霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的基因組流行病學分析

霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的基因組流行病學分析霍氏腸桿菌霍夫曼亞種（Enterobacterhormaechei

subsp.

hoffmannii）是一種機會性感染病原體，屬于陰溝腸桿菌復合體（Enterobactercloacae

complex，ECC），可導致多種感染，如肺炎、尿路感染和敗血癥等［1］。近期有研究提出將其單獨作為腸桿菌屬下的種進行分類，進一步提高了其分類學地位［2］?；羰夏c桿菌霍夫曼亞種可低水平表達可誘導AmpC頭孢菌素酶，因而對青霉素和一、二代頭孢菌素具有天然抗性?；羰夏c桿菌霍夫曼亞種易獲得多種超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamase，ESBL）和碳青霉烯耐藥基因，如blaIMP-26、blaSHV-178和blaKHM-1等，導致其耐藥性增強，增加了臨床抗感染治療的難度［3,

4］。對全球臨床分離的產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌屬進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，最常見的碳青霉烯酶是VIM，其次是NDM、KPC、OXA-48和IMP，并發(fā)現(xiàn)了4個全球流行的克?。⊿T114、ST93、ST90和ST78）［5］。ST66、ST78和ST114被證明與CTX-M-15的傳播有關(guān)［6］。ECC中碳青霉烯酶的流行具有明顯的區(qū)域性特征，北美以KPC和IMI為主，歐洲和中東以O(shè)XA-48和VIM為主，而中國和東南亞則以NDM和IMP為主［1，7］。ST171是在美國流行的主要耐碳青霉烯陰溝腸桿菌（carbapenem-resistant

Enterobactercloacae，CREC）克隆，主要與blaKPC-3相關(guān)。而在ST78分離株中檢測到多種碳青霉烯酶（blaVIM-1、blaIMP-1、blaIMP-4、blaIMP-8、blaOXA-48），存在于多種不同質(zhì)粒上，包括IncHI2、IncW和IncFIB等［5，8］，說明了ST78克隆耐藥模式的復雜性和多變性。碳青霉烯耐藥質(zhì)粒在不同克隆和細菌物種間的水平轉(zhuǎn)移是碳青霉烯類耐藥基因廣泛傳播的重要原因。對攜帶碳青霉烯酶基因的質(zhì)粒進行詳細分析有助于了解耐藥基因的獲取機制，對霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的基因組流行病學調(diào)查有助于監(jiān)測其流行、進化和耐藥情況，指導臨床針對性用藥和預防措施的制定。材料與方法一、材料1.菌株來源：收集2014年8月至2021年8月中山大學附屬第一醫(yī)院分離的耐碳青霉烯陰溝腸桿菌復合體（CRECcomplex，CRECC），并將其分為重癥監(jiān)護室（intensivecareunit，ICU）組和非ICU組。同一患者多次分離的菌株只收集第一次分離的菌株?？咕幬矬w外敏感試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。接合試驗受體菌為大腸埃希菌（E.coli）J53。本研究為回顧性研究，所有臨床數(shù)據(jù)均為匿名，經(jīng)中山大學附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會批準豁免知情同意申請書（批件號：倫審［2019］483號）。

2.儀器與試劑：VITEK基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）（法國BioMerieux公司）；VeritiPCR擴增儀（美國ABI公司）；DIYY-6C水平電泳儀（北京六一儀器廠）；GS710凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；SysmexUF-1000i?自動尿液分析儀（德國Siemens公司）；M-H瓊脂（英國Oxoid公司）；PCR反應試劑盒（日本TakaRa公司）；DNA標準帶DL2000（日本TakaRa公司）；MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒（日本TakaRa公司）；IlluminaNextSeq500高通量測序儀（美國Illumina公司）。二、方法1.菌株鑒定和流行情況調(diào)查：使用VITEKMALDI-TOFMS和16SrRNASanger測序進行菌種鑒定。匿名收集CRECC感染患者的年齡、科室、性別等信息。

