中藥成分的含量測定

關(guān)于中藥成分的含量測定1第一頁，共九十二頁，2022年，8月28日2第一節(jié)含量測定的目的與意義

中藥的含量測定與化藥有很大區(qū)別中藥組成復雜，產(chǎn)生療效的不是某單一成分，檢測任何一種活性成分均不能反映中藥的整體療效。但是借鑒化藥質(zhì)量控制模式，測定某一味藥味的有效成分、活性成分、指標性成分的含量的方法，對于控制中藥質(zhì)量起著不可替代的重要作用。通過測定中藥中有效成分、毒性成分或某些指標性成分的含量來衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，以保證中藥的質(zhì)量，達到臨床用藥安全、有效的目的。

第二頁，共九十二頁，2022年，8月28日3第二節(jié)含量測定樣品的處理

樣品處理的主要作用有：將被測成分有效地從樣品中釋放出來，并制成便于分析測定的穩(wěn)定試樣。除去雜質(zhì)、純化樣品，以提高分析方法的重現(xiàn)性和準確度。富集濃縮或進行衍生化，以測定低含量被測成分。衍生化不僅可提高檢測器的靈敏度，還可以提高方法的選擇性。使試樣的形式及所用溶劑符合分析測定的要求。第三頁，共九十二頁，2022年，8月28日4第二節(jié)含量測定樣品的處理

一、樣品的粉碎

1.目的：是保證含量測定所取樣品均勻而有代表性，提高測定結(jié)果的精密度和準確度；是使樣品中的被測組分能更快地完全提取出來。2.粉碎時注意事項：不要粉碎得過細。樣品粉碎得過細，在樣品提取時，會造成過濾困難，因此可視實際情況進行粉碎過篩。避免污染樣品。在粉碎樣品時，要盡量避免由于設備的磨損或不干凈等原因而玷污樣品，防止粉塵飛散或揮發(fā)性成分的損失。過篩時，通不過篩孔的部分顆粒決不能丟棄，必須反復粉碎或碾磨，讓其全部通過篩孔。第四頁，共九十二頁，2022年，8月28日5第二節(jié)含量測定樣品的處理

二、樣品的提取對于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進行提取，使被測組分和某些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對被測組分進行含量測定。常見的提取方法：冷浸法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲提取法超臨界流體提取法第五頁，共九十二頁，2022年，8月28日6第二節(jié)含量測定樣品的處理

三、樣品的分離凈化（一）沉淀法（二）蒸餾法（三）液一液萃取法（LLE）（四）色譜法

第六頁，共九十二頁，2022年，8月28日7第二節(jié)含量測定樣品的處理

（四）色譜法

吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜皆可作為中藥制劑分析中的凈化分離方法，其操作方式有柱色譜，薄層色譜和紙色譜。其中經(jīng)典微柱色譜，也稱固相萃取或液—固萃?。↙SE）具有設備簡單，使用方便，快速，凈化效率較高而最常用，將在此做一簡介。

LSE通常是指樣品溶液加到裝有合適固定相（凈化劑）的長5`～15cm，內(nèi)徑0.5～1cm的色譜柱中，將被測成分保留于柱上，洗去雜質(zhì)后，再洗脫被測成分進行測定，或者是使雜質(zhì)強烈保留于柱上，直接洗脫被測成分進行測定。用這種選擇性好而柱效較低的方法進行樣品的凈化分離，尤其適用于一類總成分的含量測定，也可將色譜柱流出的樣品進一步用GC、HPLC、TCL分離后測定。

LSE的常用凈化劑（填料）有氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、硅膠、活性炭、大孔樹脂離子交換樹脂、鍵合相硅膠C8、C18、聚酰胺等。視其性質(zhì)可分為親脂型、親水型和離子交換型填料。第七頁，共九十二頁，2022年，8月28日8第二節(jié)含量測定樣品的處理

