微生物菌種課件

第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》1《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育發(fā)酵工程工業(yè)生產(chǎn)水平的三個決定要素生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵和提取工藝條件生產(chǎn)設(shè)備獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實現(xiàn)高水平微生物工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié).《發(fā)酵工程》第二章微生物2第一節(jié)菌種來源工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類發(fā)酵工業(yè)上常見的微生物有細菌、酵母、霉菌和放線菌?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第一節(jié)菌種來源工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類《發(fā)酵工程》3細菌醋酸桿菌（Acetobacter），用于生產(chǎn)醋酸和維生素C。假單胞菌(Pseudomonas)，熒光假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基D-葡萄糖酸。乳酸菌（Lactobacillus），發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。大腸桿菌（E.coli），生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、蘇氨酸和纈氨酸?？莶菅挎邨U菌生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5’-肌苷酶等。梭狀芽孢桿菌生產(chǎn)丙酮-丁醇。北京棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育細菌醋酸桿菌（Acetobacter），用于生產(chǎn)醋酸和維生4酵母菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：發(fā)面和釀酒及分子生物學(xué)用。假絲酵母屬（Candida）：生產(chǎn)SCP。漢遜氏酵母屬：產(chǎn)乙酸乙酯。畢赤酵母屬（Pichia）：工業(yè)污染菌。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育酵母菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisi5霉菌曲霉屬（Aspergillus）：黑曲霉（A.niger）生產(chǎn)檸檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果膠酶、單寧酶等；米曲霉（A.oryzae）用于釀酒和L-乳酸生產(chǎn)。青霉屬（Penicillum），生產(chǎn)青霉素，桔青霉（P.citrinum）可產(chǎn)生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個單核苷酸。根霉屬（Rhizopus）用于米酒和黃酒生產(chǎn)，還用于淀粉糖化菌、有機酸發(fā)酵及甾體轉(zhuǎn)化。毛霉（Mucor）產(chǎn)生蛋白酶，生產(chǎn)腐乳、醬油，進行甾體轉(zhuǎn)化?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育霉菌曲霉屬（Aspergillus）：黑曲霉（A.nige6放線菌最大的經(jīng)濟價值在于產(chǎn)生多種抗生素鏈霉菌（Streptomyces）《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）

真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源放線菌最大的經(jīng)濟價值在于產(chǎn)生多種抗生素《發(fā)酵工程》7食用菌和藻類《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育食用菌和藻類《發(fā)酵工程》第8工業(yè)微生物來源想菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。從自然界采集分離。從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育工業(yè)微生物來源想菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株9微生物菌種的選擇性分離工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物；有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強；遺傳性能要相對穩(wěn)定；不易感染它種微生物或噬菌體；產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）；生產(chǎn)特性要符合工藝要求?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育微生物菌種的選擇性分離工業(yè)化菌種的要求《發(fā)酵工程》10菌種分離的一般過程土樣的采取→富集→分離→目的菌的篩選如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育菌種分離的一般過程土樣的采取→富集→分離→目的菌的篩選11

調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗方案設(shè)計

采樣第一次增殖培養(yǎng)第一次平板分離第二次增殖培養(yǎng)第二次平板分離增殖條件探索根據(jù)實際情況進行定量或半定量測定第一次原種斜面第二次原種斜面初篩（1株1瓶）定量或半定量測定篩選工作程序調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗方案設(shè)計采樣第一次增殖培養(yǎng)12第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種斜面再復(fù)篩種子培養(yǎng)初步工藝條件摸索較優(yōu)菌株1株3-5瓶保藏及進一步做生產(chǎn)性能試驗或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗和毒性試驗第三次菌種保藏第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種13分離與篩選的設(shè)計要求在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標：1、菌的營養(yǎng)特征一般要求采用廉價的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長溫度3、菌的穩(wěn)定性4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育分離與篩選的設(shè)計要求在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標：14較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理條件、季節(jié)）食品、海水、動物、植物、極端環(huán)境根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型采樣森林土中有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育采樣時要注意的問題較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土15富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件（加熱、膜過濾等），進行培養(yǎng)。目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分類學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育富集的三種方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集16定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫17目的菌的分離和篩選

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育目的菌的分離和篩選從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的18透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；

能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育透明圈法分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪19

土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在20

分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈。透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的如何分離磷細菌？《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩21變色圈法

對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出來；《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育變色圈法對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，22用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅～黃.6.8～8.0.）指示菌落周圍呈紅色圈《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物23《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》第二章微生物24生長圈法

通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌將待檢菌涂布于高濃度工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈

