內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件

β-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)蔣曉飛復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心β-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)蔣曉飛復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中1表2β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能分類分子結(jié)構(gòu)功能舉例最適底物抑制劑(Ambler)(Bush)PENCARBOXCRCTXATMIPMCLAVCLOXEDTA絲氨酸酶A2aPC1，LEN-1卅十－土－－－卄－－2bSHV-1,TEM-1卅十十卄－－－卄－－2beK1,TEM-3,卅十十卄卄卄－卄－－SHV-2,PER-12brTEM-31卅十十十－－－－－－2CPSE-1,BRO-1卄卅十十－－－十－－2e卄卄－卄卄卄－卄－－2fSme-1,NMC-A卄十?十十卄卄十－－IMI-1C1AmpC卄十－卅十－－－卄－D2dOXA-1卄十卅十－－－V－－未定4AVS-1卄卄卄VV－－－－－金屬酶B3IMP-1卄卄卄卄卄－卄－－卄嗜麥芽L-1

內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件2Bush-J-M分類策略

3組金屬酶頭孢菌素酶1組酶EDTA2e組2a組2d組青霉素酶2c組2f組非金屬酶4組2be組廣譜酶2b2br組Bush-J-M分類策略3內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件4內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件5內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件6內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件7內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件8內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件9內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件10內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件11小結(jié)1組酶：頭孢菌酶，優(yōu)先水解底物是頭孢菌素，它們水解青霉素的的速率低于水解頭孢噻啶的速率的30%，對(duì)三代頭孢菌素和頭霉烯耐藥，但對(duì)碳青酶烯和四代頭孢菌素較為敏感，對(duì)酶抑制劑克拉維酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制2組酶：優(yōu)先水解青霉素類抗生素，其中水解頭孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的30%者為青霉素酶，又分為2a、2b、2c、2d、2e和2f亞組。3組酶：又稱金屬酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用。4組酶：是染色體介導(dǎo)的耐抑制劑的青霉素酶，對(duì)頭孢類抗生素的敏感性不定，對(duì)氨曲南和碳青霉烯敏感。小結(jié)12A類β-內(nèi)酰胺酶1。

A類β-內(nèi)酰胺酶：廣譜酶2b組ABA大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu)；B肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶結(jié)構(gòu)A類β-內(nèi)酰胺酶ABA大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu)；B13超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(2be)

經(jīng)典超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

TEM型ESBLsSHV型ESBLsSHV-2型ESBLs、SHV-5型ESBLsSHVΩ環(huán)突變型ESBLs

其他超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

CTX-M-型酶可為分4個(gè)小組PER-1及其相關(guān)ESBLPER-1、-2、VEB-1、2CME-1TLA-1特殊的非典型ESBLSFO-1、GES-1超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(2be)14TEM型ESBLs1．Glu140→Lys和Glu240→Lys替換：對(duì)頭孢他啶和氨曲南耐藥2．Arg164→Ser或His：對(duì)頭孢他啶耐藥，對(duì)頭孢噻肟敏感3．Gly238→Ser：主要提高了對(duì)頭孢噻肟的水解能力（如TEM-19)TEM型ESBLs1．Glu140→Lys和Glu240→L15SHV型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly238→Ser，主要提高水解頭孢噻肟的能力2.SHV-5型ESBLs：同時(shí)具有Gly238→Ser和Glu240→Lys突變3.SHVΩ環(huán)突變型ESBLs：Asp179→Ala、ArgSHV型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly2316A類β-內(nèi)酰胺酶與B類、C類和D類酶的同源性比較A類β-內(nèi)酰胺酶與B類、C類和D類酶的同源性比較17B類β-內(nèi)酰胺酶又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶，Bush功能分類中屬于3組酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用。金屬酶的功能亞分類：3a、3b、3c金屬酶的分子生物學(xué)亞型分類:B1、B2、B3B類β-內(nèi)酰胺酶18