⒈硅膠、氧化鋁等：

它們是傳統(tǒng)的吸附劑，多以0.07～0.15mm(200～100目)的顆粒1～5g用于樣品的凈化處理，其作用機制為溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用。通常是當溶于有機溶劑的樣品加到柱上時非極性或低極性的雜質(zhì)先被洗出色譜柱，再用適當極性的溶劑洗脫被測成分，而強極性的雜質(zhì)仍保留在柱上。氧化鋁能將黃酮類吸附在柱上，用于生物堿、苷類等的測定。例如用ＵＶ法（吸收系數(shù)法）硅膠適合于分離中性或酸性化合物，強烈保留堿性化合物。若把樣品提取液加到柱上，依次用極性由小到大的溶劑洗脫，則可以將雜質(zhì)和被測成分分離。第八頁，共九十二頁，2022年，8月28日9⒉鍵合相硅膠：十八烷基鍵合相硅膠（簡稱C18或ODS）是常用的固體萃取劑，其次有烷基、苯基、氰基鍵合相硅膠，可用來分開脂溶性和水溶性雜質(zhì)或成分。也常用于萃取，純化水基質(zhì)體液中憎水性藥物。該類LSE的一般操作程序為：1)柱的活化。用2ml甲醇沖洗以潤濕鍵合相和除去雜質(zhì)，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。2)上樣。3)清洗。用2～5ml的水清洗以除去弱保留的親水成分，如無機鹽、氨基酸、親水的蛋白質(zhì)、糖以及中等保留成分的極性化合物、低肽等。4)洗脫。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脫大分子的肽、甾體、較親脂的藥物等強保留的待測組分。第二節(jié)含量測定樣品的處理

第九頁，共九十二頁，2022年，8月28日10⒊大孔樹脂：它可分為極性和非極性型極性丙烯酰胺聚合物;

非極性苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.

其吸附性質(zhì)與烷基鍵合相硅膠相似，通過疏水作用對非極性水溶性成份有吸附力。例如在測定復方歸芪劑中的黃芪甲苷時，用大孔樹脂除去水溶性的多糖雜質(zhì)，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。大孔樹脂的主要特點是表面積極大，傳質(zhì)速率較高和具有不同的極性及適于吸附較大分子。樹脂在使用前需要前處理：用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑除去雜質(zhì)，有時還需用酸、堿清洗。該填料用量常為1～2g，有時也用100～150mg來萃取血、尿中藥物，操作程序類似ODS填料。第二節(jié)含量測定樣品的處理

第十頁，共九十二頁，2022年，8月28日11第二節(jié)含量測定樣品的處理

⒋聚酰胺：它是常用的有機吸附劑，主要通過與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。常用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離，如測定黃酮時，用樣品的乙醇提取液上柱，水洗去部分雜質(zhì)，以95%乙醇洗脫總黃酮后測定。

第十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日12第二節(jié)含量測定樣品的處理

⒌硅藻土、纖維素：

它們?yōu)槌Ｓ玫挠H水型填料，其原理為分配作用。填料作為支持劑，多以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶的有機溶劑為流動相，較親脂的成分從固定相轉(zhuǎn)移到流動相，而被洗脫，達到萃取的目的。其萃取率較高（一般大于80%），無濃集作用，萃取液較純凈，但洗脫劑用量較大（一般大于5ml）硅藻土柱則用干柱直接上樣，柱可再生。常見牌號為Extretut。纖維素柱的使用與硅藻土柱相似。第十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日13⒍離子交換樹脂：憎水基質(zhì)的離子交換樹脂兼有離子交換劑及大孔樹脂的一些性質(zhì)，所以對于在水中溶解度不大的藥物、洗脫劑中需含一定量的有機溶劑。離子交換樹脂柱可用于除去樣品中的離子，防止組分分解，更常用于萃取樣品液中可離解化合物。第二節(jié)含量測定樣品的處理

第十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日14第二節(jié)含量測定樣品的處理

此外，近年來發(fā)展起來的固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技術(shù)有良好的應用前景。SPME是一種無溶劑的萃取技術(shù)，取樣方式有直接取樣和頂空取樣。第十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日15（五）消化法

對樣品進行有機破壞，常用于中藥制劑中重金屬的檢查。常用的破壞方法有濕法消化和干法消化法。⒈濕法消化：根據(jù)所用試劑不同，下面介紹三種常見的消化方法。（1）硝酸—高氯酸法該法破壞能力強，反應較激烈，故進行破壞時，必須嚴密注意切勿將容器中的溶液蒸干，以免發(fā)生爆炸。本法適用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞，經(jīng)破壞后所得無機金屬離子均為高價態(tài)，本法對含氮雜環(huán)類有機物破壞不夠完全。（2）硝酸—硫酸法該法適用于大多數(shù)有機物質(zhì)的破壞，無機金屬離子均氧化成高價態(tài)，與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。第二節(jié)含量測定樣品的處理