工具菌（指示菌）是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌25抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的抗生素產(chǎn)生菌；因此，設(shè)計一個準確、快速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計，篩選1萬個26抗生素產(chǎn)生菌的分離抑菌圈法、擴散法、生物自顯影法等試驗菌的選擇是關(guān)鍵（關(guān)系到靈敏度、活性、抗菌譜等）采用聯(lián)合試驗菌（枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌）分離到黃霉素采用專一性強的篩選技術(shù)也是檢出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用機制相關(guān)的酶、酶抑制劑、激活劑等建立的篩選技術(shù)如棒酸（clavulanicacid）的發(fā)現(xiàn)：通過鑒定氨芐青霉素和待測樣品對-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌克雷氏菌的協(xié)同抑制作用《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抗生素產(chǎn)生菌的分離抑菌圈法、擴散法、生物自顯影法等試驗菌的選27抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)

大部分具有抗菌或抗真菌的活性

現(xiàn)發(fā)展出利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法，如生化誘導(dǎo)分析法《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用28酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離某些酶與病理相關(guān)如果某種化合物能在體外抑制某關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)有藥理作用選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶作為靶酶

靶區(qū)靶酶抗高血壓血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂癥縮合酶抗組氨組氨酸脫羧酶、組氨-N-甲基轉(zhuǎn)移酶《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離某些酶與病理相關(guān)如果某種化合29生長因子產(chǎn)生菌的分離

通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺陷型菌株的生長，來檢測生長因子產(chǎn)生菌。分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測菌的生長圈影印到能支持生長因子產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長因子缺陷型菌株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育生長因子產(chǎn)生菌的分離通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺30第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育菌種選育是應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。微生物育種的方法包括自然育種、誘變育種、細胞工程育種和DNA重組技術(shù)育種等?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育菌種選育是應(yīng)用微生物遺傳和變異理論31自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育自然突變兩種情況：

生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降對生產(chǎn)有益的：生產(chǎn)性能提高自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)32制備單孢子（單細胞）懸液適當稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進行生產(chǎn)能力測定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育制備單孢子（單細胞）懸液自然選育的一般程序《發(fā)酵工程》33

自然選育簡單易行，可以達到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。自然選育的最大缺點是效率低、進展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育自然選育簡單易行，可以達到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)34

誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對象細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝。

目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時的效價僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變35原始菌株（出發(fā)菌株）活細胞計數(shù)誘變劑處理活細胞計數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原始菌株（出發(fā)菌株）活細胞計數(shù)誘變劑處理活細胞計數(shù)中間培養(yǎng)突361、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1）選擇對誘變劑敏感性強、變異幅度大的菌株作為出發(fā)菌株。2）最好選用已經(jīng)過生產(chǎn)選育的自發(fā)突變菌株。3）采用具有有利性狀的菌株作為親本，如生長速度快，營養(yǎng)要求低等。4）由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會對其它誘變因素的敏感性提高，故有時可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株作為出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌的誘變中，失去（黃色）色素的變異菌株作為出發(fā)菌株則產(chǎn)量會不斷提高。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育1、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1）選擇對誘變劑敏感372、單細胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細胞或單孢子懸液進行誘變處理。因為1）分散狀態(tài)的細胞可均勻地接觸誘變劑；2）可避免長出不純的菌落

處理前，細胞應(yīng)盡可能達到同步生長狀態(tài)，

細胞菌齡一般在對數(shù)期，霉菌的菌絲一般是多核的，所以對霉菌的處理一般應(yīng)采用孢子懸浮液。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育2、單細胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細38若在處理前細胞進行前培養(yǎng)，則變異率可大大提高。同步化前培養(yǎng)的具體做法：

接種培養(yǎng)24h的斜面入50ml基本培養(yǎng)基中，37oC振蕩培養(yǎng)16h，然后在6oC放置1h，以得到同步生長和分裂。將菌體離心并懸浮于營養(yǎng)豐富的前培養(yǎng)基中，37oC振蕩培養(yǎng)30-50min。立即降至2oC保藏10min，再離心洗滌兩次，懸浮于冷生理鹽水中。經(jīng)分散、過濾、調(diào)整細胞密度，制備成菌懸液，供處理用?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育若在處理前細胞進行前培養(yǎng)，則變異率可大大提高。同步化前培養(yǎng)393、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。如紫外線、X-射線、-射線、快中子、超聲波等硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺、ICR類等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育3、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因40紫外線(Uv)使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)用較廣對誘變最有效的波長是260nm左右(253-265nm)作用機制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性,造成菌體變異甚至死亡.《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育紫外線(Uv)使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)41快中子

中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)幾乎完全是由質(zhì)子造成的。中子分為快中子和慢中子。快中子的能量為0.2-10百萬電子伏特，慢中子能量為1/4至100電子伏特。慢中子的效應(yīng)同射線、射線和電子等照射時引起的基本相同，快中子較X射線、射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點突變和染色體畸變。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育快中子中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或42氮芥

氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一般使用的是其鹽酸鹽。應(yīng)用時先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉其作用，釋放出氮芥子氣，再與細胞起作用而造成變異。氮芥的誘變機制是它能引起染色體畸變。是被使用得最早的一種誘變劑?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育氮芥氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一43亞硝酸

常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。

亞硝酸A——H（次黃嘌呤）C——UG——X（黃嘌呤）

亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2。所以，可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，使先生成亞硝酸然后再使用?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育亞硝酸常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基44亞硝基胍(NTG)

是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%至80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超級誘變劑之稱。在緩沖液中較難溶解，而在甲酰胺中溶解度較大，因此用甲酰胺溶解，可以提高處理濃度。通常在濃度為30ug/ml、溫度為28oC和時間為60min的條件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育亞硝基胍(NTG)是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷45劑量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個關(guān)鍵問題。對一般微生物而言，誘變率往往隨誘變劑劑量的增高而增高，但達到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降。目前的處理劑量已從以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的劑量，特別是對于經(jīng)過一再誘變的高產(chǎn)菌株。劑量似乎也不宜過低，因為在使用高劑量誘變時，除個別核被誘發(fā)變異外，還可以使其它的核破壞致死，最終能形成較純的變異菌落；另外，高劑量可能引起遺傳物質(zhì)的巨大損傷，產(chǎn)生回復(fù)突變少，促使變異后菌株的穩(wěn)定。

凡既能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動的劑量就是合適劑量?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育劑量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個關(guān)46處理方法單一誘變劑處理復(fù)合處理1）兩種或多種誘變劑先后使用2）同一誘變劑重復(fù)處理3）兩種或多種誘變劑同時使用《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育處理方法單一誘變劑處理1）兩種或多種誘變劑先47菌種單獨處理誘變劑突變率（%）復(fù)合處理誘變劑突變率（%）土曲霉紫外線X-射線21.319.7紫外線+X-射線42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外線不明顯4.7氮芥+紫外線11.0鏈霉菌紫外線-射線31.035.0紫外線+-射線43.6金色鏈霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外線6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外線硫酸二乙酯+紫外線26.635.9

誘變劑的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育菌種單獨處理484、誘變處理后的后培養(yǎng)表型遲延現(xiàn)象

生理性分離性

遺傳物質(zhì)經(jīng)誘變處理后發(fā)生的突變，必須經(jīng)復(fù)制才能表現(xiàn)出來。研究表明，誘變后的一小時內(nèi)必須進行新的蛋白質(zhì)合成，這個變異才有效。

因此必須在完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)才能穩(wěn)定變異，使菌株表現(xiàn)出高的突變頻率。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育4、誘變處理后的后培養(yǎng)表型遲延現(xiàn)象生理性分49A

不經(jīng)液體后培養(yǎng)B經(jīng)液體后培養(yǎng)《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育A不經(jīng)液體后培養(yǎng)B經(jīng)液體后培養(yǎng)505、變異菌株的篩選由于經(jīng)誘變處理后提高產(chǎn)量的變異株仍屬少數(shù)，所以必須經(jīng)過大量的篩選工作，才能得到需要的菌株。

初篩和復(fù)篩《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育5、變異菌株的篩選由于經(jīng)誘變處理后提高產(chǎn)量的變異株仍屬少數(shù)，51

在初篩過程中，一般采用觀察初篩菌落在平板上的生理效應(yīng)所呈現(xiàn)的變色圈、透明圈、生長圈或抑菌圈的大小來進行初步測定。初篩

要求迅速地從大量菌株中挑選出較好的一些菌，主要應(yīng)著眼于盡量擴大挑選范圍。例如，測定突變株淀粉酶活力，可把待測菌株的培養(yǎng)液以相同大小和條件浸泡的濾紙片點植于淀粉平板上，經(jīng)培養(yǎng)后滴加碘液再仔細觀察并測定其透明圈的大小。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育在初篩過程中，一般采用觀察初篩菌落在平板上的生理效應(yīng)52

部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性，可在初篩時加以利用。赤霉素產(chǎn)生菌色素暗紅加深，產(chǎn)量上升紅霉素產(chǎn)生菌有顏色產(chǎn)量下降灰黃霉素產(chǎn)生菌野生菌株高產(chǎn)菌株堿性脂肪酶產(chǎn)生菌野生菌株高產(chǎn)變異株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生53復(fù)篩

