腫瘤生物治療最新進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)化

●增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫；●誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；●抑制腫瘤血管的形成；●提高宿主對(duì)腫瘤常規(guī)治療的耐受力或加速損傷的恢復(fù)。

腫瘤生物治療主要策略體現(xiàn)在以下幾方面：第一頁，共六十八頁。

單克隆抗體及其偶聯(lián)技術(shù)以單抗介導(dǎo)的靶向性抗腫瘤藥物正成為腫瘤生物治療產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的熱點(diǎn)。1997年美國(guó)上市的利妥昔單抗（rituximab）為重組嵌合抗CD20單克隆抗體，用于治療淋巴瘤，標(biāo)志著單抗已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。

第二頁，共六十八頁。第三頁，共六十八頁?？贵w藥物銷售趨勢(shì)圖第四頁，共六十八頁。TypeProductMarketerApprovedChimericRituxanNon-Hodgkin'slymphoma

Genentech

November1997

ChimericSimulectOrganrejectionprophylaxis

NovartisMay1998ChimericRemicadeRheumatoidarthritis,Crohn'sdiseaseohnson&JohnsonAugust1998CDR-graftedZenapax

OrganrejectionprophylaxisRocheDecember1997CDR-graftedSynagis

RespiratorysyncytialvirusMedimmuneJune1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedHerceptin

MetastaticbreastcancerGenentechSeptember1998CDR-graftedMylotarg

AcutemyeloidleukemiaAmericanHomeProductsMay2000MonoclonalAntibodiesontheMarket

第五頁，共六十八頁。TypeProductMarketerApprovedMurine

RadiolabeledZevalin

Non-Hodgkin'sLymphomaIDECPharmaceuticalsandScheringAGMarch2002PhageDisplayHumira

RheumatoidarthritisAbbottLaboratoriesDecember2002CDR-graftedXolair

ModeratetoseverepersistentasthmaGenentechandNovartisJune2003Murine

RadiolabeledBexxar

CD20positive,follicular,Non-Hodgkin'sLymphomaCorixaandGlaxoSmithKlineJune2003CDR-graftedRaptiva

Chronicmoderate-to-severepsoriasisGenentechandXomaOctober2003ChimericErbitux

ColorectalcancerImcloneandBristol-MyersSquibbFebruary2004CDR-grafted

Avastin（Bevacizumab）colonandrectumcancer

GenentechFebruary2004MonoclonalAntibodiesontheMarket

第六頁，共六十八頁。●2003年治療用單抗的銷售總額已超過52億美元?！?006年預(yù)計(jì)50~60個(gè)治療性單抗上市?！?010年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元?！衩绹?guó)已占全球單抗市場(chǎng)90%—一支獨(dú)秀?！裢耆嗽椿瘑慰宫F(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段。第七頁，共六十八頁。抗單抗藥物兩大類抗腫瘤單抗拮抗血管生成單抗—Avastin（2004年）抗腫瘤單抗偶聯(lián)物抗生素與單抗偶聯(lián)—Mylolarg（2001年）性單抗—Zevalin（2002年）第八頁，共六十八頁。內(nèi)皮因子（Endoglin）：膜結(jié)合性糖蛋白；分子量180KD；腫瘤組織邊緣血管，尤其是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)。近年來單抗藥物研究具有以下特點(diǎn)：

第一、尋找新的分子靶點(diǎn)第九頁，共六十八頁。內(nèi)皮因子Endoglin（又稱CD105）作為生成血管內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物，正成為抑制腫瘤血管生成、治療腫瘤的重要靶分子；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：抗CD105單抗與免疫毒素連接，可使腫瘤完全消失，現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。多種內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單抗也顯示了較好的實(shí)驗(yàn)效果，如人抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）現(xiàn)已進(jìn)入了人體臨床試驗(yàn)。第十頁，共六十八頁。

目前人源化單抗的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)已較為成熟。

?轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人源化單抗（1997年）；

?核糖體展示技術(shù)（1999年）;?噬菌體表達(dá)系統(tǒng)；

第二、抗體的人源化第十一頁，共六十八頁。轉(zhuǎn)基因小鼠：

?滅活小鼠Ig基因；

?克隆并完整轉(zhuǎn)入全部或大部分人Ig基因座，并在小鼠體內(nèi)表達(dá)；

?產(chǎn)生單抗具有“鼠糖基化模式”；

?操作程序復(fù)雜。第十二頁，共六十八頁。核糖體展示(ribosomedisplay)