第十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日16第二節(jié)含量測定樣品的處理

（3）硫酸—硫酸鹽法本法所用硫酸鹽為硫酸鉀或無水硫酸納，加入硫酸鹽的目的是為了提高硫酸的沸點，以使樣品破壞加速完全。同時防止硫酸在加熱過程中過早地分解為SO3而損失。經(jīng)本法破壞所得金屬離子，多為低價態(tài)。本法常用于含砷或銻的有機樣品的破壞，破壞后得到三價砷或銻。濕法消化所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應為優(yōu)級純，水應為去離子水或高純水，同時必須按相同條件進行空白實驗校正。操作時應在通風櫥內(nèi)進行。

第十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日17第二節(jié)含量測定樣品的處理

⒉干法消化

本法是將有機物灼燒灰化以達分解的目的，將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或鉑坩堝中，常加無水Na2CO3或輕質(zhì)MgO等以助灰化，混勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全即可。本法不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）有機樣品的破壞。應用本法時要注意以下幾個問題：

1）加熱灼燒時，控制溫度在420℃以下，以免某些被測金屬化合物的揮發(fā)。

2）灰化完全與否，直接影響測定結(jié)果的準確度。如欲檢查灰化是否完全，可將灰分放冷后，加入稍過量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振搖。若呈色或有不溶有機物，可于水浴上將溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼燒。

3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時切勿棄去。第十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日18第三節(jié)常用定量分析方法

分類重量分析和滴定分析?；瘜W分析法所用儀器簡單，結(jié)果準確。主要用于測定制劑中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機成分，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等?；瘜W分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時長，專屬性不高，對于微量成分準確性不理想。第十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日19第三節(jié)常用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。

1、揮發(fā)法可測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量。如：①供試品的干燥失重測定；②水分測定均屬揮發(fā)法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘渣的測定等。

2、萃取法是根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達到分離的目的。如①冰硼散中冰片的含量測定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；③昆明山海棠片中總生物堿的含量測定；④甘草浸膏中甘草酸的含量測定即采用萃取法。

3、沉淀法是將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如①西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定；②苦參片中苦參總堿的含量測定；③復方元胡注射液總堿的測定。第十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日20第三節(jié)常用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分為酸堿滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化還原滴定法。

1、酸堿滴定法適用于測定中藥制劑中所含有的生物堿、有機酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分的含量。①直接滴定：對于K·C≥10-8的酸、堿組分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿的含量測定、顛茄酊中生物堿的含量測定。②間接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中總酸性物質(zhì)的含量測定、草烏注射液中生物堿的含量測定等。2、沉淀滴定法主要用于生物堿、生物堿的氫鹵酸鹽及含鹵素的其他有機成分的含量測定。第二十頁，共九十二頁，2022年，8月28日21第三節(jié)常用定量分析方法3、配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸銨法，在中藥制劑分析中，用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。如①萬氏牛黃清心丸等的含量測定就采用硫氰酸銨法；②牛黃解毒片中石膏的含量測定。4、氧化還原滴定法適用于測定具有氧化還原性的物質(zhì)，如含酚類、糖類及礦物藥Fe、As等成分的中藥制劑。如①磁朱丸中全鐵的含量測定采用鈰量法；②牛黃解毒片中雄黃的含量測定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量測。第二十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日22第三節(jié)常用定量分析方法二、可見一紫外分光光度法該法是中藥及其制劑含量測定的一種常用方法,具有靈敏度高，精度好和操作簡便等優(yōu)點。該法要求被測成分本身或其顯色產(chǎn)物對可見—紫外光具有選擇性吸收。按測定波長數(shù)目不同分為單波長光譜法和多波長光譜法。

第二十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日23第三節(jié)常用定量分析方法（一）單波長光譜法