在初篩縮小了的范圍中選出產(chǎn)量最高的1-2個菌株，主要著眼于在接近生產(chǎn)條件的情況下精確地測定出菌株的生產(chǎn)性狀。

復(fù)篩一般是將初篩所得到的菌株接種到三角瓶中做搖瓶培養(yǎng)，然后對其培養(yǎng)液進行定量分析測試?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育復(fù)篩在初篩縮小了的范圍中選出產(chǎn)量最高的54設(shè)計或采用高效篩選方案或方法一個出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理設(shè)計或采用高效篩選方案或方法一個出誘變劑處理選出200個單初55

經(jīng)誘變后，菌種的性能有可能發(fā)生各種各樣的變異，如營養(yǎng)缺陷、抗性突變、形態(tài)變異、生長溫度變異等，這些變異均可用各種方法篩選出來。幾種重要突變株的篩選《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育經(jīng)誘變后，菌種的性能有可能發(fā)生各種各樣的變異，如營養(yǎng)缺561、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選◆

氨基酸、核苷酸生產(chǎn)菌株等◆

影印培養(yǎng)法、夾層培養(yǎng)法、逐個檢出法等《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育1、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選◆氨基酸、核苷酸生產(chǎn)菌株572、抗性突變株的篩選抗生素金屬離子溫度噬菌體◆

提高某代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量如抗氯霉素的解烴棒桿菌突變株比親株產(chǎn)生的棒桿菌素高3倍。（氯霉素是棒桿菌素的結(jié)構(gòu)類似物）又如，蠟狀芽孢桿菌的抗利福平無芽孢突變株的-淀粉酶產(chǎn)量提高了7倍?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育2、抗性突變株的篩選抗生素◆提高某代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量如抗583、溫度敏感突變型篩選TS（Ts;ts）突變株（temperature-sensitivemutant）

指僅在某個溫度范圍內(nèi)顯示與野生型不同表型的突變型。

高溫敏感突變型：在某個溫度以上顯示出和野生型不同表型。

低溫敏感突變型：在某個溫度以下顯示出與野生型不同表型。如果發(fā)生這類突變的基因控制的特性是生長繁殖不可缺少的，那么就會形成條件致死突變型。溫度敏感突變型（高溫）是最常用的一類條件致死突變型基因功能研究、育種《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育3、溫度敏感突變型篩選TS（Ts;ts）突變株（temp59許可溫度(permissivetemperature)

保持原來正常性狀的溫度限制性溫度(restrictivetemperature〉非許可溫度

(non-permissivetemperature)

顯現(xiàn)突變型性狀的溫度TS突變株在許可溫度下能正常生長，其表型和野生型沒有區(qū)別；在非許可溫度下不能生長或微弱生長，表性與野生型不同?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育許可溫度(permissivetemperature)TS60原因:TS突變株的一種重要酶蛋白（例如DNA聚合酶、氨基酸活化酶等）在某種溫度下呈現(xiàn)活性，而在另一種溫度下卻是鈍化的。原因是由于這些酶蛋白的肽鏈中更換了幾個氨基酸，從而降低了原有的抗熱性。TS突變株在代謝過程中的各個環(huán)節(jié)，如核酸合成、蛋白質(zhì)合成、細胞膜或細胞分裂過程中，某種酶的合成或功能由溫度所控制例如，有些大腸桿菌菌株可生長在37℃下，但不能在42℃生長；T4噬菌體的幾個突變株在25℃下有感染力，而在37℃下則失去感染力等?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原因:《發(fā)酵工程》第二章61菌懸液涂布在完全培養(yǎng)基上，置于許可溫度下培養(yǎng)影印到一個完全培養(yǎng)基和兩個基本培養(yǎng)基平板上取基本培養(yǎng)基一皿為一組，置于許可溫度下培養(yǎng)；另取完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基各一皿，置于非許可溫度下培養(yǎng)《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育菌懸液涂布在完全培養(yǎng)基上，置于許可溫度下培養(yǎng)影印到一個完全培62微生物菌種課件63

在許可溫度的基本培養(yǎng)基上生長，而非許可溫度的基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上都不生長；

根據(jù)菌落生長情況，可分兩大類：1）非必需基因突變形成的溫度敏感突變株

在許可溫度下的基本培養(yǎng)基上生長，非許可溫度的基本培養(yǎng)基上不生長而在完全培養(yǎng)基上生長。是一類突變引起失去單一酶但可以補償功能的TS突變株。2）必需基因突變引起TS突變株在許可與非許可溫度下基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上全部生長，則為野生型菌株?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育在許可溫度的基本培養(yǎng)基上生長，而非許可溫度的基本培養(yǎng)644、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選反饋抑制反饋阻遏→酶的活性→酶的合成調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因結(jié)構(gòu)基因突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力，但仍具有催化活性解除反饋阻遏解除反饋抑制《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育4、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選反饋抑制→酶的活性調(diào)節(jié)基因或操縱基65通常抗反饋抑制和抗反饋阻遏突變株是通過抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選出來的◆