核糖體展示技術(shù)的核心是利用體外核糖體表達(dá)載體構(gòu)建scFv抗體庫,并于體外轉(zhuǎn)錄為mRNA,體外翻譯表達(dá),隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體-mRNA-scFv復(fù)合物中的高親和力scFv。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中不用任何細(xì)胞,是第一個(gè)完全在體外篩選有功能蛋白的方法。第十三頁，共六十八頁。

該技術(shù)克服了其他一些蛋白質(zhì)篩選技術(shù)(如噬菌體展示)需轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真核細(xì)胞,因效率不高而降低庫容,減少抗體多樣性的局限,并避免了宿主隨細(xì)胞基因組復(fù)制過程中可能丟失而產(chǎn)生的庫容下降,同時(shí)亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細(xì)胞生存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點(diǎn),大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期,具有省時(shí)省力、方便快速的特點(diǎn)。第十四頁，共六十八頁。噬菌體抗體庫原理：采用RT—PCR技術(shù)將全套人抗體重鏈V區(qū)基因克隆出來，在噬菌體表面以抗體—外殼融合蛋白的形式表達(dá)分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。該技術(shù)不經(jīng)過繁雜的雜交瘤途徑，即可獲得全人源化抗體。從理論上講該抗體庫可篩選出任何一種單抗。第十五頁，共六十八頁。噬菌體抗體庫

與傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)相比有極大的優(yōu)越性，現(xiàn)正取代雜交瘤技術(shù)。主要特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，采用經(jīng)典的PCR分子克隆等技術(shù)，即可操作；在短期內(nèi)（數(shù)周）可篩選106~108個(gè)克隆；篩選獲得的抗體庫抗體可用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，無需組織培養(yǎng)，極大降低了成本；制備的抗體通常為Fab片段或ScFv抗體，沒有Fc段，親和力有一定影響（某些腫瘤治療性單抗親和力太強(qiáng)反而不好），但如果對(duì)某些抗體基因進(jìn)行改構(gòu)，同樣可獲得親和力強(qiáng)的抗體。第十六頁，共六十八頁。第三、偶聯(lián)物分子的小型化研制小型化單抗藥物對(duì)提高藥物療效有重要意義，通過酶切方法獲得的Fab片斷，其分子量相當(dāng)于完整單抗的1/3，而通過基因工程技術(shù)制備的單鏈單抗ScFv，相當(dāng)于完整單抗的1/6。例如單抗Fab片段與平陽霉素構(gòu)成的偶聯(lián)物有顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。第十七頁，共六十八頁。近年發(fā)現(xiàn)抗腫瘤抗生素Calicheamicin對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性比阿霉素強(qiáng)1000倍。Calicheamicin與單抗構(gòu)成的偶聯(lián)物對(duì)多種腫瘤有良好療效；2000年美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療免疫髓性白血病的Mylotarg就是單抗與Calicheamicin的偶聯(lián)物。第四、單抗藥物的高效化第十八頁，共六十八頁。第五、雙特異性抗體以激活宿主效應(yīng)細(xì)胞雙特異性抗體的理想目標(biāo)是當(dāng)細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞時(shí)增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的腫瘤殺傷功能，是改善抗體治療效果的又一發(fā)展方向。該抗體的特異性一方面是針對(duì)腫瘤細(xì)胞，另一方面是針對(duì)宿主細(xì)胞上的某些受體。理論上，使用雙特異性抗體可征募眾多效應(yīng)細(xì)胞。第十九頁，共六十八頁。第六、改變某些氨基酸以增加單抗的親和力定向誘變可變區(qū)的特定氨基酸，可以提高抗體的親和力，這可通過分子遺傳手段結(jié)合噬菌體展示文庫來實(shí)現(xiàn)。先創(chuàng)建一個(gè)突變體文庫，分離對(duì)特定抗原具有最高親和力的噬菌體。這種方法一般需耗時(shí)4~6個(gè)月，抗體的親和力可提高約50倍左右。當(dāng)然抗體親和力太高，抗體易聚體在腫瘤組織外周，反而影響活性。