分類方法特點吸收系數(shù)法測定所配供試品溶液在規(guī)定波長的吸收度，根據(jù)被測成分的吸收系數(shù)（E1%1cm）計算其含量①對儀器要求高，使用該法時，應注意儀器波長、空白吸收的校正，吸收度準確度的檢定和雜散光的檢查②無需對照品，方法簡便對照品比較法在同樣條件下配制對照品溶液和供試溶液，且使前者中所含被測成分的量應為后者中被測成分的量的100%±10%，用規(guī)定波測定二者的吸收度，則可計算出供試品中被測成分的濃度或含量對儀器要求較高標準曲線法配制一系列不同濃度的對照品溶液（常為5個），在相同條件下分別測定吸收度，繪制A-C曲線，或求出其回歸直線方程（相關(guān)系數(shù)r≥0.999），即得標準曲線。在相同條件下，測定供試品溶液的吸收度，就可求得供試品中被測成分的濃度或含量。①本法對儀器的精度要求不高，有時標準曲線不通過原點，只要重現(xiàn)性好也可使用②該法在比色法中最常用第二十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日24第三節(jié)常用定量分析方法（二）多波長光譜法（計算分光光度法）

供試品溶液中若有多種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發(fā)生不同程度的重疊時，則可通過測定多種波長處的吸收度，根據(jù)吸收度的加和性，采用適當?shù)臄?shù)學處理方式進行多組分的同時測定，或者用其排除共存組分干擾，測定其中的某個組分。這就屬于多波長光譜法的范疇。下面簡要介紹用多波長法測定存在光譜干擾的多組分樣品中某個組分的一些技術(shù)：雙波長法（包括等吸收點法和系數(shù)倍率法）、三波長法、導數(shù)光譜法和差示光譜法等。第二十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日25第三節(jié)常用定量分析方法優(yōu)點是可省去或簡化樣品預處理步驟，測定組成已知的復雜樣品，但是使用該法應慎重。首先因為中藥及其制劑的供試品溶液往往組成復雜，甚至干擾組分或陰性空白樣品的變動性大，因此，使得其方法的適應性差，而只適應于同批樣品或內(nèi)控應用，目前很少在藥典和新藥報批中使用多波長法作為中藥制劑含量測定方法。再者，當測定的吸收度處在吸收曲線的陡峭部位時，波長的微小變動可能對測定結(jié)果造成顯著的偶然誤差。還有在實際工作中，由于測試條件的變化，儀器精度與性能的限制，多波長法不用吸收系數(shù)法，而采用標準品對比的方法（常用標準曲線法）來進行樣品的測定。第二十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日26第三節(jié)常用定量分析方法三、薄層掃描法

薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的薄層色譜組分原位分析方法及薄層色譜的記錄方法，又稱薄層色譜掃描法（TLCS），相應儀器稱為薄層掃描儀（ThinLayerChromatogramScanner）。薄層掃描法是用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中吸收紫外光或可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。第二十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日27第三節(jié)常用定量分析方法（一）基本原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點移動，測定A-l或F-l曲線。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。第二十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日28第三節(jié)常用定量分析方法1、薄層吸收掃描法基本原理：Kubelka-Munk理論及曲線。由于薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象，斑點中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系需用Kubelka-Munk理論及曲線來描述。Kubelka-Munk理論以斑點的相對反射率和相對透光率計算薄層色譜斑點的吸光度，說明了固定相的散射參數(shù)SX對斑點中物質(zhì)的濃度與吸光度間關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)SX時斑點的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。光源：鎢燈和氘燈；靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長進行測定，其靈敏度可達ng級；適用范圍：適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。第二十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日292、薄層熒光掃描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC

光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測到10-50pg。適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。

Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進行曲線校直。用薄層熒光掃描進行定量分析時，用斑點熒光強度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點中組分的含量代替上式中F與C進行運算。第三節(jié)常用定量分析方法第二十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日30（二）薄層色譜的規(guī)范化操作1、儀器與材料①薄層板；②涂布器；③點樣器材；④展開箱（層析缸）⑤顯色與檢測儀器2、操作方法①薄層板的制備；②點樣；③展開；④檢測；第三節(jié)常用定量分析方法第三十頁，共九十二頁，2022年，8月28日31第三節(jié)常用定量分析方法（三）定量分析方法1、方法學考察新建薄層掃描定量方法必須進行方法考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準確度、統(tǒng)計檢驗等內(nèi)容。第三十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日32（1）工作曲線

①檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。②考察工作曲線是否過原點，以便確定采用一點法或二點法定量。③確定點樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也只是在一定點樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點樣量，使供試品與對照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標法及內(nèi)標法均應采用隨行標準法，即標準溶液與供試品溶液交叉點在同一塊薄層板上。第三節(jié)常用定量分析方法第三十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日33第三節(jié)常用定量分析方法（2）精密度考察

