（400-700nm）紅外光（700-40000nm）光的基本知識熾熱光或白熾光(incandescence)-因熱而發(fā)光氣體激發(fā)(gasexcitation>-因電子或熱的激發(fā)而發(fā)光摩擦發(fā)光(triboluminescence)電激發(fā)光(electroluminescence)熒光(fluorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光，但光源切斷后即不再發(fā)光磷光(phosphorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光，但光源切斷后仍會持續(xù)發(fā)光化學發(fā)光(chemiluminescence>-非生物體把多余的化學能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽苌锇l(fā)光(bioluminescence)-生物體利用化學能發(fā)光發(fā)光物質(zhì)

某些熒光物質(zhì)（例如Luminol,C8H7N3O2）可將化學反應中產(chǎn)生的能量，轉(zhuǎn)化成使分子內(nèi)的電子由基態(tài)（groundstate）躍升到激發(fā)態(tài)（excitedstate），處于激發(fā)態(tài)的分子并不穩(wěn)定，將能量以光的形式釋放出來；有的光波長為可見光范圍，但占多數(shù)的是熒光（fluorescence）?；瘜W發(fā)光的原理雜交檢測中的信號物質(zhì)（非放射性標記）：核酸雜交（Southern&NorthernBlot）蛋白印跡（WesternBlot）酶聯(lián)免疫（Elisa）其他：

dot/slot雜交、原位雜交、噬菌體文庫篩選、菌落文庫（質(zhì)粒文庫）篩選…

化學發(fā)光在生物學檢測中的應用一般需要一定的發(fā)光底物及發(fā)光增強劑（如CDP-Star，461nm，藍光）,并配有各自的過氧化物酶系統(tǒng)。經(jīng)過化學發(fā)光及增強作用，將光量放大后，在X片上發(fā)光自顯影，將特異結(jié)合條帶顯示出來?；瘜W發(fā)光檢測敏感性高，除借助特殊儀器檢測外，需要在暗室進行X光片曝光，曝光時間要掌握適度以便得到最佳信號強度。此外，由于不同發(fā)光底物持續(xù)發(fā)光時間和強度不同，除了摸索曝光時間外還要注意在穩(wěn)定持續(xù)發(fā)光時間內(nèi)可以多次曝光。。

生物學中化學發(fā)光檢測原理Luminol（～430nm）CSPD發(fā)光最強最持久：CDP-Star（～460nm，藍光）Sapphire-II?發(fā)光增強劑Emerald-II?發(fā)光增強劑注：一般的試劑盒中已將發(fā)光底物與發(fā)光增強劑預先混合為發(fā)光底物Luminol幾種常用的發(fā)光底物及增強劑核酸雜交：生物素標探針－酶（AP）標生物素抗體或Strepavidin－CDP-Star底物生物素標探針－酶（AP）標生物素抗體或Strepavidin－CDPD底物生物素標探針－酶（HRP）標生物素抗體或Strepavidin－EnhancedLuminol底物熒光素標探針－酶（AP）標抗熒光素抗體－CDP-Star底物熒光素標探針－酶（HRP）標抗熒光素抗體－EnhancedLuminol底物地高辛標探針－酶（AP）標抗地高辛抗體－CDPD底物酶（專利的耐熱AP）標探針－發(fā)光底物幾種常用的試劑盒檢測原理核酸抽提電泳轉(zhuǎn)膜生物素標記探針（隨機引物法PCR摻入法）雜交、洗脫酶標生物素抗體或結(jié)合物敷育底物敷育化學發(fā)光檢測：X光片壓片－曝光－顯影－定影實驗流程

舉例NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit特點：穩(wěn)定：32P-標記的探針只能放置幾天，而生物素標記的探針可放置較長時間敏感：可檢測哺乳動物DNA中的單拷貝基因（<1pg），與同位素相當?

快速：整個檢測程序只需40分鐘（曝光時間只需1-10分鐘，需要優(yōu)化）?