結(jié)構(gòu)類似物與末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，能與阻遏蛋白或變構(gòu)酶結(jié)合，阻止產(chǎn)物的合成，引起反饋調(diào)節(jié)作用；但不能代替末端產(chǎn)物參與生物合成◆

抗結(jié)構(gòu)類似物突變株即使在結(jié)構(gòu)類似物存在下，仍可合成末端產(chǎn)物《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育通?？狗答佉种坪涂狗答佔瓒敉蛔冎晔峭ㄟ^◆結(jié)構(gòu)類似物與末端66末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物可過量生產(chǎn)的產(chǎn)物對氨基苯甲酸磺胺對氨基苯甲酸精氨酸D-豆氨酸，D-精氨酸精氨酸色氨酸5-甲基色氨酸色氨酸葡萄糖2-脫氧葡萄糖-葡萄糖苷酶《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物可過量生675、組成型突變株的篩選

組成酶酶誘導(dǎo)酶◆

調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，都有可能獲得組成型突變株◆篩選原則設(shè)計某種有利于組成型菌株生長，并限制誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成組成型菌株生長優(yōu)勢或適當?shù)姆直鎯深惥涞姆椒ǎx出組成型突變株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育5、組成型突變株的篩選組成酶◆調(diào)68

例如可在培養(yǎng)基中加入抑制誘導(dǎo)酶合成的物質(zhì)，使組成型菌株處于選擇優(yōu)勢以-半乳糖苷酶為例：含有乳糖的培養(yǎng)基中加入抑制物鄰硝基--D-巖藻糖苷-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此誘導(dǎo)型菌株不能利用乳糖，故不能生長而組成型菌株能合成該酶，利用乳糖生長，使組成型菌株被富集《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育例如可在培養(yǎng)基中加入抑制誘導(dǎo)酶合成的物質(zhì)，使69◆

通過顯色反應(yīng)可在平板上識別組成型菌株◆

在不含誘導(dǎo)物，但含有經(jīng)酶解后能呈現(xiàn)顏色變化的底物的平板上進行培養(yǎng)，可方便快速地檢出組成型菌株如，用鄰硝基苯乳糖苷作為底物篩選-半乳糖苷酶組成型突變株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育◆通過顯色反應(yīng)可在平板上識別組成型菌株◆在不含70雜交育種雜交育種一般是指人為利用真核微生物的有性生殖或準性生殖，或原核微生物的接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等過程，促使兩個具有不同遺傳性狀的菌株發(fā)生基因重組，以獲得性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育雜交育種雜交育種一般是指人為利用真核微生物的有性生殖或準性生71原生質(zhì)體融合的概念

——就是把兩個親本的細胞分別去掉細胞壁，獲得原生質(zhì)體，將兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細胞質(zhì)融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原生質(zhì)體融合的概念——就是把兩個親本的細胞分別去掉細721、大幅度提高親本之間重組頻率。原生質(zhì)體剝離了細胞壁，去除了細胞間物質(zhì)交換的主要障礙，也避免了修復(fù)系統(tǒng)的制約；再加上促融劑的誘導(dǎo)作用，重組頻率顯著提高。2、擴大重組的親本范圍。原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)點

如天藍色鏈霉菌的種內(nèi)重組頻率可達20%去除了細胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。3、原生質(zhì)體融合時親本整套染色體參與交換，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀機會更大。4、可以和其它育種方法相結(jié)合，把由其他方法得到的優(yōu)良形狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育1、大幅度提高親本之間重組頻率。原生質(zhì)體剝離了細胞壁，去除73原生質(zhì)體融合的基本過程一般步驟《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原生質(zhì)體融合的基本過程一般步驟《發(fā)酵工程》74具體步驟：直接親本及其遺傳標記選擇雙親本原生質(zhì)體制備與再生親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合融合重組體（融合子）分離遺傳特性分析與測定《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育具體步驟：直接親本及其遺傳標記選擇《發(fā)酵工程》75１、直接親本及其遺傳標記的選擇◆

所用的親株均要有一定的遺傳標記，以便于選擇◆

一般以營養(yǎng)缺陷型和抗藥性等為標記◆

目的基因并不一定與標記基因連鎖，但確實可大大減少工作量，提高育種效率◆

優(yōu)良性狀《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育１、直接親本及其遺傳標記的選擇◆所用的親株均要有一定的76２、原生質(zhì)體的制備與再生多用酶解法