取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點樣量平行點5點以上，展開后測定其峰面積，求算相對標準差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標。RSD應小于4%。

式中：為n次測量的平均值，S為標準差。第三十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日34第三節(jié)常用定量分析方法（3）準確度考察回收率是衡量定量方法準確度的指標，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應在95-105%之間，測量數(shù)據(jù)一般為5-6個。將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標準溶液點于同一塊薄層板上，展開后進行薄層掃描，測定各斑點的峰面積，計算各溶液中組分的量，計算回收率（R）。第三十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日35（4）統(tǒng)計檢驗統(tǒng)計檢驗是檢驗兩種方法、兩臺儀器或兩個人測量的兩組實驗數(shù)據(jù)的精密度或準確度（偶然誤差或系統(tǒng)誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量方法可否代替舊方法或優(yōu)于舊方法。統(tǒng)計檢驗包括F檢驗與t檢驗。

F檢驗即精密度差別檢驗，用以檢驗兩組數(shù)據(jù)的精密度或偶然誤差是否存在顯著性差異，一般為單側(cè)檢驗。

t檢驗即準確度差別檢驗，用以檢驗兩組測量數(shù)據(jù)的平均值或系統(tǒng)誤差是否存在顯著性差異。若t檢驗證明兩種方法測得的均值不存在顯著性差異時，則新方法可以代替舊方法，t檢驗一般為雙側(cè)檢驗。

t檢驗與F檢驗的具體方法參見分析化學的有關(guān)論著，此從略。第三節(jié)常用定量分析方法第三十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日36第三節(jié)常用定量分析方法2、定量方法常用的定量方法有外標法、內(nèi)標法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。（1）外標法外標法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點樣必須準確。①外標一點法工作曲線通過原點（截距為零）時可用外標一點法定量。只需點一種濃度的標準品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計算公式為：C=F1·A

式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。第三十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日37②外標二點法工作曲線不通過原點時，只能用外標二點法定量，至少需點二種不同濃度的標準溶液（或一種濃度兩種點樣量），才能決定一直線,其計算公式為：C=F1A+F2

式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動算出。

外標一點法、二點法只是指用一種或二種濃度的標準溶液對比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點樣不得少于4個，對照品每一濃度不得少于2個；并調(diào)整標淮溶液的濃度或供試品與標準溶液的點樣量，使其峰面積相接近；且點樣量必須準確，宜用定量毛細管點樣。第三節(jié)常用定量分析方法第三十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日38第三節(jié)常用定量分析方法（2）內(nèi)標法內(nèi)標法是選一個純物質(zhì)作為內(nèi)標物，并準確稱取一定量內(nèi)標物加至供試液及標準液中，計算供試品溶液中某組分含量的定量方法。

內(nèi)標物的選擇要求是：純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑點，否則內(nèi)標斑點的峰面積將不能代表內(nèi)標物的量。內(nèi)標物須為樣品中所不含有的成分。內(nèi)標物不與其它斑點相重疊，分離度合乎要求。為簡化計算，內(nèi)標物在標準溶液及供試品溶液中的濃度應相等。第三十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日39特點：

1）在一定點樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標法定量準確度與點樣量無關(guān)。

2）不易找到適宜Rf值的純品內(nèi)標物，且溶液配制等操作較麻煩。方法：

1）內(nèi)標一點法：當工作曲線通過原點時采用內(nèi)標一點法。內(nèi)標一點法公式：

2）工作曲線不通過原點時必須采用內(nèi)標二點法內(nèi)標二點法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標物的濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內(nèi)標物的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動計算并內(nèi)存，可直接給出樣品的濃度或重量。第三節(jié)常用定量分析方法第三十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日40（3）回歸曲線定量法將不同濃度（或不同量）的標準溶液與供試液點在同一塊薄層板上，展開、掃描;

由計算機對所測得的峰面積及相應點樣量進行線性或非線性回歸;

直接由回歸方程或回歸曲線計算供試液含量的方法;CAMAG系列薄層掃描儀即采用此方法。第三節(jié)常用定量分析方法第四十頁，共九十二頁，2022年，8月28日41第三節(jié)常用定量分析方法（四）影響薄層色譜分析的主要因素1、樣品的預處理及供試液的制備2、薄層色譜的點樣技術(shù)3、吸附劑的活性與相對濕度的影響4、溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用5、溫度的影響第四十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日42相對濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相對濕度用的硫酸溶液第三節(jié)常用定量分析方法第四十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日43第三節(jié)常用定量分析方法四、氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動相的柱色譜分離分析方法。