發(fā)光可持續(xù)幾天，可多次曝光，以獲取最佳信號強度NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKitAmbionBioDetectTMNonisotopicDetectionKit舉例NEN公司化學熒光素/生物素標發(fā)光檢測試劑盒晶美公司RNADetector?NorthernBlottingKit

DNADetector?GenomicSouthernBlottingKitTropix（ABI）Southern-Light?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemSouthern-Star?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemAmershamAlkphosLabellingandDetectionSystemRocheDIGLuminescentDetectionKit其他產(chǎn)品酶（AP）標二抗－CDP-Star底物酶（AP）標二抗－CDPD底物生物素標一抗－酶（HRP）標生物素抗體或Strepavidin－ECL試劑ECL:EnhancedChemiluminescence，EnhancedLuminol底物檢測限：DAB顯色：對HRP敏感，1ngECL化學發(fā)光：<pgSuperSignal（PIERCE，ECL）化學發(fā)光：10-15fg蛋白雜交CSTPhototope?-HRP化學發(fā)光法Western

優(yōu)點

?

敏感?？蓹z測pg級蛋白質(zhì)。

?

快速。整個實驗過程中不超過2小時。曝光時間從數(shù)秒到10分鐘。

?

定量。

舉例蛋白雜交ECLWesternBlottingDetectionReagentsECLPlusWesternBlottingDetectionReagents（4to20-foldsensitivity）舉例AmershamECLProteinBiotinylationModule/SystemTropixWestern-Light?SystemWestern-Star?System（3-to4-foldsensitivity）酶（AP）標二抗－CDPD/CDP-Star底物舉例其他產(chǎn)品酶（AP）標二抗－CDPD/CDP-Star底物酶聯(lián)免疫四種底物及增強劑搭配方式適用于夾心法，競爭法免疫分析，DNA探針捕獲分析配有TR717化學發(fā)光酶標儀進行檢測舉例TropixELISA-LightImmunoassaySystem1.X光片壓片（傳統(tǒng)方法）但曝光時間需要摸索，壓片法有一定不便，定量也不準2.掃描儀一定波長范圍掃描3.成像儀CooledCCD4.熒光化學發(fā)光酶標儀化學發(fā)光檢測方法Typhoon?8600

Typhoon?9200

Typhoon?9210

Typhoon?9400

Typhoon?9410

舉例AmershamImaging&Analysis掃描儀Typhoon9410VariableModeImagerunitesprovenstoragephosphorautoradiographytechnologywithfour-color,non-radioactivefluorescentlabellingtechniques.ForDNA,RNA,andproteinsamples,choosefrom:storagephosphorautoradiographydirectblue-excitedfluorescence(457,488

nm)directgreen-excitedfluorescence(532

nm)directred-excitedfluorescence(633

nm)

chemiluminescenceAmershamImaging&Analysis掃描儀WhatImagingSystemdoIneed?OptionalDarkroomforFluorescenceChemiluminescenceonlyGGnSamples>15x12cmCGChemiluminescence&FluorescenceReducedBudgetHigherperformanceCG2XECG2MGUV/whitelightgelsReducedBudgetImagesonlyDGGeneToolsMCSGeneToolsMCSPGeneTools/GeneDirectoryMCSPDGGAddGelAnalysisFromGeniusSeriesGeneGnomeFromBioImagingProductLineDigiDoc-ItSystem DigitalSnapShotBioDoc-ItSystem NoComputer GDS-8000System StandardPC ChemiSystem Expression BioChemiSystem Sensitivity OptiChemiSystem DynamicRange BioMicroSystem RGBColor BioDensitySystem Scanner 舉例ChemiSystem

GeneandProteinExpressionPicogramLevelSensitivityDetection2-4TimesLongerThanFilmCooled(-35C)CCDCamera8-BitMaximumSignal-to-NoiseRatioChemiImager4400ChemiDocMultiGenius450,000pixelsBioChemiSystemGeneandProteinQuantitationMid-FemtogramLevelSensitivitySameDetectionTimeasFilmCooled(-40C)DigitalCCDCamera12,14and16-BitAcquisitionFluorChem8800VersaDoc3000440CF1.45millionpixelsOptiChemiSystemDetailedProteinQuantitationLow-FemtogramLevelSensitivityOneHalftheDetectionTimeasFilmCooled(-85C)DigitalCCDCamera14and16-BitPerformanceFujiLAS-1000VersaDoc5000LumiImager1.40millionpixelsFUJIFILMLAS-1000CCDphotoelement舉例Tropix公司是化學發(fā)光技術(shù)專業(yè)廠家，專門從事化學發(fā)光相關(guān)儀器、應用試劑的生產(chǎn)和研發(fā)。在化學發(fā)光檢測技術(shù)方面擁有355項專利。TropixTR717化學發(fā)光酶標儀（AppliedBiosystems）1.靈敏度：數(shù)字光子計數(shù)器