細菌、放線菌溶菌酶酵母菌蝸牛酶霉菌纖維素酶等《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育２、原生質(zhì)體的制備與再生多用酶解法《發(fā)酵工程》77影響原生質(zhì)體制備的因素：1）菌體的預(yù)處理在使用脫壁酶處理以前，先用某些化合物對菌體進行預(yù)處理，有利于原生質(zhì)體制備。如EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素、D-環(huán)絲氨酸等2）菌體的培養(yǎng)時間一般選擇對數(shù)期后期的菌體進行酶處理3）酶濃度一般來說，酶濃度增加，原生質(zhì)體的形成率增大；超過一定范圍，則原生質(zhì)體形成率提高不明顯。酶濃度過高，往往導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率降低建議以使原生質(zhì)體形成率和再生率的乘積達到最大時的酶濃度作為最適酶濃度。4）酶解溫度◆溫度對酶解作用有雙重影響◆一般20～40℃5）酶解時間充足的酶解時間是原生質(zhì)體制備的必要條件；但太長會使再生率顯著降低6）滲透壓穩(wěn)定劑必須在高滲或等滲溶液中對不同菌種，應(yīng)采用不同的穩(wěn)定劑

細菌、放線菌一般采用蔗糖、丁二酸鈉酵母采用山梨醇、甘露醇霉菌采用KCl和NaCl濃度一般0.3～0.8mol/L《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育影響原生質(zhì)體制備的因素：1）菌體的預(yù)處理在使用脫壁酶處理以前78原生質(zhì)體再生◆

再生是原生質(zhì)體育種的一個十分關(guān)鍵的問題◆

不同微生物，即使是非常近似的種，所要求的再生的最適條件往往不同《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原生質(zhì)體再生◆再生是原生質(zhì)體育種的一個十分關(guān)鍵的問題◆79融合子的檢出◆

在選擇培養(yǎng)基上檢出如利用營養(yǎng)缺陷型為遺傳標記，可在基本培養(yǎng)基上篩選◆

原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生兩種情況

一是真正的融合，即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體；二是暫時的融合，形成異核體。

兩者均可在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定，后者不穩(wěn)定，會分離成親本類型，有的甚至可以異核狀態(tài)移接幾代。因此要獲得真正的融合子，必須在融合體再生后，進行幾次自然分離選擇，才能確定?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育融合子的檢出◆在選擇培養(yǎng)基上檢出◆原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)80菌種保藏原理

主要是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第三節(jié)菌種退化和菌種保藏菌種保藏原理主要是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，81保藏方法

斜面冰箱保藏法4C；3-6個月沙土管保藏法產(chǎn)孢子或芽孢微生物，1年菌絲速凍法甘油或二甲基亞砜作為保護劑，-20C石蠟油封存法1年左右真空冷凍干燥保藏法任何微生物；一般5年以上液氮超低溫保藏法-196C；保護劑；保存期長《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育保藏方法斜面冰箱保藏法4C；3-6個月《82第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》83《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育發(fā)酵工程工業(yè)生產(chǎn)水平的三個決定要素生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵和提取工藝條件生產(chǎn)設(shè)備獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是實現(xiàn)高水平微生物工程工業(yè)生產(chǎn)的第一環(huán)節(jié).《發(fā)酵工程》第二章微生物84第一節(jié)菌種來源工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類發(fā)酵工業(yè)上常見的微生物有細菌、酵母、霉菌和放線菌。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第一節(jié)菌種來源工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類《發(fā)酵工程》85細菌醋酸桿菌（Acetobacter），用于生產(chǎn)醋酸和維生素C。假單胞菌(Pseudomonas)，熒光假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基D-葡萄糖酸。乳酸菌（Lactobacillus），發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。大腸桿菌（E.coli），生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。枯草芽孢桿菌生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5’-肌苷酶等。梭狀芽孢桿菌生產(chǎn)丙酮-丁醇。北京棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育細菌醋酸桿菌（Acetobacter），用于生產(chǎn)醋酸和維生86酵母菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：發(fā)面和釀酒及分子生物學(xué)用。假絲酵母屬（Candida）：生產(chǎn)SCP。漢遜氏酵母屬：產(chǎn)乙酸乙酯。畢赤酵母屬（Pichia）：工業(yè)污染菌?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育酵母菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisi87霉菌曲霉屬（Aspergillus）：黑曲霉（A.niger）生產(chǎn)檸檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果膠酶、單寧酶等；米曲霉（A.oryzae）用于釀酒和L-乳酸生產(chǎn)。青霉屬（Penicillum），生產(chǎn)青霉素，桔青霉（P.citrinum）可產(chǎn)生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個單核苷酸。根霉屬（Rhizopus）用于米酒和黃酒生產(chǎn)，還用于淀粉糖化菌、有機酸發(fā)酵及甾體轉(zhuǎn)化。毛霉（Mucor）產(chǎn)生蛋白酶，生產(chǎn)腐乳、醬油，進行甾體轉(zhuǎn)化?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育霉菌曲霉屬（Aspergillus）：黑曲霉（A.nige88放線菌最大的經(jīng)濟價值在于產(chǎn)生多種抗生素鏈霉菌（Streptomyces）《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）