特點：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點，兼具分離、分析的功能，適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。

適用范圍：適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。第四十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日44第三節(jié)常用定量分析方法（一）基本原理

氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進行定性分析，利用峰面積或峰高進行定量分析的方法。第四十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日45第三節(jié)常用定量分析方法（二）實驗條件的選擇在氣相色譜分析中，為達到滿意的分離效果，需依據(jù)VanDeemeter方程式和分離度方程式選擇合適的分離條件，主要有固定相、柱溫、載氣流速等條件的選擇。

1、固定相的選擇

1）氣—液色譜①固定液：按極性相似、化學官能團相似的相似性原則和主要差別選擇。②載體：一般為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。

2）氣—固色譜：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。第四十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日46第三節(jié)常用定量分析方法2、柱溫的選擇選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時間適宜及不拖尾為度。在實際工作中一般根據(jù)樣品的沸點來選擇柱溫，具體有如下幾點：高沸點的樣品（沸點300-400℃），采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點為200-300℃的樣品，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點為100-200℃的樣品，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點2/3左右。氣體等低沸點樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點左右，在室溫或50℃下進行分析。對于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進行分析。但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。第四十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日473、載氣的選擇主要從對峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。

N2是最常用的載氣；載氣流速較低時，宜用N2；流速高時，宜用H2、He；較長色譜柱，宜用H2作載氣；

熱導檢測器應選用H2、He；氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2；一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為20-80ml/min。第三節(jié)常用定量分析方法第四十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日48第三節(jié)常用定量分析方法4、其他條件的選擇氣化室（進樣口）溫度：氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點范圍、穩(wěn)定性及進樣量等因素。檢測室溫度檢測器溫度一般需高于柱溫，以免色譜柱的流出物在檢測器中冷凝而污染檢測器。通常可高于柱溫30℃左右或等于氣化室溫度。進樣量在檢測器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進樣量，通常以塔板數(shù)下降10%作為最大允許進樣量。對于填充柱，氣體樣品為0.1-1μl，液體樣品為0.1-1μl，最大不超過4μl為宜。毛細管柱需用分流器分流進樣，分流后的進樣量為填充柱的1/10-1/100。此外，進樣速度要快，進樣時間要短，注意留針時間和室溫的影響，以準確控制進樣量，以利于分離。第四十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日49第三節(jié)常用定量分析方法5、檢測器熱導檢測器（TCD）：通用型檢測器，應用廣泛，但靈敏度較低；氫焰離子化檢測器（FID）：應用最廣泛，適用于含碳有機物的測定，載氣多為N2。氮-磷檢測器（NPD）：專屬性檢測器，可用于中藥及其制劑中農(nóng)藥殘留量的檢測。電子捕獲檢測器（ECD）：專屬性檢測器，適用于痕量電負性有機物—如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。第四十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日50第三節(jié)常用定量分析方法（三）定量分析方法氣相色譜常用的定量方法有內(nèi)標法、外標法、歸一化法等。1、內(nèi)標法特點：為最常用的定量方法優(yōu)點：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進樣量不夠準確等原因所帶來的定量分析誤差；缺點：樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標物不易尋找。關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標物。適用范圍：①適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱；②檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號；③只需測定樣品中某幾個組分含量時的情況。第五十頁，共九十二頁，2022年，8月28日51第三節(jié)常用定量分析方法

原理：選擇一內(nèi)標物，將一定量的內(nèi)標物加入到樣品中，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標物重量Ws及待測組分和內(nèi)標物的峰而積Ai、As，求出待測組分的含量。待測組分百分含量為：Ci%=

式中fi、fs分別為被測組分和內(nèi)標的重量校正因子。在中藥制劑分析時，校正因子經(jīng)常不知，可采用藥典方法測定校正因子再用內(nèi)標法，或采用內(nèi)標對比法測定。第五十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日52第三節(jié)常用定量分析方法（3）內(nèi)標工作曲線法內(nèi)標工作曲線法與外標法相同，只是在各種濃度的標準溶液中加入相同量的內(nèi)標物，進樣，以標準物與內(nèi)標物的峰面積比Ai/AS對Ci作工作曲線（或求回歸方程）樣品測定時也加入等量的內(nèi)標物，根據(jù)樣品與內(nèi)標物峰面積比AX/AS由工作曲線求得待測組分含量。第五十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日53第三節(jié)常用定量分析方法2、外標法關(guān)鍵：①進樣量準確；②實驗條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準確進樣等體積的樣品溶液，計算其含量；