亞分類物學(xué)亞類酶的型別宿主發(fā)現(xiàn)國(guó)家發(fā)現(xiàn)時(shí)間分子量等電點(diǎn)3aB1CcrA3脆弱擬桿菌美國(guó)199426未測(cè)3aB1CcrA4脆弱擬桿菌美國(guó)199426未測(cè)3aB1CcrA脆弱擬桿菌美國(guó)1986265.23aB1PCM-1洋蔥假單胞菌未知1994未測(cè)8.53aB1IMP-1銅綠假單胞菌日本1991289.03aB1IMP-2不動(dòng)桿菌屬意大利1999268.13aB1IMP-3銅綠假單胞菌日本20003aB1IMP-4不動(dòng)桿菌屬香港20018.0楊氏枸櫞酸桿菌中國(guó)2001未測(cè)未測(cè)3aB1IMP-6粘質(zhì)沙雷菌日本2001未測(cè)未測(cè)3aB1IMP-7銅綠假單胞菌加拿大20023aB1IMP-8肺炎克雷伯菌中國(guó)臺(tái)灣2001未測(cè)8.23aB1VIM-1銅綠假單胞菌意大利19995.33aB1VIM-2銅綠假單胞菌法國(guó)2000未測(cè)未測(cè)3aB1VIM-3銅綠假單胞菌臺(tái)灣2000未測(cè)5.13bB2CphA嗜水氣單胞菌意大利1993288.03bB2A2h嗜水氣單胞菌美國(guó)1990288.03bB2ACP嗜水氣單胞菌蘇格蘭1996318.23bB2AsbM1簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌美國(guó)1990349.13bB2AsA-1殺蛙氣單胞菌蘇格蘭199419>7.93bB2Imis溫和氣單胞菌英國(guó)1995未測(cè)9.3cB2戈氏軍團(tuán)菌19862510.53aB3L1嗜麥芽窄食單胞菌日本19821186.9

19B類β-內(nèi)酰胺酶

金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖A：CcrA（脆弱擬桿菌）B：BcⅡ（蠟樣芽胞桿菌）C：L1（嗜麥芽窄食單胞菌）園柱代表α螺旋，板片代表β片層綠色數(shù)字為His殘基，蘭灰色數(shù)字為Asp殘基，橙色數(shù)字為Cys或Ser殘基。ABCB類β-內(nèi)酰胺酶金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖ABC20獲得性金屬酶

（1）IMP型金屬酶（2）VIM型金屬酶獲得性金屬酶21β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)1．酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力學(xué)分析。2．基因分析：基因型別分類、測(cè)序、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。3．轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上；在不在整合子中。β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)22

收集菌株耐藥表型分析（紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)分析）提取酶粗制品進(jìn)行三相水解試驗(yàn)、等電聚焦電泳和酶動(dòng)力學(xué)分析根據(jù)結(jié)果判定酶的類群，選擇相應(yīng)PCR引物擴(kuò)增陽(yáng)性陰性

整合子PCR初篩

陽(yáng)性陰性

鳥(niǎo)槍法克隆可表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶基因

測(cè)定PCR產(chǎn)物序列PCR擴(kuò)增全測(cè)定全克隆片段可變區(qū)并測(cè)序序列整合子檢查提取質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)克隆并轉(zhuǎn)化到DH5α表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性陰性

鈣轉(zhuǎn)或MgCl2或電轉(zhuǎn)化

23（2）耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs（3）酶性質(zhì)分析：提取酶粗提物進(jìn)行a.三相水解試驗(yàn)。b.等電聚焦電泳。C.酶動(dòng)力學(xué)分析。（4）基因分析：a.PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物測(cè)序。b.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的β-內(nèi)酰胺酶基因。C.鳥(niǎo)槍法克隆可表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶基因，分析基因結(jié)構(gòu)。（4）轉(zhuǎn)移性分析：A。質(zhì)粒：a.質(zhì)粒接合試驗(yàn)。b.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化B。整合子：a.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定。（2）耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs24ESBLs和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)ESBLs和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)25一、ESBLs的檢測(cè)1．紙片法：表1肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株紙片法初篩和確證實(shí)驗(yàn)2．MIC法：表2肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株MIC法初篩和確證實(shí)驗(yàn)一、ESBLs的檢測(cè)1．紙片法：26驗(yàn)方法初篩試驗(yàn)表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基MHMH抗菌藥物濃度頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg頭孢他啶30μg或頭孢他啶/克拉維酸30/10μg氨曲南30μg或和頭孢噻肟30μg或頭孢噻肟30μg頭孢曲松30μg頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg（同時(shí)用多于一種抗生素可提高試驗(yàn)靈敏度）（確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述四種紙片）孵育條件同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法結(jié)果頭孢泊肟抑菌圈≤22mm有一種抗生素出現(xiàn)加有克拉維酸紙片抑菌圈≥頭孢他啶抑菌圈≤22mm沒(méi)有加克拉維酸紙片抑菌圈5mm=產(chǎn)ESBL氨曲南抑菌圈≤27mm頭孢噻肟抑菌圈≤27mm頭孢曲松抑菌圈≤25mm=可疑產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制陰性對(duì)照ATCC25922