可檢測5×10-21摩爾AP分子，定量線性范圍達7個數(shù)量級采用光導纖維探頭和屏蔽技術(shù)，孔間信號相互干擾小于3×10-5，光電倍增管檢測器波長范圍：380nm～630nm2.靈活性

96孔或384孔微板，可編程讀板方式具有兩個RS232接口，可兼容目前市售的全自動機械手臂控溫范圍：室溫以上5℃～42℃專利的特氟?。═eflon）材質(zhì)進樣器，快速均勻混合反應液，保證結(jié)果精確性3.應用的廣泛性報告基因分析，探針雜交和免疫分析：TropixTR717化學發(fā)光酶標儀特性（AppliedBiosystems）紫外與熒光光譜在蛋白質(zhì)

研究中的應用主要內(nèi)容UV/vis

基礎(chǔ)、實驗要點、應用

Fluorescence

基礎(chǔ)、實驗要點、

常規(guī)熒光、淬滅、熒光共振能量傳遞(FRET)譜學方法10100Kcal/molBondsbreakLightusedforvisionandphotosynthesisElectromagneticspectrumNuclearspinvibrationsElectronictransitionsThelongerthewavelength,thelowertheenergy.基本原理1-LambertLawThefractionoflightabsorbedbyatransparentmediumisindependentoftheincidentintensity,andeachsuccessivelayerofthemediumabsorbsanequalfractionofthelightpassingthroughit.

Log10(I0/I)=kl基本原理2-Beer’sLawTheamountoflightabsorbedisproportionaltothenumberofmoleculesofthechromophorethroughwhichthelightpasses.

k=cDeviationsfromtheBeer-Lambertlaw強吸收

高濃度噪聲與誤差WavelengthAbsorbanceConcentrationABAB波長選擇等吸收點(Isosbesticpoint)等吸收點常作為體系中只有兩種成分(狀態(tài))的指示

可作為參比波長

若有等吸收點,則不需要為為每個譜作基線單光路雙光路雙波長二極管陣列檢測器二極管陣列光譜儀動力學實驗常規(guī)吸收光譜實驗要點樣品準備波長選擇池子選擇掃描速度選擇帶寬選擇石英、玻璃、塑料慢快若樣品不穩(wěn)定若噪聲大，分辨率低等窄寬若噪聲大合適的濃度，正確的參比紫外/可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應用濃度測定

構(gòu)象變化研究

相互作用研究蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在<250nm的遠紫外區(qū)有較大吸收

蛋白質(zhì)濃度測定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶劑吸收也較大溶劑的吸收蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250nm附近有弱吸收確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預測蛋白質(zhì)的消光系數(shù)

ProtParam:Tyr的吸收譜與pH有關(guān)pHtitrationcanbeusedtodetermine

-

whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm環(huán)境極性的影響B(tài)lueshiftofspectrainpolarsolventWeakerabsorptionofTyrinpolarsolvent蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25oC(bold);-HelixatpH10.8,25oC(dotted);-strandatpH10.8,52oC(dashed).蛋白質(zhì)折疊/變性研究熒光光譜0330TheFranck-Condonprinciple:transitionsareverticalinbothabsorptionandemissionTheFranck-Condonfactoristhesameforabsorptionandfluorescence00011003063060Exceptions:-verylonglivedS1state:emissionoccursfromadifferentgeometry.-Reactionsfromtheexcitedstate.量子產(chǎn)率F=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)

熒光強度IF=I0(1-10-cl)F

若cl很小，則近似：IF=I0(cl)FInnerfiltereffect

Innerfiltereffect所以，實驗中，A,EX<0.1RamanandRayleighScatteringTwopotentialsourcesofbackgroundradiationareRamanandRayleighscattering.Bothofthesephenomenaariseduetovibrationalchangesinducedinmoleculesbyincidentradiation.Bothcanalsobedescribedasscatteredlight.TheRamanlinesareofdifferentfrequencyfromtheincidentlightandusuallyoflongerwavelength.Rayleighradiationisscatteredlightofthesamefrequencyastheincidentlight.RayleighScattering強度與r6/4成正比不能通過減空白來消除

選擇合適的激發(fā)波長從比激發(fā)波長大(10nm)處開始收譜減少帶寬Ramanscattering因水中O-H收縮(3300cm-1):