第二十頁，共六十八頁。第七、抗體導(dǎo)向的酶活化前體藥物技術(shù)前體藥物（Pro—drug）是指該藥物無治療活性或僅有較低活性，需在體內(nèi)經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為活性型才可顯示藥物活性；其優(yōu)點(diǎn)是可降低毒性和延長(zhǎng)藥物體內(nèi)的作用時(shí)間。在單抗治療中運(yùn)用此策略是將單抗與特定的酶進(jìn)行連接，先注入單抗一酶偶聯(lián)物，間隔一定時(shí)間后再注入前體藥物，使其在靶部位活化以殺傷腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)已有單抗堿性—磷酸酶偶聯(lián)物合并磷酸絲裂霉素，單抗—胞嘧啶脫氨酶偶聯(lián)物合并5—Fu；在臨床試驗(yàn)中取得了較好效果。

第二十一頁，共六十八頁。盡管美國(guó)在治療性單抗的研究方面處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；但大多數(shù)單克隆抗體藥物的靶標(biāo)沒有專利保護(hù)或者專利保護(hù)已過期。更為重要的是，單抗藥物的研發(fā)具有自己的特點(diǎn)，即眾多公司可以針對(duì)同一靶標(biāo)研究單抗藥物，它可以根據(jù)同一靶標(biāo)的不同抗體表位研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物而又不侵犯別人專利，這一點(diǎn)也會(huì)被我國(guó)SFDA認(rèn)證為新藥，因此治療性單抗在我國(guó)其有廣闊的應(yīng)用前景。第二十二頁，共六十八頁。腫瘤治療性疫苗具有良好前景，目前研究主要集中在：對(duì)腫瘤免疫原的研究，包括尋找新的腫瘤特異性抗原，以及利用基因工程方法制備或改構(gòu)某些腫瘤抗原。以達(dá)到激活免疫效應(yīng)細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞因子作為疫苗佐劑可明顯增加疫苗的治療效果，如：GM—CSF、CD40L作佐劑，可活化CTL細(xì)胞。第二十三頁，共六十八頁。腫瘤治療性疫苗樹突狀細(xì)胞（DC）在腫瘤疫苗誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此用抗原改敏的DC治療腫瘤被認(rèn)為最具有發(fā)展前景?；蚬こ虂唵挝灰呙纭⒖乖砦坏倪x擇是新型腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。腫瘤疫苗主要以誘導(dǎo)細(xì)胞（Ci）為主；因此T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析在疫苗設(shè)計(jì)中顯得尤為重要。第二十四頁，共六十八頁。腫瘤治療性疫苗腫瘤的異質(zhì)性及腫瘤抗原的多樣性，使相關(guān)抗原的特異性不高，免疫原性不強(qiáng)；用免疫缺陷的裸鼠建立的異體人類腫瘤模型用于腫瘤藥物篩選（包括疫苗）。第二十五頁，共六十八頁。DC疫苗腫瘤抗原肽或蛋白體外致敏DC可產(chǎn)生保護(hù)性抗腫瘤T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，并引起腫瘤消退，如PSM—P2肽致敏DC用于37例前列腺癌治療，30%明顯好轉(zhuǎn)。?細(xì)胞溶解物致敏DC由于腫瘤抗原不清，采用全血細(xì)胞溶解物致敏DC，可以誘發(fā)廣泛的T細(xì)胞反應(yīng)。此法最大的缺點(diǎn)是：細(xì)胞提取物中含有自身抗原，可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。第二十六頁，共六十八頁。DC疫苗DC與腫瘤細(xì)胞融合采用電穿孔法將DC與腫瘤細(xì)胞融合，保留了DC的生物學(xué)特征，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)該腫瘤的細(xì)胞毒性作用。目前該方法用于個(gè)體化治療，將腫瘤病人的腫瘤細(xì)胞與臍血干細(xì)胞來源的DC融合后回輸給腫瘤病人體內(nèi)，具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，臨床有效率可達(dá)70%以上。第二十七頁，共六十八頁。DC疫苗細(xì)胞因子基因或腫瘤抗原基因修飾DC如將IL—18、IL—12基因轉(zhuǎn)染DC，可明顯增加特異性T細(xì)胞數(shù)量。用腫瘤相關(guān)抗原（TAA）基因修飾DC，導(dǎo)致T細(xì)胞活化，其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)效果優(yōu)于抗原肽致敏的DC疫苗。第二十八頁，共六十八頁。DC疫苗DC永生化技術(shù)