真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源放線菌最大的經(jīng)濟價值在于產(chǎn)生多種抗生素《發(fā)酵工程》89食用菌和藻類《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育食用菌和藻類《發(fā)酵工程》第90工業(yè)微生物來源想菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。從自然界采集分離。從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育工業(yè)微生物來源想菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株91微生物菌種的選擇性分離工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物；有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強；遺傳性能要相對穩(wěn)定；不易感染它種微生物或噬菌體；產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）；生產(chǎn)特性要符合工藝要求。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育微生物菌種的選擇性分離工業(yè)化菌種的要求《發(fā)酵工程》92菌種分離的一般過程土樣的采取→富集→分離→目的菌的篩選如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育菌種分離的一般過程土樣的采取→富集→分離→目的菌的篩選93

調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗方案設(shè)計

采樣第一次增殖培養(yǎng)第一次平板分離第二次增殖培養(yǎng)第二次平板分離增殖條件探索根據(jù)實際情況進行定量或半定量測定第一次原種斜面第二次原種斜面初篩（1株1瓶）定量或半定量測定篩選工作程序調(diào)查研究（包括資料查閱）試驗方案設(shè)計采樣第一次增殖培養(yǎng)94第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種斜面再復(fù)篩種子培養(yǎng)初步工藝條件摸索較優(yōu)菌株1株3-5瓶保藏及進一步做生產(chǎn)性能試驗或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗和毒性試驗第三次菌種保藏第三次平板分離第三次原種斜面復(fù)篩第四次平板分離不純第四次原種95分離與篩選的設(shè)計要求在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標：1、菌的營養(yǎng)特征一般要求采用廉價的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長溫度3、菌的穩(wěn)定性4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育分離與篩選的設(shè)計要求在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標：96較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理條件、季節(jié)）食品、海水、動物、植物、極端環(huán)境根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型采樣森林土中有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育采樣時要注意的問題較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土97富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件（加熱、膜過濾等），進行培養(yǎng)。目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分類學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育富集的三種方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集98定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫99目的菌的分離和篩選

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育目的菌的分離和篩選從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的100透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；

能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育透明圈法分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪101

土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在102

分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈。透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的如何分離磷細菌？《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩103變色圈法

對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出來；《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育變色圈法對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，104用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅～黃.6.8～8.0.）指示菌落周圍呈紅色圈《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物105《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育《發(fā)酵工程》第二章微生物106生長圈法

通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌將待檢菌涂布于高濃度工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈

工具菌（指示菌）是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌107抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的抗生素產(chǎn)生菌；因此，設(shè)計一個準確、快速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計，篩選1萬個108抗生素產(chǎn)生菌的分離抑菌圈法、擴散法、生物自顯影法等試驗菌的選擇是關(guān)鍵（關(guān)系到靈敏度、活性、抗菌譜等）采用聯(lián)合試驗菌（枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌）分離到黃霉素采用專一性強的篩選技術(shù)也是檢出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用機制相關(guān)的酶、酶抑制劑、激活劑等建立的篩選技術(shù)如棒酸（clavulanicacid）的發(fā)現(xiàn)：通過鑒定氨芐青霉素和待測樣品對-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌克雷氏菌的協(xié)同抑制作用《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抗生素產(chǎn)生菌的分離抑菌圈法、擴散法、生物自顯影法等試驗菌的選109抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)

大部分具有抗菌或抗真菌的活性

現(xiàn)發(fā)展出利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法，如生化誘導(dǎo)分析法《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離臨床上有效的抗腫瘤藥物大多是直接作用110酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離某些酶與病理相關(guān)如果某種化合物能在體外抑制某關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)有藥理作用選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶作為靶酶

靶區(qū)靶酶抗高血壓血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂癥縮合酶抗組氨組氨酸脫羧酶、組氨-N-甲基轉(zhuǎn)移酶《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離某些酶與病理相關(guān)如果某種化合111生長因子產(chǎn)生菌的分離

通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺陷型菌株的生長，來檢測生長因子產(chǎn)生菌。分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)被殺死的菌落周圍有無檢測菌的生長圈影印到能支持生長因子產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基上Uv照射殺死菌落鋪上一層含相應(yīng)生長因子缺陷型菌株《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育生長因子產(chǎn)生菌的分離通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺112第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育菌種選育是應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。微生物育種的方法包括自然育種、誘變育種、細胞工程育種和DNA重組技術(shù)育種等?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育菌種選育是應(yīng)用微生物遺傳和變異理論113自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育自然突變兩種情況：