陰性對(duì)照ATCC25922加有克拉維酸（參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)）≤沒(méi)有加克拉維酸抑菌圈2mm陽(yáng)性對(duì)照ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈9-16mm頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈頭孢他啶抑菌圈10-18mm≥頭孢他啶抑菌圈5mm氨曲南抑菌圈9-17mm頭孢噻肟抑菌圈17-25mm頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈頭孢曲松抑菌圈16-24mm≥頭孢噻肟抑菌圈3mm

驗(yàn)方法初篩試驗(yàn)27驗(yàn)方法初篩試驗(yàn)表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基CAMHBCAMHB抗菌藥物濃度頭孢泊肟1μg/mL或頭孢他啶0.25-128μg/mL頭孢他啶1μg/mL或頭孢他啶/克拉維酸0.25/4-128/4μg氨曲南1μg/mL或和頭孢噻肟1μg/mL或頭孢噻肟0.25-64μg/mL頭孢曲松1μg/mL頭孢噻肟/克拉維酸0.25/4-64/4μg（同時(shí)用多于一種抗生素（確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述可提高試驗(yàn)靈敏度）四種紙片）孵育條件同標(biāo)準(zhǔn)MIC法同標(biāo)準(zhǔn)MIC法結(jié)果生長(zhǎng)=可疑產(chǎn)ESBL有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維酸（例：MIC≥2μg/mL）的MIC≥沒(méi)有加克拉維酸的MIC3個(gè)對(duì)倍稀釋度=產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制陰性對(duì)照ATCC25922=無(wú)生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照ATCC700603陽(yáng)性對(duì)照ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈≥2μg/mL有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維頭孢他啶抑菌圈≥2μg/mL的MIC≥沒(méi)有加克拉維酸的MIC3個(gè)對(duì)氨曲南抑菌圈≥2μg/mL倍稀釋度頭孢噻肟抑菌圈≥2μg/mL頭孢曲松抑菌圈≥2μg/mL

驗(yàn)方法初篩試驗(yàn)28二、AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)1．初篩試驗(yàn)2．頭孢西丁三相水解試驗(yàn)3．聯(lián)合用克拉維酸和氯唑西林兩種抑制平行試驗(yàn)二、AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)1．初篩試驗(yàn)29AmpC酶的檢測(cè)1．

酶的提取凍融法超聲波破碎法1個(gè)菌落1個(gè)菌落

種入12ml大豆湯。35度震搖4-6h種入40ml大豆湯。35度震搖過(guò)夜

4度40000rpm，離心20min，去上清液4度4000rpm，離心20分鐘，去上清

沉淀物-890度反復(fù)凍溶5次重懸在5mlpH7.0的.01MPBS中，

加入1.5mlpH7.0的0.01MPBS，超聲波破碎10秒，間隔15秒重復(fù)旋轉(zhuǎn)混勻。10次

4度12,000轉(zhuǎn)rpm離心20分鐘4度12,000rpm離心20分

取上清，-20度保存?zhèn)溆萌∩锨逡海?20度保存?zhèn)溆肁mpC酶的檢測(cè)301．

測(cè)定方法0.

5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊拇竽c桿菌ATCC25922涂在MH平皿上，中心貼頭孢西丁紙片（30）

切出3-4個(gè)不同方向的狹縫，鉤出其中的瓊脂

每溝中加入待測(cè)菌的40的粗提物

35度孵育過(guò)夜

觀察結(jié)果1．

測(cè)定方法31謝謝！謝謝！32β-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)蔣曉飛復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心β-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)蔣曉飛復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中33表2β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能分類分子結(jié)構(gòu)功能舉例最適底物抑制劑(Ambler)(Bush)PENCARBOXCRCTXATMIPMCLAVCLOXEDTA絲氨酸酶A2aPC1，LEN-1卅十－土－－－卄－－2bSHV-1,TEM-1卅十十卄－－－卄－－2beK1,TEM-3,卅十十卄卄卄－卄－－SHV-2,PER-12brTEM-31卅十十十－－－－－－2CPSE-1,BRO-1卄卅十十－－－十－－2e卄卄－卄卄卄－卄－－2fSme-1,NMC-A卄十?十十卄卄十－－IMI-1C1AmpC卄十－卅十－－－卄－D2dOXA-1卄十卅十－－－V－－未定4AVS-1卄卄卄VV－－－－－金屬酶B3IMP-1卄卄卄卄卄－卄－－卄嗜麥芽L-1