2.藥敏試驗：使用微量肉湯稀釋法對亞胺培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、妥布霉素，阿米卡星和復方磺胺甲唑的最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）進行檢測。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會M100-S30標準判斷藥敏試驗結(jié)果［9］。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株。

3.耐藥基因檢測：采用PCR法檢測8種β內(nèi)酰胺酶耐藥基因，分別為5種碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48和3種ESBL基因blaTEM、blaCTX、blaSHV；9種PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB和aac（6′）-Ib-cr。引物序列和反應條件參考文獻［10］。采用煮沸法提取細菌DNA模板。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，對陽性擴增產(chǎn)物進行一代測序，使用在線BLAST（https：///Blast.cgi）對測序結(jié)果進行比對。

4.接合試驗：將相同數(shù)量（1×107

CFU/ml，使用SysmexUF-1000i?自動尿液分析儀計數(shù)）的對數(shù)期供體菌C37和受體菌E.coli

J53（疊氮化鈉耐藥）在200μlLB肉湯中混合。在37℃下接合6h后，將20μl混合培養(yǎng)物涂在含有1mg/L美羅培南和100mg/L疊氮化鈉的LB瓊脂上。接合頻率為接合子數(shù)量除以供體菌數(shù)量［11］。所有試驗重復3次。并對接合子進行菌種鑒定、藥敏試驗和耐藥基因檢測。

5.全基因組測序：使用MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒提取C37菌株的基因組DNA。使用IlluminaNextSeq500高通量測序儀進行全基因組測序，測序模式為雙端測序（PE150）。使用Fastpv0.12.5過濾雙端原始讀數(shù)，使用Unicyclerv0.4.9b進行從頭組裝，并使用Prokkav1.14.6進行注釋［12,

13,

14］。耐藥基因和質(zhì)粒類型由ABRicatev0.8.13（https：///tseemann/abricate）鑒定。將攜帶碳青霉烯耐藥基因的組裝序列與文獻報道的相關(guān)序列進行比較，確定其遺傳特征，構(gòu)建示意性比較分析圖。

從NCBIassembly數(shù)據(jù)庫中下載目前公開的霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的基因組序列。使用Parsnpv1.5.6

［15］提取其核心基因組，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；赑arsnpv1.5.6提供的核心基因組單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）比對，使用rhierBAPSv1.0.1鑒定種群結(jié)構(gòu)［16］。使用PubMLST（https：///organisms）數(shù)據(jù)庫鑒定霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的MLST型別。使用GrapeTree［17］可視化MLST型別，使用geoBURST

［18］分析種群克隆復合體（clonalcomplex，CC）。

6.數(shù)據(jù)可用性：將C37菌株的基因組序列提交至NCBI的Assembly數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號（GCA_019448495.1）。將pNDM-1-C37質(zhì)粒序列提交至GenBank核酸數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號（MZ667211.1）。

7.統(tǒng)計學分析：使用SPSS19.0（IBM公司，美國）進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗對重癥監(jiān)護室（intensivecareunit，ICU）和非ICU分離的CRECC菌株的標本來源、性別分布和耐藥率進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗對ICU和非ICU分離的CRECC菌株的平均年齡進行統(tǒng)計分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果一、臨床特征本研究共收集了155株CRECC，其中ICU來源53株，非ICU來源102株。ICU分離的53株CRECC，主要來自痰（16/53，30.2%）、引流液（14/53，26.4%）和血液（5/53，9.4%）等標本，而非ICU分離的102株CRECC，主要來自尿液（23/102，22.5%）、膽汁（17/102，16.7%）和引流液（20/102，19.6%）等標本，標本來源差異有統(tǒng)計學意義（χ2=20.4，P<0.01）。ICU組平均年齡為（51.4±24.3）歲，非ICU組平均年齡為（49.1±22.5）歲，兩組平均年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=0.5，P>0.05），且ICU組和非ICU組的性別分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.4，P>0.05）。