2）外標一點法：當工作曲線截距為零時，可采用外標一點法定量，第五十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日543、歸一化法關(guān)鍵：要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質(zhì)含量，一般宜用于微量雜質(zhì)的含量檢查.①校正面積歸一化法測定各組分的含量。②面積歸一化法計算：第五十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日55第三節(jié)常用定量分析方法

高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實驗方法。高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發(fā)展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應用范圍廣等特點。

適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物的分離分析。第五十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日56第三節(jié)常用定量分析方法（一）HPLC的基本原理（二）HPLC實驗條件的選擇1、色譜柱的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進行選擇。①大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；②也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥物可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；④脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。第五十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日572、流動相的選擇

1）反相鍵合相色譜流動相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物反相鍵合相色譜常用流動相第五十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日58第三節(jié)常用定量分析方法2）正相鍵合相色譜

①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇姸龋?/p>

②常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。第五十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日59第三節(jié)常用定量分析方法3、洗脫方式

等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個范圍內(nèi)，適用于組分數(shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。

梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成（如溶劑極性、離子強度和pH值等），適用于分析組分數(shù)多、性質(zhì)相差較大的復雜混合物樣品，從而使所有組分都在適宜條件下獲得分離。第五十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日604、檢測器

檢測器特點檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）分為:①可變波長型②二極管陣列檢測器①用于檢測有外吸收的物質(zhì);②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測器(FD)①用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì);②靈敏度高于紫外檢測器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)①屬通用型檢測器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分;②檢測靈敏度較低,適用于流動相能揮發(fā)的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動相用于檢測糖、高分子子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物第六十頁，共九十二頁，2022年，8月28日614、檢測器

電化學檢測器(ECD)用于能氧化、還原的有機物質(zhì)的檢測1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)①屬通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進行檢測.②穩(wěn)定性好,操作方便.③靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測化學發(fā)光檢測器(CLD)①高選擇性、高靈敏度的新型檢測器.②設備簡單,自身發(fā)光,無需光源,價格便宜Pg級(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等第六十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日625、HPLC前處理（1）流動相的處理

①溶劑的純化選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析的要求。由于不同的色譜柱和檢測方法對溶劑的要求不同，有時需進行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水。第三節(jié)常用定量分析方法第六十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日63②流動相脫氣

HPLC所用的流動相必須預先除去其中的空氣，習稱脫氣，一般在臨用前對流動相進行脫氣，常用的脫氣法有超聲波振蕩脫氣、惰性氣體（He）鼓泡吹掃脫氣、抽真空、加熱法。③過濾過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機溶劑專用和水溶液專用兩種。第三節(jié)常用定量分析方法第六十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日64第三節(jié)常用定量分析方法（2）樣品的處理

HPLC分析前需對樣品進行預處理，以便將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。①待測組分的提?、谌軇┑膿]發(fā)(濃縮）③濾過樣品溶液進樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。第六十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日65第三節(jié)常用定量分析方法正相色譜:流動相極性小于固定相極性的分配色譜法，主要用于極性物質(zhì)的分離測定；反相色譜:流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定第六十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日66第三節(jié)常用定量分析方法

化學鍵合相是將固定液的官能團鍵合在載體上所形成的固定相。具有化學性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，一般在pH2-8范圍的溶液中不變質(zhì)，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對色譜。藥典中HPLC法所采用的固定相均為化學鍵合相。以化學鍵合相為固定相的色譜法稱為化學鍵合相色譜法.