內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件34Bush-J-M分類策略

3組金屬酶頭孢菌素酶1組酶EDTA2e組2a組2d組青霉素酶2c組2f組非金屬酶4組2be組廣譜酶2b2br組Bush-J-M分類策略35內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件36內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件37內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件38內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件39內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件40內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件41內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件42內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)課件43小結(jié)1組酶：頭孢菌酶，優(yōu)先水解底物是頭孢菌素，它們水解青霉素的的速率低于水解頭孢噻啶的速率的30%，對(duì)三代頭孢菌素和頭霉烯耐藥，但對(duì)碳青酶烯和四代頭孢菌素較為敏感，對(duì)酶抑制劑克拉維酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制2組酶：優(yōu)先水解青霉素類抗生素，其中水解頭孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的30%者為青霉素酶，又分為2a、2b、2c、2d、2e和2f亞組。3組酶：又稱金屬酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用。4組酶：是染色體介導(dǎo)的耐抑制劑的青霉素酶，對(duì)頭孢類抗生素的敏感性不定，對(duì)氨曲南和碳青霉烯敏感。小結(jié)44A類β-內(nèi)酰胺酶1。

A類β-內(nèi)酰胺酶：廣譜酶2b組ABA大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu)；B肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶結(jié)構(gòu)A類β-內(nèi)酰胺酶ABA大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu)；B45超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(2be)

經(jīng)典超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

TEM型ESBLsSHV型ESBLsSHV-2型ESBLs、SHV-5型ESBLsSHVΩ環(huán)突變型ESBLs

其他超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

CTX-M-型酶可為分4個(gè)小組PER-1及其相關(guān)ESBLPER-1、-2、VEB-1、2CME-1TLA-1特殊的非典型ESBLSFO-1、GES-1超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(2be)46TEM型ESBLs1．Glu140→Lys和Glu240→Lys替換：對(duì)頭孢他啶和氨曲南耐藥2．Arg164→Ser或His：對(duì)頭孢他啶耐藥，對(duì)頭孢噻肟敏感3．Gly238→Ser：主要提高了對(duì)頭孢噻肟的水解能力（如TEM-19)TEM型ESBLs1．Glu140→Lys和Glu240→L47SHV型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly238→Ser，主要提高水解頭孢噻肟的能力2.SHV-5型ESBLs：同時(shí)具有Gly238→Ser和Glu240→Lys突變3.SHVΩ環(huán)突變型ESBLs：Asp179→Ala、ArgSHV型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly2348A類β-內(nèi)酰胺酶與B類、C類和D類酶的同源性比較A類β-內(nèi)酰胺酶與B類、C類和D類酶的同源性比較49B類β-內(nèi)酰胺酶又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶，Bush功能分類中屬于3組酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用。金屬酶的功能亞分類：3a、3b、3c金屬酶的分子生物學(xué)亞型分類:B1、B2、B3B類β-內(nèi)酰胺酶50

亞分類物學(xué)亞類酶的型別宿主發(fā)現(xiàn)國(guó)家發(fā)現(xiàn)時(shí)間分子量等電點(diǎn)3aB1CcrA3脆弱擬桿菌美國(guó)199426未測(cè)3aB1CcrA4脆弱擬桿菌美國(guó)199426未測(cè)3aB1CcrA脆弱擬桿菌美國(guó)1986265.23aB1PCM-1洋蔥假單胞菌未知1994未測(cè)8.53aB1IMP-1銅綠假單胞菌日本1991289.03aB1IMP-2不動(dòng)桿菌屬意大利1999268.13aB1IMP-3銅綠假單胞菌日本20003aB1IMP-4不動(dòng)桿菌屬香港20018.0楊氏枸櫞酸桿菌中國(guó)2001未測(cè)未測(cè)3aB1IMP-6粘質(zhì)沙雷菌日本2001未測(cè)未測(cè)3aB1IMP-7銅綠假單胞菌加拿大20023aB1IMP-8肺炎克雷伯菌中國(guó)臺(tái)灣2001未測(cè)8.23aB1VIM-1銅綠假單胞菌意大利19995.33aB1VIM-2銅綠假單胞菌法國(guó)2000未測(cè)未測(cè)3aB1VIM-3銅綠假單胞菌臺(tái)灣2000未測(cè)5.13bB2CphA嗜水氣單胞菌意大利1993288.03bB2A2h嗜水氣單胞菌美國(guó)1990288.03bB2ACP嗜水氣單胞菌蘇格蘭1996318.23bB2AsbM1簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌美國(guó)1990349.13bB2AsA-1殺蛙氣單胞菌蘇格蘭199419>7.93bB2Imis溫和氣單胞菌英國(guó)1995未測(cè)9.3cB2戈氏軍團(tuán)菌19862510.53aB3L1嗜麥芽窄食單胞菌日本19821186.9