由于臨床菌株鑒定方法學的限制，目前臨床上霍氏腸桿菌常常被鑒定為ECC。在53株ICU分離的ECC菌株中，有1株編號為C37的菌株經(jīng)16SrRNASanger測序鑒定為霍氏腸桿菌霍夫曼亞種。C37菌株分離自患者的痰標本。該患者被診斷為特重型顱腦外傷性意識障礙，并發(fā)肺部、尿路和顱內(nèi)感染，既往存在梅毒感染史，并且在該患者的痰標本中曾多次檢出銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌。C37菌株在血平板上呈現(xiàn)為光滑濕潤、中等大小的白色菌落（圖1A），革蘭染色顯示其為短桿狀革蘭陰性桿菌（圖1B）。圖1

C37菌株的形態(tài)學結(jié)果

二、藥敏試驗和耐藥基因檢測結(jié)果155株CRECC對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶和氨曲南等大部分β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率超過60%，而對阿米卡星、替加環(huán)素和多黏菌素B等抗菌藥物較為敏感，耐藥率低于10%。結(jié)果見表1。ICU分離的CRECC對亞胺培南（χ2=5.9，P<0.05）、頭孢吡肟（χ2=5.9，P<0.05）、替加環(huán)素（χ2=4.5，P<0.05）和復方磺胺甲唑（χ2=7.8，P<0.01）的耐藥率高于非ICU分離的CRECC，差異有統(tǒng)計學意義。

霍氏腸桿菌霍夫曼亞種C37菌株是多重耐藥菌株，對亞胺培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素，阿米卡星和復方磺胺甲唑均耐藥，對左氧氟沙星敏感。其攜帶多種耐藥基因，包括blaOXA-1、blaACT-5、blaNDM-1、qnrA1、aac（6′）-Ib-cr、oqxAB、fosA、dfrA15、mph（A）、ant（3′′）-Ia、ARR-3、catB3、catB4和sul1，解釋了其多重耐藥的原因。C37菌株攜帶IncX3、IncX4、IncFIB和IncFII質(zhì)粒。

三、接合試驗碳青霉烯類抗性基因blaNDM-1可以成功地從C37菌株轉(zhuǎn)移到E.coli

J53中。blaNDM-1質(zhì)粒的接合頻率為（3.4±5.6）×10-5/供體細胞。藥敏試驗結(jié)果表明接合子C37-E.coli

J53對美羅培南耐藥，并檢測到接合子C37-E.coli

J53中含有blaNDM-1。C37菌株與E.coli

J53的接合試驗結(jié)果見圖2。圖2

C37菌株與大腸埃希菌J53的接合試驗結(jié)果圖

四、blaNDM-1的遺傳特征全基因組測序結(jié)果顯示霍氏腸桿菌霍夫曼亞種C37菌株的blaNDM-1存在于IncX3質(zhì)粒pNDM-1-C37上（圖3）。對不同質(zhì)粒類型來源的blaNDM-1的遺傳特征進行比較，發(fā)現(xiàn)了一個保守的結(jié)構(gòu)5′-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-3′，在插入序列ISCR家族的幫助下，可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，而不再需要Tn125樣轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，提示blaNDM-1的傳播與5′-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-3′保守結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。圖3

來源于不同質(zhì)粒類型的blaNDM-1遺傳特征結(jié)構(gòu)示意圖

五、霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的系統(tǒng)發(fā)育樹全基因測序結(jié)果顯示C37菌株屬于ECCST78型。對目前可公開獲得的66個霍氏腸桿菌霍夫曼亞種（包括C37菌株）的基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到15個直系同源進化支?；谪惾~斯推斷的群體結(jié)構(gòu)分析（Bayesianpopulationstructureanalysis，BAPS）顯示有6個不同的群體（圖4）。66個霍氏腸桿菌霍夫曼亞種菌株分屬于12個ECC克隆復合體（圖5）。在中國流行的主要MLST型別為ST278、ST78和ST97（圖4）。ST78和ST601僅具有一個MLST等位基因的差異（singlelocusvariants，SLV），同屬于BAPS種群2和ECC克隆復合體3（CC3）。ST78型霍氏腸桿菌霍夫曼亞種已在全球多個國家分離，包括中國、美國、尼日利亞、日本、西班牙、意大利和希臘（圖4），分離時間散布在2010至2020年（圖5），提示其具有廣泛的時間和空間流行性。值得注意的是，多株ST78型霍氏腸桿菌霍夫曼亞種被識別為產(chǎn)碳青霉烯酶霍氏腸桿菌霍夫曼亞種（carbapenemase-producing