1/

RA=1/EX–0.00033EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實驗需要恒溫2waysofmeasuringfluorescenceEmissionspectrum-excitationλconstant,measurefluorescenceintensityofemissionagainstλ,I.e.spectrumofemittedlight.Excitationspectrum–measurefluorescenceintensityatdifferentexcitationλ,similartoabsorptionspectra.ExcitationspectrumExcitationspectrumshouldcorrespondcolselywiththeabsorptionspectrumofthemoleculethatisresponsibleforthefluorescence.Excitationspectrumrevealswhetherthesampleishomogeneous,andwhetherallfluorescencefeaturesresultfromasinglemolecule.ExperimentsSpectralshifts:Intrinsic,

Extrinsic

FluorescenceFluorescencequenching:Internal,ExternalFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)Rotationofmolecules:fluorescenceanisotropyFluorescencelifetime…..ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)TrpisthedominantintrinsicfluorophoreinproteinsTrpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponsetoconformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquelysensitivetocollisionalquenching,eitherbyexternallyaddedquenchers,orbynearbygroupsintheprotein.LocalelectricfieldscausespectralshiftsGasphasemm*solventSolventcanaffectthegroundstateandexcitedstatemoleculescausingspectralshiftExample:Hbondingtotryptophan.Changesitsabsorptionbyabout10nmFluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylargeTyrfluorescence若蛋白質(zhì)只含TYR,不含TRP：

蛋白質(zhì)變性后，熒光強度明顯增強。GFPisisolatedfromthePacificjellyfishAequoreavictoriaandnowplayscentralrolesinbiochemistryandcellbiologyduetoitswidespreaduseasaninvivoreporterofgeneexpression,celllineage,protein-proteininteractionsandproteintrafficking

GFPcanbefusedtoanotherproteineitherN-orC-terminally.ThisisduetothefactthatbothterminiofGFPappearratherflexibleonthesurfaceofthebeta-can,sothatGFP'sstructureisnotsignificantlydistortedordestroyedbythefusedprotein.RibbondiagramoftheGreenFluorescentProtein(GFP)drawnfromthewild-typecrystalstructure.Theburiedchromophore,whichisresponsibleforGFP'sluminescence,isshowninfullatomicdetail.GreenFluorescentProtein(GFP)Differentcolourformsof

GFPAdditionallyseveraldifferentcolourformsof

GFP

havebeenproduced.

blue,

cyan,

green,and

yellow

FPorBFP,CFP,GFPandYFP.Fluorescenceemissionspectraofequalconcentrationsof1,8-ANSinethanol:watermixtures.Thelabelsadjacenttoeachcurveindicatethepercentageofethanolinthesolventmixture.ProteinExtrinsicfluorescenceANS(1-anilinonaphthalene-8-sulfonicacid)1-苯胺基萘-8-磺酸strongfluorescenceenhancementwhenitsexposuretowaterisloweredFluorescenceenhancementof1,8-ANS,uponbindingtoprotein.Theimageshowsaqueoussolutionsof1,8-ANSexcitedbyultravioletlight.Additionofprotein(bovineserumalbumin)tothesolutioninthecuvetteontheleftresultsinintensebluefluorescence.Thefluorescenceofuncomplexedfreedyeinthecuvetteontherightisnegligibleincomparison.1,8-ANSisasensitiveprobeforpartiallyfoldedintermediatesinprotein-foldingpathways.MoltenglobuleintermediatesarecharacterizedbyparticularlyhighANSfluorescenceintensitiesduetotheexposureofhydrophobiccoreregionsthatareinaccessibletothedyeinthenativestructure.ANSbindingofsHSP16.5inGdnHCl