51B類β-內(nèi)酰胺酶

金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖A：CcrA（脆弱擬桿菌）B：BcⅡ（蠟樣芽胞桿菌）C：L1（嗜麥芽窄食單胞菌）園柱代表α螺旋，板片代表β片層綠色數(shù)字為His殘基，蘭灰色數(shù)字為Asp殘基，橙色數(shù)字為Cys或Ser殘基。ABCB類β-內(nèi)酰胺酶金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖ABC52獲得性金屬酶

（1）IMP型金屬酶（2）VIM型金屬酶獲得性金屬酶53β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)1．酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力學(xué)分析。2．基因分析：基因型別分類、測(cè)序、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。3．轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上；在不在整合子中。β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)54

收集菌株耐藥表型分析（紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)分析）提取酶粗制品進(jìn)行三相水解試驗(yàn)、等電聚焦電泳和酶動(dòng)力學(xué)分析根據(jù)結(jié)果判定酶的類群，選擇相應(yīng)PCR引物擴(kuò)增陽(yáng)性陰性

整合子PCR初篩

陽(yáng)性陰性

鳥(niǎo)槍法克隆可表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶基因

測(cè)定PCR產(chǎn)物序列PCR擴(kuò)增全測(cè)定全克隆片段可變區(qū)并測(cè)序序列整合子檢查提取質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)克隆并轉(zhuǎn)化到DH5α表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性陰性

鈣轉(zhuǎn)或MgCl2或電轉(zhuǎn)化

55（2）耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs（3）酶性質(zhì)分析：提取酶粗提物進(jìn)行a.三相水解試驗(yàn)。b.等電聚焦電泳。C.酶動(dòng)力學(xué)分析。（4）基因分析：a.PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物測(cè)序。b.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的β-內(nèi)酰胺酶基因。C.鳥(niǎo)槍法克隆可表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶基因，分析基因結(jié)構(gòu)。（4）轉(zhuǎn)移性分析：A。質(zhì)粒：a.質(zhì)粒接合試驗(yàn)。b.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化B。整合子：a.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定。（2）耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs56ESBLs和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)ESBLs和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)57一、ESBLs的檢測(cè)1．紙片法：表1肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株紙片法初篩和確證實(shí)驗(yàn)2．MIC法：表2肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株MIC法初篩和確證實(shí)驗(yàn)一、ESBLs的檢測(cè)1．紙片法：58驗(yàn)方法初篩試驗(yàn)表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基MHMH抗菌藥物濃度頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg頭孢他啶30μg或頭孢他啶/克拉維酸30/10μg氨曲南30μg或和頭孢噻肟30μg或頭孢噻肟30μg頭孢曲松30μg頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg（同時(shí)用多于一種抗生素可提高試驗(yàn)靈敏度）（確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述四種紙片）孵育條件同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法結(jié)果頭孢泊肟抑菌圈≤22mm有一種抗生素出現(xiàn)加有克拉維酸紙片抑菌圈≥頭孢他啶抑菌圈≤22mm沒(méi)有加克拉維酸紙片抑菌圈5mm=產(chǎn)ESBL氨曲南抑菌圈≤27mm頭孢噻肟抑菌圈≤27mm頭孢曲松抑菌圈≤25mm=可疑產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制陰性對(duì)照ATCC25922

陰性對(duì)照ATCC25922加有克拉維酸（參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)）≤沒(méi)有加克拉維酸抑菌圈2mm陽(yáng)性對(duì)照ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈9-16mm頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈頭孢他啶抑菌圈10-18mm≥頭孢他啶抑菌圈5mm氨曲南抑菌圈9-17mm頭