目前DC回輸療法已經(jīng)試用于臨床，并取得了其它方法無可比擬的療效，在國(guó)外正用于各種腫瘤，但作為治療手段有一重要難題——如何大量擴(kuò)增及保存DC。DC永生化技術(shù):轉(zhuǎn)染癌基因——myc基因轉(zhuǎn)染病毒基因——HPVE7基因第二十九頁，共六十八頁。腫瘤治療性疫苗●上市產(chǎn)品：黑色素疫苗（Corixa公司，加拿大）。

●臨床Ⅲ期：IMC—BEC2（Imclone公司），用于肺癌。

●臨床Ⅰ期：HER/Neu基因蛋白疫苗（Corixa公司），用于乳腺癌（2003年6月）；質(zhì)粒DNA疫苗（Corixa公司），用于肺癌。第三十頁，共六十八頁。

目前腫瘤治療性疫苗還有諸多問題有待于解決，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：第一，眾多實(shí)體腫瘤缺乏特異性抗原，盡管目前已在實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了500多種腫瘤抗原，但只有少數(shù)抗原較為特異，且這些抗原免疫原性較弱。在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)：僅激活CD8+T細(xì)胞不足以產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫，同時(shí)需要CD4+T細(xì)胞參與。而目前的疫苗缺乏這種設(shè)計(jì)。

第三十一頁，共六十八頁。第二、疫苗缺乏有效的抗原遞呈?，F(xiàn)有的疫苗在此環(huán)節(jié)上存在兩個(gè)嚴(yán)重問題：一是進(jìn)入的大部分疫苗與APC不能充分接觸難以實(shí)現(xiàn)抗原遞呈；二是即使有少量疫苗被APC捕獲，也因抗原表達(dá)量甚微難以發(fā)揮有效的抗原遞呈。

第三十二頁，共六十八頁。第三、如何打破機(jī)體免疫耐受。腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)Fas的表達(dá)來逃避Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。盡管目前通過采用共刺激分子修飾的疫苗有可能打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第三十三頁，共六十八頁。新的腫瘤靶基因針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的靶向治療（又稱分子靶藥物）是提高腫瘤治療效果的重要途徑。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤新靶基因被不斷發(fā)現(xiàn)。生存素（Survivin）是近年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子；阻斷生存素的活化（如采用反義核酸技術(shù)），可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。第三十四頁，共六十八頁。新的腫瘤靶基因2002年美國(guó)科學(xué)家在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、多種人類腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種大量存在于細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)（nucleostemin）及其基因，該基因位于人類3號(hào)染色體，表達(dá)550個(gè)氨基酸；目前眾多的科學(xué)家一致認(rèn)為該基因亦是某些腫瘤治療的又一靶基因。

第三十五頁，共六十八頁。

※綜上所述，疫苗、細(xì)胞因子、腫瘤血管生成抑制劑及單克隆抗體已成為腫瘤治療的有效方法。它們均涉及到生物醫(yī)藥的重要領(lǐng)域——蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)，這正是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的關(guān)鍵所在?！?/p>

我國(guó)目前生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化最大難點(diǎn)。第三十六頁，共六十八頁。蛋白表達(dá)載體

?原核——大腸桿菌表達(dá)體系

?真核——a酵母b哺乳動(dòng)物細(xì)胞—CHO細(xì)胞c昆蟲第三十七頁，共六十八頁。

大腸桿菌表達(dá)是目前最成熟的表達(dá)體系。具有操作簡(jiǎn)單、成本低產(chǎn)量高（表達(dá)量10%~70%）。缺點(diǎn)：a、大多以包涵體形式出現(xiàn)（盡管設(shè)計(jì)成分泌型）b、產(chǎn)物缺乏糖基化c、含有大量?jī)?nèi)毒素，給純化帶來極大不方便第三十八頁，共六十八頁。?酵母是外源基因表達(dá)最理想的真核表達(dá)體系它具有許多優(yōu)點(diǎn)：?遺傳背景清楚