Enterobacterhormaechei

subsp.

hoffmannii，CPEHH），攜帶了多種碳青霉烯耐藥基因，包括blaKPC、blaVIM、blaIMP-8、blaOXA-48、blaNDM-1和blaKHM-1。ST78型霍氏腸桿菌霍夫曼亞種與碳青霉烯耐藥基因的傳播密切相關(guān)。圖4

霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的系統(tǒng)發(fā)育樹和耐藥基因圖譜

圖5

霍氏腸桿菌霍夫曼亞種的群體結(jié)構(gòu)圖討論ECC是臨床常見的病原體，并且是第二常見的耐碳青霉烯腸桿菌科細菌，而ECCST78型是全球多重耐藥或碳青霉烯類耐藥菌株中最常見的克隆之一［1］?；羰夏c桿菌霍夫曼亞種是常見的ECC分離株，但過去由于分類不清，對其研究相對較少［1，19］。近期有研究提出將其單獨作為腸桿菌屬下的種進行分類，進一步提高了其分類學地位［2］。最近，在ST78型霍氏腸桿菌霍夫曼亞種中檢測到了blaIMP-26和blaKHM-1等碳青霉烯基因［3,

4］，引起了人們對CPEHH的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)了1株多重耐藥CPEHH菌株C37，其攜帶了可接合轉(zhuǎn)移的碳青霉烯耐藥IncX3質(zhì)粒pNDM-1-C37。碳青霉烯類抗性基因blaNDM-1的水平傳播可對全世界的公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅。2009年，瑞典分離出攜帶blaNDM-1的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株，該菌株對除黏菌素和替加環(huán)素外的幾乎所有抗菌藥物都具有耐藥性［20］。此后，blaNDM-1很快廣泛傳播到全球多個國家，并擴散到多個細菌種屬［21］。本研究報道了1例在霍氏腸桿菌霍夫曼亞種C37菌株中攜帶blaNDM-1的IncX3質(zhì)粒。本研究的結(jié)果拓展了blaNDM-1傳播的種屬范圍。IncX3質(zhì)粒已成為傳播blaNDM-1的主要流行質(zhì)粒［22］。blast結(jié)果顯示pNDM-1-C37和在中國發(fā)現(xiàn)的blaNDM-1

IncX3陽性質(zhì)粒pNDM-HN380（GenBank登錄號：JX104760，分離自肺炎克雷伯菌）及1例blaNDM-1

IncFII-FIB陽性質(zhì)粒pKOX_NDM1（GenBank登錄號：JQ314407，分離自催產(chǎn)克雷伯菌）共享了5′-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-trpF-dsbC-cutA1-groS-groL-3′的Tn125樣轉(zhuǎn)座子的同源序列。追溯blaNDM-1的起源時，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌的染色體上攜帶了Tn125轉(zhuǎn)座子，其兩端皆含插入序列ISAba125［23］。而在腸桿菌科菌中，blaNDM-1周圍常常只含有截短的單拷貝ISAba125，截短的ISAba125序列提示質(zhì)粒上的blaNDM-1可能最初來源于鮑曼不動桿菌染色體上的blaNDM-1。分析不同質(zhì)粒類型來源的blaNDM-1周圍序列時，發(fā)現(xiàn)一個保守結(jié)構(gòu)5′-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-3′，提示這個保守結(jié)構(gòu)與blaNDM-1的傳播密切相關(guān)。2010年分離的產(chǎn)酸克雷伯菌E718含有兩個質(zhì)粒，IncA/C-IncH型質(zhì)粒pKOX-R1（GenBank登錄號：CP003684）和攜帶blaNDM-1的IncFII-FIB型質(zhì)粒pKOX_NDM1（GenBank登錄號：JQ314407）［24］。而同樣于201