現(xiàn)就中藥分析中最常用的鍵合相色譜法作一介紹。第六十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日67第三節(jié)常用定量分析方法（1）反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法是現(xiàn)代液相色譜中應用最為廣泛的方法，占整個HPLC應用的80%左右。反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）是最常用的非極性固定相，對于各種類型的化合物都有較強的適應能力；流動相通常以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，常用的有甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其與水的混合比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響，流動相的極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)的k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調(diào)整流動相的極性，可控制k值在所要求的范圍內(nèi)（k=1-10），對于結(jié)構(gòu)類似的組分，極性大的組分先出柱。第六十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日68第三節(jié)常用定量分析方法（2）正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法的應用不如反相色譜法普及，主要用于分離分析溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相，流動相通常用烷烴（常用正已烷）加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。

第六十八頁，共九十二頁，2022年，8月28日69第三節(jié)常用定量分析方法（3）離子對色譜法

直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法作為離子對色譜法（PIC或IPC），該法可分為正相離子對色譜法和反相離子對色譜法，但近年來廣泛應用的幾乎都是反相離子對色譜法，故本書只介紹反相離子對色譜法.①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.②適用范圍:適用于有機酸、堿、鹽的分離;

用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;

在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機酸的分析。

③缺點:離子對試劑價格比較貴.④分離條件的選擇:離子對試劑的性質(zhì)和濃度、流動相的pH值及流動相中所含有機溶劑的種類與比例等。第六十九頁，共九十二頁，2022年，8月28日70第三節(jié)常用定量分析方法i離子對試劑的選擇通常所選用離子對試劑的電荷應與試樣離子的電荷相反。離子對試劑主要應用對象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥物、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質(zhì)（如有機胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應用對象同烷基磺酸鹽第七十頁，共九十二頁，2022年，8月28日71第三節(jié)常用定量分析方法反相離子對色譜法中流動相pH值的選擇原則樣品類型流動相PH值說明1、強酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整個pH范圍內(nèi)，樣品可離解，實際pH值的選擇取決于共存的其它組分類型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)。3、強堿（pKa>8）如季銨類2-8同強酸4、弱堿（pKa<8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)。ii.流動相pH值的控制

第七十一頁，共九十二頁，2022年，8月28日72第三節(jié)常用定量分析方法iii.有機溶劑的選擇反相離子對色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)是最常用的流動相，流動相中所含有機溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強，所需有機溶劑的比例越高。第七十二頁，共九十二頁，2022年，8月28日73第三節(jié)常用定量分析方法（4）離子抑制色譜法原理:由于離子對試劑的價格較貴，對弱酸、弱堿的分離，往往采用離子抑制色譜法。通過向流動相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法（ISC）。

第七十三頁，共九十二頁，2022年，8月28日74第三節(jié)常用定量分析方法（4）離子抑制色譜法特點:該方法簡便、經(jīng)濟實用、分離效果好，在許多場合可替代離子對色譜法，但重復性較差是其缺點。適用范圍:離子抑制色譜法通常用于反相色譜中，適用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱堿和兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時的分離。第七十四頁，共九十二頁，2022年，8月28日75第三節(jié)常用定量分析方法離子抑制色譜法與離子對色譜法的區(qū)別：

①離子抑制色譜法是向流動相中加入抑制劑，調(diào)節(jié)pH值，抑制樣品組分的解離，使其以分子形式存在。而離子對色譜法是加入離子對試劑，并調(diào)節(jié)pH值使樣品組分盡可能呈解離狀態(tài)，使離子對試劑的反離子與樣品離子結(jié)合成中性離子對。②離子抑制色譜僅適用于弱酸、弱堿的分離，不適用于有機強酸、強堿的分離；而離子對色譜法對不同強度的酸、堿均適用。第七十五頁，共九十二頁，2022年，8月28日76第三節(jié)常用定量分析方法（四）定量分析方法HPLC常用的定量方法有:外標法、內(nèi)標法（內(nèi)標對比法和內(nèi)標標準曲線法）內(nèi)加法。第七十六頁，共九十二頁，2022年，8月28日77第三節(jié)常用定量分析方法七、熒光分析法

優(yōu)點:靈敏度高(檢測限可達10-10---10-12g/ml）、選擇性好、方法快捷，試樣量少（幾十微克或幾十微升）等特點，并可提供較多的熒光參數(shù)（激發(fā)光譜、熒光光譜、熒光強度等）。缺點:其不足之處是干擾因素較多需嚴格控制實驗條件，且具有天然熒光的物質(zhì)數(shù)量不多，因而其應用不如可見—紫外光度法廣泛。第七十七頁，共九十二頁，2022年，8月28日78第三節(jié)常用定量分析方法2、測定方法

直接熒光法中藥及其制劑中許多物質(zhì)本身具