?具有翻譯后修飾加工系統(tǒng)，如糖基化?不產(chǎn)生毒素，不含特異性的病毒?大規(guī)模發(fā)酵簡(jiǎn)單，成本低?表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，有利于純化

?表達(dá)量可達(dá)菌體蛋白10%~30%第三十九頁，共六十八頁。蛋白質(zhì)表達(dá)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改構(gòu)（改變或不改變氨基酸）

增加生物活性或（和）減毒改變與某些物質(zhì)的親和力增加在體內(nèi)的半衰期增加在表達(dá)體系的表達(dá)量（原核或真核表達(dá)）第四十頁，共六十八頁。?增加生物活性或（和）減輕毒性反應(yīng)腫瘤的治療，主要是增加細(xì)胞免疫功能。如CEA腫瘤病人體內(nèi)的CEA是抑制患者細(xì)胞免疫功能的蛋白。但如果對(duì)CEA的某些氨基酸改構(gòu)可以明顯增加活化T細(xì)胞的功能。第四十一頁，共六十八頁。?增加生物活性或（和）減輕毒性反應(yīng)人TNFα突變體較原型TNFαN端缺失7個(gè)氨基酸第8位脯氨酸精氨酸第9位脯氨酸賴氨酸第10位脯氨酸精氨酸其生物學(xué)活性提高數(shù)百倍，毒性減少幾十倍。第四十二頁，共六十八頁。生長(zhǎng)因子受體Ⅲ（EGFRⅢ）的突變株（EGFRVⅢ）第2~7外顯子中801堿基被去除（胞外區(qū)6~273位氨基酸缺失），而在融合部位新產(chǎn)生一個(gè)甘氨酸。這種缺失融合僅在使腫瘤細(xì)胞檢測(cè)到EGFRⅢ。因此EGFRVⅢ單抗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)僅能結(jié)合EGFRⅢ陽性的腫瘤細(xì)胞，其特異性較好。第四十三頁，共六十八頁。?改變與某些物質(zhì)的親和力1L—18是1995年發(fā)現(xiàn)的新細(xì)胞因子，在結(jié)構(gòu)和功能上與IL—12相似。1L—18的前體蛋白（Pro-1L-18）為193個(gè)氨基酸，24KD。無生物學(xué)活性，成熟的1L-18為153個(gè)氨基酸，18KD，并以單體形式表現(xiàn)生物學(xué)活性，具有抗腫瘤及抗病毒活性。目前的實(shí)驗(yàn)表明，1L-18有極強(qiáng)的抗腫瘤作用，并由CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的。第四十四頁，共六十八頁。1L—18有兩種拮抗劑1L—18受體（1L—18R）可溶性1L—18結(jié)合蛋白（1L—18BP）1L—18與1L—18受體的結(jié)合力要明顯低于其它細(xì)胞因子與受體的結(jié)合力。1L—18與1L—18R結(jié)合蛋白的解離常數(shù)（KD）為18.5nmol/L。而其它細(xì)胞因子一般為45nmol/L左右，1L—18BP能消除1L—18消殺的生物學(xué)活性反應(yīng)，1L—18BP這1L—18的主要拮抗劑，維持1L—18在體內(nèi)的活性水平。第四十五頁，共六十八頁。1L—18BP某些腫瘤組織可持續(xù)分泌查溶性1L—18BP，從而明顯降低血清中1L—18的水平。如果單純采用1L—18治療腫瘤病人，1L—18BP含大量中和1L—18而達(dá)不到治療效果。如果將1L—18未點(diǎn)突變（1L—18突變株），而維持或增加1L—18的生物學(xué)活性而這種1L—18突變體與1L—18BP的結(jié)合力大為降低，即可達(dá)到“一石二鳥”的作用。第四十六頁，共六十八頁。?增加在體內(nèi)的半衰期

黑色素瘤相關(guān)的抗原MART—1肽表位氨基酸進(jìn)行置換，該抗原刺激靶CTL活性在3h內(nèi)失活，而原抗原的半衰期僅22秒。第四十七頁，共六十八頁。單鏈抗體（SCFV）