生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降對生產(chǎn)有益的：生產(chǎn)性能提高自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)114制備單孢子（單細胞）懸液適當稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進行生產(chǎn)能力測定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育制備單孢子（單細胞）懸液自然選育的一般程序《發(fā)酵工程》115

自然選育簡單易行，可以達到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。自然選育的最大缺點是效率低、進展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育自然選育簡單易行，可以達到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)116

誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對象細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝。

目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時的效價僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育誘變育種誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變117原始菌株（出發(fā)菌株）活細胞計數(shù)誘變劑處理活細胞計數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育原始菌株（出發(fā)菌株）活細胞計數(shù)誘變劑處理活細胞計數(shù)中間培養(yǎng)突1181、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1）選擇對誘變劑敏感性強、變異幅度大的菌株作為出發(fā)菌株。2）最好選用已經(jīng)過生產(chǎn)選育的自發(fā)突變菌株。3）采用具有有利性狀的菌株作為親本，如生長速度快，營養(yǎng)要求低等。4）由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會對其它誘變因素的敏感性提高，故有時可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株作為出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌的誘變中，失去（黃色）色素的變異菌株作為出發(fā)菌株則產(chǎn)量會不斷提高?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育1、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1）選擇對誘變劑敏感1192、單細胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細胞或單孢子懸液進行誘變處理。因為1）分散狀態(tài)的細胞可均勻地接觸誘變劑；2）可避免長出不純的菌落

處理前，細胞應(yīng)盡可能達到同步生長狀態(tài)，

細胞菌齡一般在對數(shù)期，霉菌的菌絲一般是多核的，所以對霉菌的處理一般應(yīng)采用孢子懸浮液?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育2、單細胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細120若在處理前細胞進行前培養(yǎng)，則變異率可大大提高。同步化前培養(yǎng)的具體做法：

接種培養(yǎng)24h的斜面入50ml基本培養(yǎng)基中，37oC振蕩培養(yǎng)16h，然后在6oC放置1h，以得到同步生長和分裂。將菌體離心并懸浮于營養(yǎng)豐富的前培養(yǎng)基中，37oC振蕩培養(yǎng)30-50min。立即降至2oC保藏10min，再離心洗滌兩次，懸浮于冷生理鹽水中。經(jīng)分散、過濾、調(diào)整細胞密度，制備成菌懸液，供處理用。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育若在處理前細胞進行前培養(yǎng)，則變異率可大大提高。同步化前培養(yǎng)1213、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。如紫外線、X-射線、-射線、快中子、超聲波等硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺、ICR類等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育3、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因122紫外線(Uv)使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)用較廣對誘變最有效的波長是260nm左右(253-265nm)作用機制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性,造成菌體變異甚至死亡.《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育紫外線(Uv)使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)123快中子

中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)幾乎完全是由質(zhì)子造成的。中子分為快中子和慢中子?？熘凶拥哪芰繛?.2-10百萬電子伏特，慢中子能量為1/4至100電子伏特。慢中子的效應(yīng)同射線、射線和電子等照射時引起的基本相同，快中子較X射線、射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點突變和染色體畸變?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育快中子中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或124氮芥

氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一般使用的是其鹽酸鹽。應(yīng)用時先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉其作用，釋放出氮芥子氣，再與細胞起作用而造成變異。氮芥的誘變機制是它能引起染色體畸變。是被使用得最早的一種誘變劑?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育氮芥氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一125亞硝酸

常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。

亞硝酸A——H（次黃嘌呤）C——UG——X（黃嘌呤）

亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2。所以，可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，使先生成亞硝酸然后再使用?！栋l(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育亞硝酸常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基126亞硝基胍(NTG)

是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%至80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超級誘變劑之稱。在緩沖液中較難溶解，而在甲酰胺中溶解度較大，因此用甲酰胺溶解，可以提高處理濃度。通常在濃度為30ug/ml、溫度為28oC和時間為60min的條件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。《發(fā)酵工程》第二章微生物菌種選育亞硝基胍(NTG)是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷127劑量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個關(guān)鍵問題。對一般微生物而言，誘變率往往隨誘變劑劑量的增高而增高，但達到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降。目前的處理劑量已從以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的劑量，特別是對于經(jīng)過一再誘變的高產(chǎn)菌株。劑量似乎也不宜過低，因為在使用高劑量誘變時，除個別核被誘發(fā)變異外，還可以使其它的核破壞致死，最終能形成較純的變異菌落；另外，高劑量可能引起遺傳物質(zhì)的巨大損傷，