TitrationofANSfluorescenceat475nm

Haemoglobinisacomplexofasmallprostheticgroupwiththeproteinapohaemoglobin.TheextrinsicfluorANSfluoresceswhenaddedtosolutionsofapohaemoglobinbutnotwithhaemoglobin.Theadditionofhaemtotheapohaemoglobin-ANScomplexeliminatesthefluorescencebydisplacingANS.ThistellsusthatANSandthehaemgroupbindtothesamesite.SinceANSisonlyfluorescentinhighlynon-polarenvironments,thehaemmustbindtoahighlynon-polarsite.ThiswouldgivevaluablecluesintheinterpretationofX-raydiffractionpatterns.E.g.youwouldknowthatacertainconfigurationofaminoacidscouldbethepointofinteractionbetweenhaemandproteinwhenbuildingthestructure.ExtrinsicfluorescenceexamplesFluorescenceQuenchingInternalquenchingduetointrinsicstructuralfeaturee.g.structuralrearrangement.Externalquenchinginteractionoftheexcitedmoleculewithanothermoleculeinthesampleorabsorptionofexcitingoremittedlightbyanotherchromophoreinsample.IntramolecularquenchingTyroftenisquenchedbynearbytryptophanesTrpfluorescencecanbequenchedbyneighbouringprotonatedacidgroups.IfthepKmeasuredbymonitoringtrpfluorescenceisthesameasthepKforaknownionisablegroup(e.g.acarboxyl)thenthegroupmustbenearthetrp.ExternalquenchingAcrylamide,I-,Cs+Stern-VolmerequationFluorescencequenchingisafunctionof:TheexcitedstatelifetimeThediffusion-limitedquenchingconstantTheconcentrationofthequencherTheSternVolmerslope:

KSV=skQF0/F

=1+tskQ[Q]Stern-VolmerequationAsafirstproximationthevalueofKSVrevealsthedegreeOfexposuretothesolventofaTrpresidue.,0M,1M,2M,3M,4M,5M,6MStern-VolmerplotatvariousGdnHClconcentrationsAcrylamidequenchingofTrpfluorescence

Stern-Volmerconstants

FluorescenceResonanceEnergyTransferKnownasfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)orF?rsterenergytransfer.Itistheradiationlesstransferofexcitationenergyfromadonortoanacceptor.Animportantconsequenceofthistransferisthatthereisnoemissionoflightbythedonor.Theacceptormayormaynotbefluorescent.FRETisadistance-dependentinteractionwheretheenergytransferoccurstypicallyoveradistanceof1-10nm.ThedistancedependentnatureofFRETishighlightedbythefactthatitisproportionaltotheinversesixthpoweroftheintermolecularseparation.

Ifthefluorophores(extrinsicorintrinsic)haveuniquelocationswithintheproteinorcomplex,itispossibleforemissionlightenergyfromAtobeabsorbedbyBandtobeemittedaspartofB’semissionspectrumA/QFluorAλ2λ1AbsorbanceemissionA/Qλ(nm)FluorBλ2λ3AbsorbanceemissionFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)FRETisdependentonthedistance,R,betweenthetwofluors.Usedtomeasuredistancesinproteins,membranes,¯omolecularassemblies10to80?apart.Efficiencyoftheenergytransfer(E)fromdonortoacceptor(AtoB)definedbyE=R06

R06+R6

R=distancebetweenA&B,R0isaconstantcalculatedfromabsorptionandemissionspectra.Ecanbecalculatedfromfluorescenceintensity(F)

E=Fda/FdFda=Finthepresenceofacceptor,Fd=Fintheabsenceofacceptor.OnceEisknown,Rcanbecalculatedfromthefirstequation

ifR0isknown.FRETisusedasa‘spectroscopicruler’theC-terminalsubdomainofthemoleculeformsanensembleofcompactlooselyfoldedconformationswithnative-likefeatures.FRET應用實例IntramolecularandintermolecularFRET.(a)IntramolecularFRETcanoccurwhenboththedonorandacceptorchromophoresareonthesamehostmolecule,whichundergoesatransition,forexample,between‘open’and‘closed’conformations.IneachsquareboxcorrespondingtoCFPorYFP(shownincyanoryellow,respectively),adiagonallinerepresentsthechromophore.TheamountofFRETtransferredstronglydependsontherelativeorientationanddistancebetweenthedonorandacceptorchromophores:theparallelorientationandtheshorterdistance(<100?)generallyyieldlargerFRET.(b)IntermolecularFRETcanoccurbetweenonemolecule(proteinA)fusedtothedonor(CFP)andanothermolecule(proteinB)fusedtotheacceptor(YFP).Whenthetwoproteinsbindtoeachother,FREToccurs.Whentheydissociate,FRETdiminishes.FRETimagingmicroscopyexperiment.InFRETexperiments,asingletransfection(intramolecularFRET)orco-transfection(intermolecularFRET)oftheconstructsmustfirstbeperformed.TheoccurrenceofFR