是抗體可變區(qū)的重鏈和輕鏈通過連接肽（約20aa左右）相連的融合蛋白。具有：?分子量小，可迅速滲透到腫瘤內(nèi)部或其它靶組織；

?避免了FC段引起的非特異性細(xì)胞毒性及負(fù)段原性；

?制備工藝簡(jiǎn)單。第四十八頁，共六十八頁。盡管ScFv在腫瘤生物治療中具有極其廣泛的應(yīng)用前景，但在臨床中仍存在幾個(gè)主要問題：?缺乏Fc段，親和力大多下降?半衰期短，很快從血液清除?穩(wěn)定性不夠第四十九頁，共六十八頁。

ScFv基因改構(gòu)——ScFv與人IgG1Fc段連接成融合蛋白，改構(gòu)后ScFv半衰期延長(zhǎng)30倍，生物活性沒有下降。在ScFv輕鏈和重鏈的可變性適當(dāng)各加入一個(gè)半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fc段而構(gòu)成DsFv，證實(shí)DsFv結(jié)合能力與穩(wěn)定性均優(yōu)于ScFv第五十頁，共六十八頁。蛋白純化不同的治療目的對(duì)不同載體表達(dá)蛋白的純度要求不一樣。如腫瘤疫苗

原核表達(dá)>95%真核表達(dá)>98%第五十一頁，共六十八頁。?雙水相萃取技術(shù)

方法：向水相中加入溶入水的高分子大化合物—PEG等，可形成密度不同的兩相。因兩相均含有水，稱為雙水相。輕相——含某種高分子化合物重相——含鹽類或一種化合物體系：PEG/鹽（硫酸銨等）；PEG/葡聚糖。第五十二頁，共六十八頁。雙水相萃取技術(shù)從實(shí)用角度來講，細(xì)胞碎片分配在下相適宜。?核酸等大部分雜質(zhì)一般在下相，可以同時(shí)除去?下相為無機(jī)鹽，去除成本低?蛋白質(zhì)位于上相有利保護(hù)活性（PEG保護(hù)），而下相的高濃度鹽會(huì)造成蛋白失活。第五十三頁，共六十八頁。

第五十四頁，共六十八頁。?雙水相萃取技術(shù)特點(diǎn)?清除細(xì)胞碎片的效率優(yōu)于一般的離心法和過濾法；?該方法關(guān)鍵是把蛋白產(chǎn)物層盡可能分在上層，而細(xì)胞碎片分在下層；?分離的純度與色譜層析還有一定的距離。因此該技術(shù)用于初步純化。第五十五頁，共六十八頁。?高效疏水色譜（HIC）原理：在高離子強(qiáng)度的鹽水溶液淋洗條件下，蛋白質(zhì)的疏水部分與填料表面的疏水基團(tuán)相互作用而被吸附。淋洗液的離子強(qiáng)度降低，蛋白質(zhì)依疏水性特征依次被洗脫。即高鹽濃度吸附，低鹽濃度洗脫。第五十六頁，共六十八頁。?HIC的特征

?對(duì)基質(zhì)沒有特殊要求，基質(zhì)表面具有較弱的疏水基團(tuán)，孔徑在25~100um

?避免使用了大量有機(jī)溶劑的淋洗，有效保護(hù)了被分離物質(zhì)的生物活性。

?具有“一石四鳥”的作用，尤其是純化大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物時(shí)具有除去變性劑（鹽酸胍）、使蛋白質(zhì)折疊（復(fù)性）去除雜蛋白，便于變性劑回收。第五十七頁，共六十八頁。HIC：?采用高鹽時(shí)上樣、低鹽時(shí)洗脫。故大多在硫酸銨沉淀或離子交換層析后使用。?洗脫條件溫和----降低鹽濃度?調(diào)整溶液的pH可調(diào)整該蛋白的疏水性，因?yàn)榈鞍自诮咏入婞c(diǎn)時(shí)具有最大的疏水性。第五十八頁，共六十八頁。HIC疏水柱經(jīng)過再生后，通?？墒褂?0~30次；具有高蛋白質(zhì)的結(jié)合容量（10~100mgml）；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高；產(chǎn)業(yè)化程度極高，目前正廣泛用于生物制藥。第五十九頁，